Abstract
Resistensbestämning (AST) utförs för att bedöma aktiviteten av antimikrobiella medel mot olika bakterier in vitro. AST resultat som uttrycks som minsta hämmande koncentrationer (MIC) används i forskning för antimikrobiella utveckling och uppföljning av resistensutveckling och i den kliniska inställningen för antimikrobiell behandling vägledning. Dalbavancin är ett halvsyntetiskt lipoglycopeptide antimikrobiellt medel som godkändes i maj 2014 med Food and Drug Administration (FDA) för behandling av akut bakteriell hud och hud struktur infektioner orsakade av grampositiva organismer. Fördelen med dalbavancin jämfört med nuvarande anti-stafylokock-behandlingar är dess långa halveringstid, vilket gör det möjligt för en gångs skull i veckan dosering. Dalbavancin har aktivitet mot Staphylococcus aureus (innefattande både meticillinkänsliga S.aureus [MSSA] och meticillinresistenta S. aureus [MRSA]), koagulasnegativa stafylokocker,
Introduction
Dalbavancin är ett semisyntetiskt lipoglycopeptide som godkändes av FDA maj 2014 för behandling av akut bakteriell hud och hud struktur infektioner orsakade av grampositiva organismer 1. Det primära målet med detaljer denna metod i ett videoformat är att ge tydlig vägledning till de kliniska laboratorier och forskare för testning och rapportering av noggranna och reproducerbara dalbavancin känslighets resultat.
Fastställandet av ett antimikrobiellt medel MIC av kommersiella metoder rutinmässigt i kliniska laboratorier för bedömning av en agents in vitro aktivitet mot patogena bakterier. Den metod som beskrivs här är buljong mikroutspädningsmetoden som rekommenderas av CLSI och ISO 2,3,4. Sedan dalbavancin kommersiella känslighetsmetoderna är inte tillgängliga (vid tidpunkten för denna skrift) och disk diffusion och agar utspädningsmetoder är för närvarande inte rekommenderas feller dalbavancin, referens buljong utspädningsmetoder är de nuvarande alternativen 12,14. Eftersom denna referensmetod är inte en kommersiell och FDA rensas diagnostisk metod in vitro, kliniska laboratorier i USA som använder denna procedur för patienttestning måste följa lagstadgade kraven för ett laboratorium utvecklat test (LDT). Det förväntas att när dalbavancin användningen ökar kommer flera laboratorier har ett behov att testa denna förening. Vankomycin testning såsom ett surrogat för bestämning av dalbavancin mottagligheten hos S. aureus har validerats 5. Emellertid kan dalbavancin vara aktiva mot vankomycin mellanliggande S. aureus (VISA) och kan därför läkare begära dalbavancin MIC resultat. Dessutom kan MIC resultat för andra bakteriearter begäras.
FDA känsliga brytpunkt för dalbavancin mot S. aureus har fastställts till ≤0.12 pg / ml. FDA tilldelas endast en susceptible kategori på grund av bristen på data om resistenta isolat. Den normala MIC fördelningen mellan vildtyp S. aureus isolat är mellan 0,03-0,12 pg / ml, med en tydlig modal MIC på 0,06 mikrogram / ml. En liten variation i MIC resultat på grund av metod skillnad, förutom den inneboende BMD variation på ± en spädning, skulle kunna ha en betydande inverkan på resistenspriser. 6 I likhet med andra lipoglycopeptide medel kan dalbavancin resistensbestämning vara en utmaning som ett resultat av lösligheten och den relativt stora storleken av molekylen och dess bindningsegenskaper 7,8,9. Referens BMD metod som beskrivs här omfattar två specifika åtgärder som är unika för olösliga medel och / eller lipoglycopeptide medel: (1) användning av DMSO för beredning av stamlösningar och (2) tillsats av 0,002% P-80 i den slutliga MIC panelen utspädningar. Syftet med den här videon publikation är att ge klarhet i dalbavancin BMD metoden och specifically fokusera på dessa viktiga steg för att säkerställa noggranna och reproducerbara MIC resultat.
Protocol
Obs: Se CLSI dokument M7-A10 och M100-S25 och / eller ISO / FDIS 20776-1 för fullständiga uppgifter om referensbuljongmikroutspädningsmetod för antimikrobiell känslighet 2, 3, 4 Referensmetoderna möjliggör alternativ i en del av. förfaranden som är specifika för beredning av inokulat och MIC panel produktionslinje för att uppnå samma slutresultat. Förfarandet beskrivs här avser ett antimikrobiellt medel, dalbavancin, och en del av stegen representerar ett potentiellt flera sätt anger standardmetoden kan göras. Lämpliga säkerhetsåtgärder (i enlighet med skyddsnivå 2) bör användas 10. MIC panelformat som används för ändamålet av denna video publikation visas i tabell 1.
1. Store Dalbavancin Powder
- Vid mottagandet av diagnostisk kvalitet dalbavancin pulver, förvara vid -20 ° C i en torkad omgivning i en icke-upptining frys. Före användning bör pulvret jämvikt tillnå RT före öppnandet.
2. Förbered MIC Panel Späd
- Bered en stamlösning inte är högre än 1600 mikrogram / ml dalbavancin i ren (ren) DMSO i sterila glas- eller plaströr, och användning på samma dag för att förbereda eller förvara vid -20 till -60 ° C eller lägre för framtida användning i en icke-upptining frys. Ta hänsyn till styrkan av dalbavancin enligt den dokumentation som mottagits med pulvret, vid vägning pulvret (se ekvation 1 t ex 800 mikrogram / ml mäldberedningen).
- Späd förrådsspädning som liknar det system som visas i kolumn 1 ("Source koncentration") i tabell 2 med ren DMSO i sterila glas- eller plaströr. Använd en pipett för att mäta utspädningsmedel och en annan pipett för att lägga den första dalbavancin lager till det första röret. För varje efterföljande dalbavancin förrådskoncentration använda en ny pipett.
- Förbered 100X slutlig MIC panel concentransonerings utspädningar (mellanliggande koncentrationer) med ren DMSO. Såsom visas i kolumnerna 2-4 i tabell 2, kombinera lämpliga volymer av källan och DMSO för att uppnå önskade mellankoncentrations (volymer som skall användas kommer att bero på antalet MIC paneler som skall göras).
- Förbered 0,004% P80: Bered en färsk arbetsstamlösning av 2% P80 genom att tillsätta 0,1 ml P80 till 4,9 ml dH 2 O. Sterilisera genom passage genom ett 0,22 mikron filter och använda lösningen på samma dag av förberedelser. Bered 0,004% P80 utspädningsmedel genom att göra en 1: 500 spädning av 2% P80 (t.ex., 0,3 ml 2% P80 till 149,7 ml CAMHB).
- Ytterligare späda de mellanliggande koncentrationer som framställts i Steg 2,2 1: 100 i katjon justerad Mueller Hinton-buljong (CAMHB) kompletterad med 0,004% (volym / volym) polysorbat-80 (P-80) P-80 och / eller LHB (för streptokocker) sattes till dubbla slutliga koncentrationen eftersom tillsats av inokulum (steg 4,3) kommer att resultera i en 1: 2 utspädning. Se kolumnerna 6 och 7 i tabell 2
3. Förbered MIC paneler
- Fördela 50 fil av varje dalbavancin lösning som framställts i steg 2,3 i lämpliga brunnar i MIC panelen och inkludera media endast i en brunn (tillväxtkontroll väl). En flerkanalig pipett med sterila tips kan användas för detta steg.
- Använd panelerna omedelbart eller försegla med plastfilm, plats i plastpåsar och omedelbart placera i en icke-avfrostning frys vid ≤-20 ° C (företrädesvis vid ≤-60 ° C) tills det behövs. Om frysta paneler används, ta bort sälar och placera enskilda paneler på lab bänk för 15-30 minuter (tills väl innehållet tinas) innan du fortsätter med panel ympning.
4. Inokulera MIC paneler, Utför renhet och inställning Colony Räkna
- Välj flera väl isolerade kolonier från en 18-24 h blodagar eller annan icke-selektiv agarplatta. Peka på toppen av varje koloni med en steril ögla eller stuss och överföring till 1-5 ml CAMHB eller saline tills grumlighet är ekvivalent med en 0,5 McFarland-standard. Bedöm grumlighet genom visuell jämförelse med 0,5 McFarland eller med en fotometrisk anordning.
- Inom 15-30 minuter efter framställningen, späd inokulatet 1: 100 i CAMHB (100 pl till 10 ml CAMHB). För de flesta bakterier som testades mot dalbavancin, med undantag för S. pneumoniae, kommer denna späd tillhandahålla en slutlig brunn koncentration av 5 x 10 5 CFU / ml (acceptabla området är 2-8 x 10 5 CFU / ml). För S. pneumoniae, är bakteriell koncentration baserad på jämförelse av grumlighet till en 0,5 McFarland vanligtvis betydligt mindre, därför, späd inokulatet 1:25 (400 ^ i 10 ml CAMHB + 10% + LHB).
- Inom 15 min efter beredning av inokulat, överföra 50 | il av den slutliga inokulatet i varje brunn (med undantag av den sterilitetskontrollbrunnen) av MIC panel som tillverkats i steg 3. En flerkanalig pipett med användning av sterila spetsar kan användas för detta steg.
- Utför en renhetskontrollgenom att överföra och sprida en 1-10 il portion från den positiva tillväxten kontrollbrunnen med en steril slinga för att en icke-selektiva agar (t.ex. tryptikas soja agar med 5% fårblod).
- Inställnings antalet mikroorganismer genom att avlägsna 10 ni från tillväxtkontrollbrunnen med en enda kanal pipett och steril spets och överföring till 10 ml saltlösning (1: 1000 utspädning). Blanda och överför 100 pl med en enda kanal pipett och steril spets till en lämplig, icke-selektivt agarmedium (t.ex. tryptikas soja agar med 5% fårblod) och spridda över hela agarytan med en steril ögla, upprepa två gånger i olika riktningar för att säkerställa jämn fördelning av inokulatet (1:10 utspädning).
5. Inkubera MIC Paneler, greve kolonin och renhet Plattor
- Försegla varje MIC panel eller stapel av högst 4 paneler i en plastpåse, med plasttejp eller med en tättslutande plasthölje före inkubering. Alternativt, placera tom MIC panel på top av stapel av högst 4 MIC paneler, placera en fuktig pappershandduk i en plastbehållare, plats MIC paneler i plastbehållaren och nära behållare ordentligt med lock.
- Inkubera MIC paneler i en omgivande luft-inkubator vid 35 ° C ± 2 ° C under 16-20 h (stafylokocker och enterokocker) och 20-24 h (streptokocker) inom 30 min av ympning. Inkubera mikroorganismer och renhetsskivor under samma betingelser förutom inkubatet streptokocker i en 5% CO2 inkubator.
6. Läs MIC och Colony Räkna Plates; Kontrollera renhet tavla
- Läs MIC som den lägsta koncentrationen som fullständigt inhiberar bakterietillväxt i brunnarna som detekteras med blotta ögat.
- Räkna kolonier på mikroorganismer plattan. Multiplicera varje koloni med utspädningsfaktorn (1: 10.000) (t.ex. motsvarar 5 x 10 5 CFU / ml 50 kolonier). Ett acceptabelt intervall är 20-80 kolonier (2-8 x 10 5 CFU / ml) och används som en lämpximate riktlinje.
- Kontrollera renhet plattan. Om alla kolonier liknar de samhällen som används i steg 4,1, då inokulatet kan anses ren. Om det finns några andra kolonier närvarande, då finns det risk för en förorening att vara närvarande i MIC panelen och testet bör upprepas.
7. Kontrollera Kvalitetskontrollresultat.
- Se tabell 3 för förväntade intervall av CLSI kvalitetskontrollstammar. Endast redovisa resultat av testet isolat om dalbavancin MIC resultat för kvalitetskontroll organism (s) är inom det förväntade intervallet.
- Om en MIC av ≥0.25 pg / ml uppnås för någon klinisk S. aureus isolat, upprepa dalbavancin MIC testning och / eller skicka till ett referenslaboratorium för verifiering.
Representative Results
Standardiserade MIC metoder är nödvändiga för att övervaka resistensutveckling, ett viktigt mål för olika antimikrobiella övervakningsprogram. Dalbavancin MIC resultat isolat samlats i Europa och USA under 2011-2013 var <0,25 mikrogram / ml för 99,9% av S. aureus och 100% av streptokocker (tabell 4).
För att bedöma vikten av att använda färska (förseglad) DMSO, tre exemplar testning av dalbavancin BMD MIC för QC stammar S. aureus ATCC 29.213, och E. faecalis ATCC 29212 och duplicera testning för S. pneumoniae ATCC 49619 utfördes med användning av (1) DMSO från förseglade ampuller, (2) DMSO från en 1 L flaska som var i utgångsdatum och hade använts tidigare i 2 år och (3) en delmängd av DMSO från samma 1 L flaska (prov 2) som fick stå i en öppen bägare under 72 timmar före användning. Dalbavancin MIC resultat med paneler tillverkade med alla tre DMSO prover liknade och wnom de godtagbara QC områden (tabell 5).
Förlusten av dalbavancin aktivitet efter exponering av stamlösningen till plast och utan tillsats av P-80 har väl dokumenterat 7. I 2 ytterligare studier, tillägg av P-80 första och mellanliggande stamlösningar (tabell 6) och användningen av glas- eller plaströr för framställning av de initiala och mellanliggande stamlösningar (tabell 7) inte har någon effekt på de dalbavancin MIC resultat. Det fanns inte heller någon effekt på dalbavancin MIC resultat när polypropylen och polystyren plattor från tre tillverkare användes (tabell 7).
Närvaron av lyserat hästblod i buljongen medier för testning av streptokocker har visats ha ett ytaktivt-liknande aktivitet, jämförbar till P-80 7, 8. Den dalbavancin referensmetod för streptokocker omfattar både P-80 och lyserades hästblod ,emellertid, till skillnad från stafylokocker och enterokocker, dalbavancin MIC resultat streptokocker liknar (inom +/- 1 utspädning) med och utan tillsats av P-80.
Såsom tidigare har presenterat och visas i figur 1, dalbavancin agar utspädning (AD) MIC är typiskt 2-8 gånger högre jämfört med den nuvarande BMD referens 12, 13, 14. I motsats till BMD, tillsatsen av 0,002% P-80 inte påverka dalbavancin AD MIC resultat 12.
Ekvation 1: Exempel på Dalbavancin Stock lösning beredning Beredning steg för 25 ml av 800 mikrogram / ml dalbavancin lösning..
Figur 1. Jämförelse mellan Dalbavancin och Vancomycin BMD till AD. Resultaten av studien som jämförde dalbavancin och vankomycin BMD och AD MIC resultat för utvalda grampositiva bakterieisolat. Genomsnitt (A) Dalbavancin och (B) Vancomycin Broth mikroutspädnings och agar Utspädning MIC-resultat i ^ g / ml för 15 Staphylococcus aureus, 8 koagulasnegativa stafylokocker (CNS), 5 Enterococcus faecalis och 14 Streptococci (grupp A, B, och C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| EN | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL; 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| B | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| C | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| D | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| E | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. | |
| F | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| G | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 00,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| H | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| DAL | Dalbavancin | |||||||||||
| Koncentrationer är angivna i ^ g / ml efter 50 | il / brunn inokulering | ||||||||||||
Tabell 1. MIC plattformat. Den 96 brunnar format som visar var dalbavancin utspädningar och positiva kontrollbrunnar som används som exempel i den här videon publikation
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Källa Konc. (pg / ml) | Volym Källa (ml) | Volym DMSO (ml) | Mellan Konc. i DMSO (ig / ml) | Volym Mellan Konc. (ml) | Volym CAMHB + 0,004% P80 * (ml) | 2X Konc. Efter 1: 100 utspädning i CAMHB (ig / ml) | Final Panel Konc. Post Inokulering (ig / ml) |
| 800 | 1,0 | 1,0 | 400 | 0,02 | 1,98 | 4 | 2 |
| 400 | 0,5 | 0,5 | 200 | 0,02 | 1,98 | 2 | 1 |
| 400 | 0,5 | 1,5 | 100 | 0,02 | 1,98 | 1 | 0,5 |
| 400 | 0,5 | 3,5 | 50 | 0,02 | 1,98 | 0,5 | 0,25 |
| 50 | 0,5 | 0,5 | 25 | 0,02 | 1,98 | 0,25 | 0,125 |
| 50 | 0,5 | 1,5 | 12,5 | 0,02 | 1,98 | 0,125 | 0,06 |
| 50 | 0,5 | 3,5 | 6,25 | 0,02 | 1,98 | 0,06 | 0,03 |
| 6,25 | 0,5 </ td> | 0,5 | 3,13 | 0,02 | 1,98 | 0,03 | 0,015 |
| 6,25 | 0,5 | 1,5 | 1,5 | 0,02 | 1,98 | 0,015 | 0,008 |
| 6,25 | 0,5 | 3,5 | 0,8 | 0,02 | 1,98 | 0,008 | 0,004 |
| 0,8 | 0,5 | 0,5 | 0,4 | 0,02 | 1,98 | 0,004 | 0,002 |
| Denna tabell har ändrats från CLSI M100-S25, tabell 8B 3 | |||||||
Tabell 2. System för Förbereda Späd av vattenolösliga Antimicrobial Agents som ska användas i buljong Spädresistensbestämning. Volymerna av dalbavancin arbetslösningar och spädningsmedel för framställning av den slutliga MICdalbavancin lösningar av 0,002-2 | ig / ml.
| Kvalitetskontroll Strain | Förväntad Dalbavancin MIC (pg / ml) |
| S. aureus ATCC 29.213 | 0,03-0,12 |
| E. faecalis ATCC 29.212 | 0,03-0,12 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 0,008-0,03 |
Tabell 3. Förväntad Dalbavancin MIC Resultat för kvalitetskontroll Stammar 3, 11. CLSI kvalitetskontrollresultat för föreslagna stammar som skall testas tillsammans med kliniska isolat för att verifiera korrekt metodik
Tabell 4. Fördelning av Dalbavancin MIC resultat (Antal vid varje MIC) från USA och EU 2011-2013 Surveillrings Study 15. Dalbavancin MIC resultat från en publicerad studie av färska kliniska isolat som en indikator på ström dalbavancin aktivitet in vitro.
| Isolera # | Dalbavancin MIC (pg / ml) | ||
| DMSO 1 | DMSO 2 | DMSO 3 | |
| S. aureus ATCC 29.213 | 0,12 | 0,06 | 0,06 |
| 0,12 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| E. faecalis ATCC 29.212 | 0,06 | 0,06 | 0,06 |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,015 | 0,015 | 0,015 | |
| 0,03 | 0,015 | 0,015 | |
| DMSO 1 = Oöppnad flamma förseglade 10 ml ampuller | |||
| DMSO 2 = Ofta öppnade 1L flaska | |||
| DMSO 3 = Ofta öppnade 1L flaska - satt på bänken i avslöjats bägare för 72 timmar | |||
Tabell 5. Dalbavancin MIC resultat (pg / ml) med användning av DMSO Stock och Intermediate Späd Beredning med DMSO från 3 Källor. Resultat av en dalbavancin MIC studie som jämförde effekten av att använda olika DMSO lösningsmedel vid framställning av dalbavancin lager och mellan utspädningar.
| Isolat Antal | Replikat Antal | Dalbavancin MIC (pg / ml) | |
| DALB vikt / P80 i DMSO | DALB v / o P80 i DMSO | ||
| S. aureus ATCC 29.213 | 1 | 0,06 | 0,06 |
| 2 | 0,06 | 0,06 | |
| 3 | 0,06 | 0,06 | |
| 4 | 0,06 | 0,06 | |
| S.aureus klinisk DP80-002SA | 1 | 0,03 | 0,03 |
| S. aureus ATCC 700.699 | 1 | 0,5 | 0,5 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0,03 | 0,015 |
| 2 | 0,03 | 0,015 | |
| 3 | 0,03 | 0,015 | |
| 4 | 0,03 | 0,015 | |
| S. pyogenes kliniska: | |||
| DP80-004PY | 1 | 0,015 | 0,015 |
| DP80-005PY | 1 | 0,03 | 0,03 |
| DP80-006PY | 1 | 0,03 | 0,015 |
| DP80-007PY | 1 | 0,06 | 0,03 |
| DP80-008PY | 1 | 0,03 | 0,015 |
| S. agalactiae klinisk: | |||
| DP80-009AG | 1 | 0,06 | 0,12 |
| DP80-010AG | 1 | 0,06 | 0,03 |
| DP80-011AG | 1 | 0,06 | 0,06 |
| DP80-012AG | 1 | 0,06 | 0,06 |
| S. dysgalactiae Clinical DP80-013DY | 1 | 0,03 | 0,03 |
| S. pneumoniae kliniska: | |||
| DP80-014SP | 1 | 0,06 | 0,06 |
| DP80-015SP | 1 | 0,03 | 0,03 |
| DP80-016SP | 1 | 0,03 | 0,03 |
| DP80-017SP | 1 | 0,06 | 0,06 |
Tabell 6. Dalbavancin MIC resultat med hjälp av DMSO Stock och Intermediate Späd Beredning med och utan 0,002% P-80. Resultat av en dalbavancin MIC studie som jämförde effekten av att tillsätta 0,002% P-80 för att dalbavancin lager och mellanliggande späd.
| Isolera | Replikat Antal Lager spädningsrör | Mikrotiterplatta (plast-typ) | |||||||
| Poly-propylen, Greiner | Polystyren | ||||||||
| Glas | Plast | Plast 1 hr | Plast 1h / Intermediate 1h | Greiner | Corning | Nunc | |||
| S. aureus ATCC 29.213 | 1 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | 0,06 | 0,03 |
| 2 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | |
| 3 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | |
| E. faecalis ATCC 29.212 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | |
| 2 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | |
| 3 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,008 | 0,008 | 0,008 | 0,008 |
| 2 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,008 | 0,015 | 0,008 | 0,008 | |
| Glas = Ingående lager görs i glasflaska, användas omedelbart för att göra mellanliggande koncentrationsi plaströr, användas omedelbart för att göra buljong späd. | |||||||||
| Plast = Ingående lager gjord i plast centrifugrör, användas omedelbart för att göra mellanliggande koncentrationer i plaströr, användas omedelbart för att göra buljong späd. | |||||||||
| Plast 1 h = Ingående lager gjort i centrifugrör av plast, låt sitta på bänken för en timme sedan för att göra mellanliggande koncentrationer i plaströr, som används omedelbart för att göra koncentrationerna i buljong. | |||||||||
| Plast 1 tim / Intermediate 1 tim = Ingående lager gjord i plast centrifugrör, låt sitta på bänken under 1 timme sedan används för att göra mellanliggande koncentrationer i plaströr, låt sitta på bänken under 1 timme sedan används för att göra koncentrationer i buljong. | |||||||||
Tabell 7. Dalbavancin MIC resultat med hjälp av lager Späd Förberedelser i plast och glas Rör och MIC Plate Plasttyper. Resultat ofa dalbavancin MIC studie som jämförde effekten av att använda plast eller glasrör vid upprättandet av stamlösningar och även effekten av att använda olika källor och typer av plast för mikrotiterplattor.
Discussion
Följande metodinformation presenteras för ytterligare överväganden när de förbereder för dalbavancin MIC-testning. Utformningen av MIC panelen kommer att bero på antalet antimikrobiella medel som skall testas (dvs.., Ensamma eller flera agenter dalbavancin) och de arter av bakterier som skall testas. De dalbavancin koncentrationerna bör omfatta tolknings brytpunkter för alla bakteriearter som skall testas och hela utbud av späd förväntas för åtminstone en QC stam. Det antimikrobiella utspädningsserie kan organiseras antingen i rader eller kolumner beroende på antalet av antimikrobiella medel och / eller isolat / platta och ett förfarande för ympning. Volymen av dalbavancin pulver och buljong ska beräknas för att säkerställa att optimala mängder produceras och avfall är minimal. För exemplet som används i denna publikation, volymerna baserade på framställning av två MIC paneler. Katjon justerat Mueller Hinton buljong bör förberedas och autoklaveras enligt människanfrån tillverkaren instruktioner och sterilitet av medierna kontrolleras. MIC paneler kan göras och användas på samma dag för att förbereda eller så kan testas med lämpliga kvalitetskontroll organismer och validerade panelerna lagrade frysta för framtida bruk. Det är viktigt att använda sterila tekniker under hela förfarandet.
Det finns inga strikta kriterier för kontroll av inokulatkoncentration med kolonier. Kolonier kan kontrolleras initialt för varje testad och / eller med jämna mellanrum för att validera utspädningssteget i steg 4.2 arter. Det är viktigt att giltigheten av 0,5 McFarland standard också kontrolleras rutinmässigt med E. coli ATCC 25.922 användning av ett förfarande liknande steg 4,5. Om resultaten inte motsvarar 1-2 x 10 8 CFU / ml, en ny 0,5 McFarland standard bör erhållas. Om kolonier från MIC brunnar ligger utanför acceptabelt intervall (2-8 x 10 5 CFU / ml och MIC resultat för kliniskt isolat (s) varierar från the förväntade normalfördelning (t ex. 0,03-0,12 pg / ml för S. aureus) och / eller MIC resultat för kvalitetskontroll isolat (s) ligger utanför förväntade intervall, är validering testning behövs och metod modifiering kan vara motiverat. Det föreslås att en validerad 0,5 McFarland standard används för att upprepa mikroorganismer (s) och om resultaten är återigen utanför förväntade resultat, bör ympen utspädning som utförs i steg 4.2 justeras i enlighet och MIC upprepas. Observera att en renhetskontroll är nödvändig även om en mikroorganismer utförs eftersom förfarandet mikroorganismer använder en utspädd volym som inte nödvändigtvis detektera lägre koncentrationer av förorenande organismer.
För en MIC prov skall anses som giltigt måste acceptabel tillväxt ske i tillväxtkontrollbrunnen. För de flesta bakterier som kommer att testas mot dalbavancin (ie., Stafylokocker, streptokocker och enterokocker, tillväxten kommer att ses som en knapp (typiskt> 2 mm) och mindre frequently kan tillväxten visas som grumlighet i brunnen. Till skillnad från vissa antimikrobiella medel som kan uppvisa avslutande effekt som koncentrationer ökar, är dalbavancin endpoints oftast väl definierad. Det finns olika visningsanordningar som är avsedda att underlätta läsningen mikrospädningstest, som kan användas för att läsa dalbavancin innehåller plattor så länge det finns ingen kompromiss i förmågan att urskilja tillväxten i brunnarna.
De kritiska steg inom protokollet är relaterade till de delar av förfarandet som är relaterade till löslighet dalbavancin och tillsats av P80. Det är viktigt att den maximala koncentrationen av dalbavancin användes inte är större än 1600 ^ g / ml, att DMSO används som ett lösningsmedel, och att mellanliggande koncentrationer framställes i DMSO innan du köper buljong utspädningar så att den slutliga koncentrationen av DMSO i MIC panel brunnar inte är större än 1%. DMSO är hygroskopiskt och därför kan användningen av äldre flaskor DMSO var en consideration med avseende på dalbavancin löslighet. Men medan en liten BMD studie med stammar kvalitetskontroll har visat att detta inte vara en viktig variabel (se resultat avsnitt), är det god praxis att använda nya eller nyligen öppnade flaskor DMSO. Det är också viktigt att P80 sättes till buljongen i det slutliga steget av läkemedelsutspädning beredningen och är vid en slutlig koncentration av 0,002% i MIC-brunn.
BMD-förfarandet ingår här utnyttjar framställningen av MIC panelerna med 50 | j, l / brunn vid dalbavancin och P-80 koncentrationer två gånger den slutliga koncentrationen och tillsats av inokulum med 50 | j, l / brunn så att den slutliga volymen / brunn är 100 pl. Denna metod gör det möjligt för en MIC panel format som ska produceras för testning av både S. aureus och S. pneumoniae eftersom den lyserade hästblod kan sättas till inokulat. Alternativa metoder för framställning av MIC paneler med 100 pl / brunn med tillsats av upp till 10 | j, l / brunn beskrivs iCLSI och ISO-förfarandena.
Den dalbavancin mottagliga brytpunkt för S. aureus är ≤0.12 pg / ml (FDA bipacksedeln). Såsom visas i de senaste övervakning, är majoriteten av isolat inhiberas genom dalbavancin vid nivåer av 0,06 | ig / ml 15. Med en mottaglig brytpunkt nära den modala MIC, kan varje variation i MIC som en följd av metod skillnader påverkar resistens priser. Eftersom BMD förfarandet för dalbavancin innehåller några unika steg (närmare bestämt, är användningen av DMSO i beredningen av lager och mellandrogspäd och 0,002% P80 i MIC väl det absolut nödvändigt att metoden exakt följas. S. aureus QC organism (ATCC 29213) med en mycket tydlig dalbavancin modal MIC av 0,06 mikrogram / ml, har varit en bra indikator på metod variation och bör användas rutinmässigt för att validera BMD metoden. Om MIC resultat med det förväntade intervallet 0,03 till 0,12 mikrogram / ml, men är trend till antingen den låga eller high sidan av detta område, är ytterligare validering av metoden befogat.
Tillsatsen av 0,002% P80 rekommenderas för alla relevanta grampositiva organismer (staphylococcci, enterokocker och streptokocker.) Det är dock värt att notera att det har visat sig att lyserade hästblod agerar liknar P-80 i förhållande till dess anti-bindande kapacitet och att tillsatsen av P-80 till CAMHB + LHB har ingen ytterligare effekt på dalbavancin streptokocker MIC resultat.
Det finns för närvarande ingen disk diffusion metod för att testa dalbavancin och på grund av den dåliga korrelationen mellan BMD och AD resultat, resistensbestämning av dalbavancin använder AD metod rekommenderas inte 12, 14. BMD metoden bör användas för den framtida bedömningen av dalbavancin känslighet och som en gyllene standard för utvecklingen av kommersiella antimikrobiella känslighetstester.
Disclosures
Sandra McCurdy är anställd av Durata Therapeutics; Laboratorie Specialister, Inc., arbetsgivare Laura Koeth och Jeanna Fisher, kontrakterades av Durata Therapeutics att förbereda manuskriptet. Publiceringsersättningar för den här artikeln betalades av Laboratory Specialister, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
| Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
| Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
| Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| 12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Single channelpPipets (Ovation 10 µl - 100 µl) | VistaLab | Brewster, NY | |
| 96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
| 50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16x125 mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 12x17 mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16 ml centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
| Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| Disposable sterilelLoops (1 µl & 10 µl) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
| Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
| Incubator (ambient) | Sanyo | ||
| Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
| Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
| Lab coats |
References
- Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
- M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).
- Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
- Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
- Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
- Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
- Ribbon Panel, B. lue Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
- Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
- Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , San Francisco, CA. (2012).
- Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
- Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
- Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).
