Summary
Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demand.In neste trabalho um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares.
Abstract
Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demanda para monitorar as mudanças fisiológicas, farmacológicas e patológicos no líquido cefalorraquidiano. Infelizmente, as sondas comerciais são caros para grupos de pesquisa em instituições públicas. Neste trabalho, um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares. A sonda de microdiálise consiste de uma membrana de polissulfona com um corte molecular de 30 kDa. Sonda in vitro recuperações de substâncias com peso molecular diferente (no intervalo de 100-1,600 Da) e diferentes propriedades físico-químicas são comparados. A sonda produz uma recuperação in vitro de aproximadamente 20% para o de glicose compostos pequenos, lactato, acetilcolina e ATP. In vitro recuperações para neuropeptídeos com um peso molecular entre 1,000-1,600 Da quantidade de 2-6%. Assim, enquanto o w molecular mais elevadooito dos neuropeptídeos reduzido em valores de recuperação in vitro, diálise de compostos na gama mais baixa (até 500 Da) de pesos moleculares não tem grande impacto sobre a taxa de recuperação in vitro. O presente método permite a utilização de uma membrana de diálise com o outro valor de cut-off e material de membrana. Portanto, este conjunto de sonda feitos por medida tem a vantagem de flexibilidade suficiente para dialisar substâncias em uma ampla gama de pesos moleculares. Aqui, nós apresentamos uma sonda de microdiálise com um comprimento de permuta de 2 mm, o que é aplicável para microdiálise no rato e regiões do cérebro de rato. No entanto, as dimensões da sonda pode ser facilmente adaptado para comprimentos maiores de câmbio para ser utilizado em animais maiores.
Introduction
Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Durante os últimos 50 anos, a técnica minimamente invasiva de microdiálise foi continuamente melhorado para se tornar um método bem estabelecido para monitorizar as concentrações locais de compostos de pequeno peso molecular, no espaço extracelular. Quase todos os tecidos fluidos intersticiais podem ser investigados em animais que se movem livremente.
Gaddum introduziu a técnica push-pull na década de 1960. Ele modificado a partir de uma abordagem Feldberg et al., Em que tubocurarina foi perfundido através de uma cânula terminando no ventrículo lateral e recolher o efluente também através de uma cânula 1. Gaddum desenvolveu a técnica de push-pull, no qual uma cula que consiste em duas agulhas de aço concêntrico foi implantado em áreas distintas do cérebro e perfundidos por uma solução enquanto se remove simultaneamente os neurotransmissores libertados dos neurónios circundantes da ponta 2. Infelizmente, dama tecidoGE causada pela cânula em torno da ponta limitado a aplicação do presente método. Como um outro avanço deste método, Bito e colaboradores introduziu um método do saco de diálise em que a solução recolhida foi separada a partir do tecido circundante por uma membrana de diálise. Eles implantaram um saco de diálise no tecido subcutâneo do pescoço do cão. O conteúdo do saco de diálise é livre de proteínas e podem ser analisadas várias semanas mais tarde por iões e aminoácidos 3. O seguinte foi o desenvolvimento dialytrode, uma sonda de microdiálise primitiva, que foi originalmente descrito por Delgado em 1972 4. Finalmente, Ungerstedt e colegas melhorado a concepção de sonda de microdiálise, de modo que era menor e menos deslocadas tecido 5.
Uma sonda de microdiálise concêntrica se comporta de forma semelhante a um capilar sangue. O sistema é constantemente perfundidos com uma solução com a composição iónica do fluido do tecido circundante, enquanto a falta de analito de interesse. ºe diálise de membrana exposta à solução externa ou tecido é semi-permeável. Ele permite a difusão passiva de substâncias para a sonda ao longo do seu gradiente de concentração 6. A permeabilidade depende de muitas variáveis tais como o peso molecular, forma, carga e pH do composto. Também é limitada devido às propriedades do material da membrana, o tamanho dos poros da membrana e taxa de fluxo de 7.
As Figuras 1 e 2 mostram uma sonda de microdiálise concêntrica. O fluido de perfusão entra através de uma tubagem de admissão para dentro da manga de metal, que rodeia a sílica fundida. Dentro da luva de metal, ele flui para baixo ao longo da sílica fundida e deixa-o em sua ponta. No espaço entre a membrana de diálise e o politetrafluoroetileno (PTFE) -tubing (tal como teflon) o líquido de perfusão, em seguida, flui para cima. Aqui, a difusão de substâncias a partir do tecido ocorre, que cercam a membrana. O dialisado sai da sonda através da PTFE-tubagem, que está ligada à tomada tubagem e pode ser recolhido.
A técnica de microdiálise tem várias vantagens em relação ao outro em técnicas in vivo. A sonda constitui uma barreira física com o resultado de que o dialisado não contém enzimas ou células. Portanto, não há necessidade de purificação do eluato, antes da análise, e sem degradação enzimática de analitos ocorre. A degradação oxidativa pode ocorrer durante a passagem de analitos no tubo, mas muitas vezes isso pode ser evitado através da adição de um antioxidante (por exemplo, ácido ascórbico) ao perfusato. Alternativamente, o dano oxidativo dos neuropeptídeos, por exemplo, foi suprimido de forma eficiente mediante a substituição do tubo de saída com uma ponta para recolher o dialisado 8. O dialisado pode ser investigado diretamente com quase qualquer tipo de método analítico e vários analitos podem ser coletados simultaneamente. Este sistema pode ser utilizado em animais acordados, e quase todas as regiões do cérebro pode serexaminados. Além disso, a infusão de fármacos através da sonda é possível (retrodiálise). No entanto, também existem limitações da técnica de microdiálise. A resolução um pouco baixa vez não fornece informações em tempo real sobre as alterações de neurotransmissores. Porque é uma técnica invasiva, implantação sonda provoca trauma cirúrgico e anestésico, o que pode afetar as concentrações de neurotransmissores, é necessário durante esta etapa 7,9,10.
A concentração do composto no dialisato compreende apenas uma pequena quantidade de composto de facto a concentração no fluido extracelular. Para o cálculo da concentração do composto desconhecido no fluido extracelular, recuperação relativa in vitro tem de ser calculada. Determinação da relação indivíduo em recuperações in vitro para cada sonda e cada composto é necessário antes de iniciar o experimento in vivo. Para este efeito, a sonda é mergulhado numa solução contendo oanalito de interesse ao passo que o líquido de perfusão é a mesma solução sem o analito de interesse. Após a determinação de concentrações de composto no dialisado, estes dados tem de ser encaminhado para a sua concentração no fluido circundante. In vitro determinações de recuperação de várias substâncias podem ser implementados simultaneamente 9.
Muitos grupos de pesquisa neuroscience usar a técnica de microdiálise para investigar neurotransmissores e metabolitos no espaço extracelular de áreas distintas do cérebro. Assim, as sondas comerciais estão em grande demanda no ambiente de pesquisa em neurociência. Uma grande vantagem das sondas disponíveis comercialmente é a fiabilidade funcional alta. O set-up experimental para sondas comerciais está bem estabelecida e validada por muitos neurotransmissores e metabólitos bem conhecidos. No entanto, ao passo que o equipamento de microdiálise disponível comercialmente é caro e tem menos flexibilidade na aplicação 11, no thtrabalhar é um conjunto de sonda de microdiálise é apresentado em pormenor, o qual pode ser adaptado para qualquer aplicação e pode ser fabricado por menos do que $ 10. Esta sonda feitos sob medida é uma sonda de microdiálise concêntrico testado para investigações em várias áreas do cérebro 8.
Em recuperações sonda in vitro de substâncias com peso molecular diferente (gama de 100-1,600 Da) e com diferentes propriedades físico-químicas são comparados. A determinação in vitro de recuperação de glucose, lactato e acetilcolina com um peso molecular inferior a 200 Da, ATP com um peso molecular de cerca de 500 Da e da neuropeptídeos da angiotensina II, a substância P e de somatostatina com um peso molecular acima de 1.000 Da é realizada.
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Protocol
1. Preparando-PTFE tubing
- Encurtar PTFE-tubulação em 2,5 centímetros peça. Use um papel escala para estimar as dimensões físicas. (Veja a Figura 3-A)
- Corte um fim em um ângulo para facilitar a ligação da tubulação de saída. (Veja a Figura 3-A)
- Roughen PTFE-tubagem através da utilização de papel de lixa para permitir a aderência da cola epóxi.
2. Preparar Fused Silica
- Encurtar sílica fundida em 2,25 centímetros peça. (Veja a Figura 3-A)
3. Introduzir a Fused Silica no PTFE-tubulação
- Inserir uma cânula de 30 L para a fibra de PTFE oco para perfurar a uma distância de 1 cm a partir da extremidade plana. Dobre o PTFE-tubo para simplificar o processo. (Veja a Figura 3b)
- Insira a sílica fundida no PTFE-tubulação usando a cânula como orientação. (Ver Figura 3c)
- Remova cuidadosamente a cânula e garantir a sílica fundida. (VejoFigura 3d)
- A sílica fundida é suposto projecto de 5 mm na extremidade plana. (Veja a Figura 3e)
- Cole a sílica fundida no local no local da punção por cola de cianoacrilato e deixe-a endurecer durante a noite. (Veja a Figura 3e)
4. Preparar Epoxy Glue (Cola de dois componentes)
- Adicionar 30 partes de endurecedor amarela para 70 partes de cola epóxi preta com a ajuda de uma agulha fina e misture delicadamente. É diretamente pronto para usar.
5. A aplicação da membrana (Todos os Outros etapas devem ser executadas sob o microscópio e um Livro Scale é usado para estimar Dimensões físicas)
- Puxe a membrana de polissulfona com cuidado sobre a sílica fundida, em seguida, puxe a membrana para o PTFE-tubo e ajustar a membrana para 5,5 mm, utilizando um bisturi afiado. (Veja a Figura 3-F)
- Definir um ponto de marcação sobre a membrana com uma multa caneta para definir a duração troca de dois milímetrosa partir da extremidade da membrana.
- Aplicar uma pequena quantidade de cola epóxi para cobrir a ponta da membrana com a ajuda de uma agulha fina. (Veja a Figura 3 g)
- Feche o conjunto entre membrana de diálise e fibra de PTFE com a ajuda da mesma agulha fina usada na etapa 5.3) com a cola epóxi. (Veja a Figura 3 g)
- Adicionar cola epóxi suficiente na membrana para cima para o ponto de marcação para assegurar um comprimento de troca de 2 mm. Permita que ele se endurecer durante a noite. (Ver Figura 3G) antes da determinação do comprimento de câmbio, a membrana é de 5,5 mm. Depois de aplicar a cola epoxi sobre a membrana, apenas 2 mm da membrana está disponível para difusão.
6. Aplicação da manga metálica
- Corte uma agulha de 25 G em um centímetro peças luva de metal com a ajuda de um alicate de flexão.
- Puxar a 1 centímetro manga metálica (25 G) para a parte restante da sílica fundida. A manga de metal posterior permite a ligação do tubo de entrada com o MICRODIAsonda lise. (Veja a Figura 3h)
- Selar conjunta entre a manga de metal e PTFE-tubulação com a cola epóxi restante. Permita que ele se endurecer por pelo menos 24 horas. (Veja a Figura 3i)
- Aplicando a cola quente em torno da bifurcação da sonda para a fixação e estabilização adicional.
NOTA: O volume interno entrada da sonda é de 0,045 mL e o volume interno de saída é de 2,5 mL. Portanto, com uma taxa de fluxo de 1 mL / min, leva-se a cerca de 2,5 minutos depois de ligar o tubo de entrada para iniciar a recolha do dialisado. Com o presente protocolo, o procedimento de montagem da sonda produz sondas de microdiálise que são 95% de confiança.
7. realização de experimentos in vitro de recuperação
- Mergulhar a sonda com um cut-off de 30 kDa e um comprimento de permuta de 2 mm dentro de uma solução de reserva de composto aCSF contendo 1 mM de glucose e 1 mM de lactato e, numa experiência em separado, em um LCR contendo 100nM de ATP e 100 nM de acetilcolina.
- Perfundir as sondas com aCSF. Ajustar a taxa de fluxo de 1 mL / min e levar a cabo as experiências à temperatura ambiente (22 ° C). Permitir que as sondas a equilibrar durante 1 h na solução de reserva, e recolher as amostras a cada 30 minutos depois, e armazenar a -80 ° C até à medição.
- Para o cálculo da recuperação in vitro, comparar as concentrações de analitos nos dialisados com as concentrações conhecidas de analito na solução estoque. Expresse resultados como porcentagens de concentração da substância em dialysate vs. solução estoque.
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Representative Results
A sonda de microdiálise concêntrico feito por medida é constituído por uma membrana de polissulfona com um corte molecular de 30 kDa. O conjunto de sonda é ilustrado na Figura 3.
Ele exibiu uma recuperação in vitro para a glicose metabolitos pequena de energia (180,16 Da) e lactato (112,06 Da) de 19,10 ± 1,2% e 21,2 ± 1,6%, respectivamente. Para a acetilcolina carregado positivamente com um peso molecular de 181,66 Da, que mostrou um valor em recuperação in vitro de 22,6 ± 1,4%. ATP com um peso molecular de 551,62 Da e três resíduos de fosfato de carga negativa deu uma recuperação in vitro para uma extensão comparável (22,4 ± 0,7%). In vitro recuperações de moléculas pequenas estão apresentados na Figura 4A.
Os neuropeptídeos com um peso molecular acima de 1.000 Da apresentaram menor em recuperações in vitro, quando comparados com as moléculas mais pequenas (<500 Da) (ver Fi figura 4B). Entre os neuropeptídeos testados, a angiotensina II (1,046.18 Da) é o mais pequeno péptido com 8 aminoácidos. Ele exibiu uma recuperação in vitro de 6,1 ± 0,3%. O 11 resíduo amino ácido substância P (1,347.63 Da) e a somatostatina 14 aminoácidos (1,637.88 Da) mostrou aproximadamente igual em valores de recuperação in vitro de 2,2% ± 0,3 e 2,3 ± 0,1%, respectivamente. In vitro recuperações de nossa sonda de 30 kDa são comparável ao in vitro recuperações de sondas de microdiálise disponíveis comercialmente (CMA microdiálise, Estocolmo, Suécia), por exemplo. lactato 23% e glicose a 13% (ver nota aplicação não. 1)
Figura 1: Fotografia de uma sonda feitos sob medida.
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Figura 2: Imagem esquemática de uma sonda de microdiálise (Reproduzido de Lietsche et al, 2014, com permissão da Elsevier.).
Figura 3: Imagem esquemática de um conjunto de sonda; passo ai para ver detalhes do protocolo (Reproduzido de Lietsche et al., 2014, com permissão da Elsevier).
Figura 4: As recuperações de pequenas moléculas e neuropeptídeos (A) in vitro recuperações de glicose, lactato, acetilcolina e ATP.. A solução-mãe continham 1 mM de glicose e de lactato e, em alternativa, 100 nM e 100 nM de ATP acetilcolina para cada condição experimental. Os resultados são expressos como percentagem de substância concentration em solução dialisante / estoque. Os valores das substâncias de ensaio são médias ± DP de n = 22 para a glucose, n = 22 para o lactato, n = 11 para a acetilcolina e n = 13 para o ATP. (B) in vitro recuperações de neuropeptídeos a angiotensina II, a substância P e somatostatina. A solução-mãe contendo 100 nM de angiotensina II, a substância P e a somatostatina para cada condição experimental. Os resultados são expressos como percentagens de concentração da substância na solução dialisante / estoque. Valores de colunas são médias ± DP de n = 6 para cada sonda.
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Discussion
A Figura 3 mostra um conjunto de sonda exemplar. Dimensões de diâmetro interno e externo corretos têm de ser cuidadosamente observados no tubo (OD 1,6 milímetros; ID 350 mm), de sílica fundida (OD 105 mm; ID 40 mm) e membrana de diálise (OD 245 mm; ID 210 mm). É também importante para manter um espaço entre a membrana e de sílica fundida de (105 um) e entre a membrana e os tubos (105 mm), bem. Se os valores forem diferentes, a pressão na sonda pode subir e provocar o vazamento da membrana.
Aqui nós introduzir uma sonda de microdiálise com um comprimento de permuta de 2 mm, o que é aplicável para microdiálise em regiões do cérebro do rato. No entanto, as dimensões podem ser facilmente adaptados para troca de comprimentos maiores, para ser utilizado em animais maiores.
Algumas partes do conjunto pode ser substituído. Por exemplo, não é necessário o uso de PTFE-tubagem. Aplicação de tubos de polietileno também é possível com idêntico exterior e pousadaer dimensões de diâmetro. Rugosidade da tubulação só é necessário quando se utiliza um PTFE-tubulação. Uma substituição da membrana de diálise, também é possível. Para o conjunto de sonda presente, uma membrana de corte de 30 kDa é usado, mas qualquer outra membrana de diálise pode ser usado com dimensões idênticas. Portanto, a nossa sonda montagem feitos por medida tem a vantagem de uma grande flexibilidade para dialisar substâncias com uma ampla gama de pesos moleculares; quanto maior for o peso molecular de corte, maior é o peso molecular da substância, que pode ser dialisado. in vitro recuperações geralmente aumentar com o peso molecular de corte da membrana de diálise.
Para cobrir a ponta da membrana, cola epóxi é necessário para fechar a articulação entre a membrana de diálise e PTFE-tubo e para determinar o comprimento de câmbio. A aplicação do adesivo de cianoacrilato não é possível neste passo, uma vez que afecta a membrana de diálise e conduz ao risco de fuga. Um adesivo de cianoacrilato para colar plASTIC deve ser aplicada para a fixação de sílica fundida com a tubulação no lugar no local da punção.
Deve notar-se que esta concepção de sonda não foi testado com cânulas guia. Nosso laboratório prefere implantar testes de baixo diâmetro para experimentos agudos em que temos de 48-72 horas de tempo experimental, antes da astrogliosis provoca mau funcionamento da sonda. Para este tipo de experiência, uma cânula de guia não oferece uma vantagem porque cânulas guia são maiores e mais causar danos nos tecidos. Além disso, mesmo com uma cânula guia no lugar, a sonda tem sempre de ser inserido no tecido saudável do cérebro, causando danos agudos na área de diálise. Repetida inserção e remoção da sonda através de cânulas guia provoca danos repetida, uma situação que é evitado por uma só vez, isto é, a inserção aguda. A barreira sangue-cérebro mostrou-se intactas algumas horas após o implante 12. Cânulas guia são preferíveis, no entanto, quando as medições de série hav para ser feito ao longo de vários dias ou semanas. Finalmente, os anestésicos voláteis devem ser utilizados para implantação sonda porque as drogas anestésicas injectáveis interferir com experiências subsequentes durante 1-2 dias.
Em recuperações in vitro para a glicose, lactato, acetilcolina e ATP são de aproximadamente 20%, isto é, para todas as substâncias testadas de pequeno peso molecular, a recuperação in vitro é quase igual. Evidentemente, na gama inferior (até 500 Da), o peso molecular não tem grande impacto sobre a taxa de recuperação in vitro. O peso molecular de corte de 30 kDa, também permite a diálise neuropeptídeos. Devido ao peso molecular mais elevado dos neuropeptídeos, o valor de recuperação in vitro é inferior. A substância P (1348 Da) e somatostatina (1638 Da) pode ser dialisada na mesma medida in vitro com valores de recuperação de 2-3%. Embora ambos os péptidos têm um deslocamento de massa de cerca de 300 Da, in vitro recuperações permanecem os mesmos. Ambos substdade P e somatostatina são carregados positivamente em solução aquosa e pode apresentar propriedades físico-químicas semelhantes. A angiotensina II, com um peso molecular de 1046 Da revela um elevado in vitro de recuperação de até 6%, que é três vezes maior do que com as outras duas neuropeptídeos. Assim, os pesos moleculares acima de 500 Da afectam claramente a recuperação in vitro, mesmo quando as substâncias são carregadas em solução aquosa neutra. Neste caso, a recuperação in vitro, não é afectado pela carga das substâncias dialisados. No entanto, com o uso de outros materiais de membrana, as recuperações de compostos carregados pode ser afectada 8.
Em conclusão, a montagem de uma sonda de microdiálise feito por encomenda é uma alternativa aceitável para sondas comerciais. Nossas sondas self-made são resistentes, têm alta confiabilidade e boa reprodutibilidade.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H.
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C.
- Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S.
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- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
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