Introduction
유도 된 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)의 발견은 환자 맞춤형 줄기 세포의 생성을위한 1-3 가능한 방법을 제공하는 재생 의료 분야 혁명을 일으켰다. hiPSCs 성공적 4,5- 섬유 아세포, 조혈 세포 6,7, 소변 8에서 신장 상피 세포와 각화 9,10 포함하는 다양한 종류의 체세포에서 생성되었다. 현재까지, 피부 섬유 아세포 및 조혈 세포는 환자 별 iPSCs를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 셀의 소스를 나타낸다. 틀림없이, 이것은 피부 생검과 채혈 일상 의료 절차 및 여러 나라에서 확립 된 환자의 혈액 샘플의 피부 또는 대형 바이오 뱅크 있다는 사실에 기인한다.
혈액 세포 및 침윤성 추출 방법을 필요로 피부 섬유 아세포는 달리, 케 라티노 사이트는 hiPSC 생성에 쉽게 접근 세포 유형을 나타낸다. KeratinocytES는 피부의 외관 상피 장벽을 형성하고 또한 손톱 및 모발 (11)에서 발견되는 케라틴 풍부한 상피 세포이다. 특히 각질 세포가 모낭 내부 근초 (IRS) 셀 (12,도 1)와 함께 모발 덮여 셀룰러 외부 층의 외측 근초 (ORS)에서 찾을 수있다. 헤어 컬렉션 의료인의 도움을 필요로하지 않는 간단한 절차이므로 환자 수집 크게 hiPSC 생성을위한 환자 샘플의 수집을 용이하게 할 실험실에 자신의 머리 샘플을 보낼 수 있도록, 그 기회를 제공한다. 표피 각화 세포도 생성 hiPSC 9, 13의 시작으로 각질 형성 세포를 사용하는 장점에 추가하여 섬유 아세포에 비해 높은 효율 및 프로그래밍 빠른 프로그래밍 속도론있다. 또한, hiPSCs 또한 모낭 내의 다른 세포 집단을 사용하여 생성 될 수 있고,모낭 14,15 바닥에있는 모유두 세포를 포함.
헤어 유래 세포를 사용하여 IPSC 세대의 이전 보고서들은 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 기반의 프로그래밍 방법 9,14,15을 사용합니다. 그러나 이러한 바이러스 성 방법은 재 프로그래밍시 외국 유전자의 바람직하지 않은 게놈 통합을 소개합니다. 비교하여, 에피 솜 벡터의 사용은 통합 프리 iPSCs 4를 생성 가능한, 비 바이러스 프로그래밍 방법을 나타낸다. 우리는 이전에 효과적으로 에피 솜 벡터 (13)를 사용 hiPSCs으로 각질 세포를 재 프로그램하는 간단하고 비용 효율적인 비 바이러스 성 방법을 개발 하였다. 여기에 우리가 뽑아 머리, 확장 및 각질 세포의 유지 보수 및 hiPSCs를 생성 이후의 재 프로그래밍에서 각질 세포의 유도를 포함하여 각질 세포에서 파생 된 hiPSCs,의 생성에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
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Protocol
개인의 인간의 머리카락 샘플의 수집은 호스트 기관에서 인간의 연구 윤리위원회 윤리의 승인을 필요로하며, 제도적 지침에 따라 수행해야합니다.
뽑아 머리에서 각질 1. 분리
- 얼음 O / N에 (즉, 마트 리겔) 해동 세포 외 기질 (ECM) 솔루션입니다.
- 사전 냉장 피펫 팁을 사용하여, 냉장 DMEM / F12 배지 12 ml를 200 μL ECM 솔루션을 추가합니다. 코트의 각 웰에 희석 된 ECM 용액 1 ㎖와 함께 12 웰 플레이트. 37 ° C에서 코팅 된 플레이트 O / N을 품어. 사용하기 전에 미리 예열 DMEM / F12 배지로 코팅 된 판을 씻으십시오.
- 머리카락의 뿌리 부근에 손가락을 배치 한 빠르고 부드러운 동작으로 머리를 따 버릴에 의해 개인의 머리에서 차 인간의 머리카락을 수집합니다. 각 수집 머리를 그대로 모낭이 포함되어 있는지 확인하고 헤어 유엔의 성장 단계를 결정하기 위해 확인해부 현미경 (그림 1) 데르.
- 각질 세포를 추출하는 각 개인으로부터 5 ~ 10 성장기의 머리카락을 수집합니다. 프로세스는 각질 세포의 성공적인 유도를 보장하기 위해 가능한 한 빨리 털을 뽑아.
참고도 1은 성장주기의 다른 단계에서의 모발 형태를 도시한다. 성장기 모발 ORS 알려진 모발의 길이를 둘러싸는 상피의 가시 외층과, 성장 단계에있다. 한편, 휴지기 모발 휴식 단계에서 머리를 나타내고 가시 ORS이 없지만 휴지기 융기 알려진 모발의 뿌리를 덮는 셀 명확한 공을 갖는다.
- 각질 세포를 추출하는 각 개인으로부터 5 ~ 10 성장기의 머리카락을 수집합니다. 프로세스는 각질 세포의 성공적인 유도를 보장하기 위해 가능한 한 빨리 털을 뽑아.
- 실온에서 5 분간 씻어 항생제 믹스 10 ㎖를 포함하는 페트리 접시에 머리 샘플을 놓습니다.
- 머리 샤프트의 1cm - 멸균 가위와 집게를 사용하여, 그대로 모낭 주위에 0.5으로 머리 조각을 떠나, 과도한 헤어 샤프트를 잘라.
- 조심스럽게 TRA겸자를 이용하여 ECM 코팅 플레이트의 각 웰에 1 nsfer 머리 단편.
- 모발 샘플 - (200 μL ~ 100) 1 mL를 피펫을 사용하여, 녹아웃 세럼 교체 (KSR) 매체의 약 3 방울을 추가합니다.
주 : 부착 및 후속 각질 생장을 허용하도록 플레이트 표면에 밀착 머리 단편 유지. 이 단계에서 과도한 미디어를 추가 할 수있다 머리 조각이 떠있는 원인과 성공적인 헤어 첨부 파일의 기회를 감소시킨다. - 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 머리카락 샘플을 품어과 모낭은 / N을 O를 첨부 할 수 있습니다. 촉촉한 모발 샘플을 유지하기 위해 - (200 μL ~ 100) 다음 날, 부드럽게 KSR 매체의 또 다른 3 방울을 추가합니다.
- 모낭이 성공적으로 연결되었는지 확인하기 위해 매일 머리 샘플을 관찰한다. 일반적으로 모낭의 부착 1-3 일 이내에 알 수있다. 잔털이 높은 가지고 두꺼운 머리카락, 잔털에 비해 부착 일반적으로 쉽게경향은 첨부 파일 프로세스를 방해하는 떠.
- 머리가 코팅 된 플레이트에 부착 한 후, 웰에 KSR 매체의 500 μl를 추가합니다. 머리 샘플이 단단히 연결되지 않았을 수 있습니다으로 매체를 추가 할 때 좀 더주의를 기울여. 이 시점에서, 2 일마다 미디어를 변경합니다.
참고 : 케 라티노 사이트의 outgrowths는 3-7일 (그림 2A-B) 후 머리 조각의 ORS 지역에서 볼 수 있어야합니다. 각질은 다음 섹션에 설명 된대로 세포를 계대 14 일 전으로 성장하도록 허용합니다.
- 머리가 코팅 된 플레이트에 부착 한 후, 웰에 KSR 매체의 500 μl를 추가합니다. 머리 샘플이 단단히 연결되지 않았을 수 있습니다으로 매체를 추가 할 때 좀 더주의를 기울여. 이 시점에서, 2 일마다 미디어를 변경합니다.
2. 유지 관리 및 각질과 Passaging
- 사전 코트 코팅 매트릭스 키트를 사용하여 6 웰 플레이트. 코팅 매트릭스 솔루션의 6.8 μL 뒤에 아니라 각 키트에서 희석 매체의 680 μl를 추가합니다. 플레이트에 도포 매트릭스 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 플레이트를 흔들어.
- 코팅 된 플레이트는 실온에서 30 분 동안 품어하도록 허용합니다. 제거각질 세포의 도금하기 전에 코팅 매트릭스 솔루션입니다.
- 37 ℃에서 2-5 분 동안 웰 당 0.25 % 트립신 500 μL와 단일 세포 현탁액 내로 해리 각질. 매체를 포함하는 혈청 (예, 우 태아 혈청 (FBS) 배지) 500 μL와 트립신을 비활성화하고 멸균 15 ㎖의 튜브에 수집한다. 멸균 집게를 사용하여 머리 조각을 제거합니다.
- 혈구를 사용하여 수확 세포의 수를 결정합니다.
- 200 X g에서 3 분 동안 세포를 원심 분리기. PBS를 반복 원심 분리와 세포를 씻으십시오. PBS를 대기음 신선한 각화 세포 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 각질 세포 배지의 존재 ECM 코팅 플레이트의 한 웰 플레이트에 4 × 10 아래 4 각화 세포. 5 % CO 2 (그림 2C)와 37 ° C 배양기에서 각질 세포를 유지합니다. 문화가있는 경우 ~ 용지를 80 % 합류를 매일 통과 세포를 변경, WHI채널은 각질 세포의 통과 번호와 확산 속도에 따라 약 2-7일 걸릴 수 있습니다. 유래 각질 세포는 표준 느린 냉동 냉동 보존 방법 (16)를 사용하여 충분한 냉동 주식을 생성하기 위해 확장되어야한다.
참고 : 설명 배양 조건은 전형적인 조약돌 형태 (그림 2C)와 각질 형성 세포의 균일 한 인구의 확장을 지원합니다. 때때로, 몇 가지 차별화 된 대형 평면 형태와 각질 세포 및 복제 성 잠재력을 잃었다는 문화에서 관찰 할 수있다. 각화 세포의 특성화 cytokeratin 14 대해 항체를 이용한 면역 염색에 의해 수행 될 수는 앞서 설명한 17. 설립 각질 세포주는 또한 시판 키트를 사용하여 1-3 통로 이후 마이코 플라즈마에 대해 시험한다.
에피 솜 벡터를 사용하여 각질 형성 세포에서 hiPSCs의 3 세대
- 6 웰 플레이트와 사전 코트0.1 % 젤라틴 (2 ㎖ / 웰). RT에서 적어도 20 분 동안 코트에 젤라틴을 허용.
- 리 프로그래밍 실험, 사용 각질 세포는 더 이상 통과 6.보다 해리는 37 ° C에서 2-5 분 동안 잘 당 0.25 % 트립신 1 ml의 단일 세포 현탁액에 각화 없습니다. 혈청 함유 매체 (예를 들어, FBS 배지)의 1 ml의 트립신 불활 및 15 ㎖의 튜브에 수집한다.
- 각질 세포 배지에서 200 XG와 재현 탁 세포에서 3 분 동안 원심 분리기 세포. 젤라틴 화 판 O / N 잘 플레이트 당 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 각질.
- 다음 날 (0 일)에서 세포 50-60 %의 합류 있는지 확인하기 위해 판을 확인합니다.
참고 : 각질 세포가 ~ 50 %의 합류가 아니라 형질 전환 후 성장하지 않을 수보다 작은 경우. - 0 일에, 2 μg의 총 플라스미드 DNA에 8 ㎕를 형질 전환 시약의 비율을 이용하여 각질 세포에서 에피 좀 벡터의 재 프로그래밍 형질 전환을 수행한다.
- 4 플라스미드 (pCXLE-eGFP는, pCXLE-hOct3 / 4 shP53F, pCXLE - HSK, pCXLE - 훌)의 각각 0.5 μg의를 타고 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM) 100 ㎕에 희석.
주 : 플라스미드 pCXLE-eGFP는 각질 세포는 형질에서 효율을 모니터링하기 위해 사용되며, 성공적 프로그래밍에 필요한 것은 아니다. - 희석 된 DNA와 형질 전환 시약의 8 μl를 추가합니다. 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. DNA 반응 혼합물을 실온에서 15 분 동안 휴식을 흐트러 허용.
- 신선한 매체와 각질 세포 매체를 교체합니다.
- 부드럽게 4 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃ 배양기에서 배양 각질 DNA 반응 혼합물을 추가 배양한다.
참고 : 그것은 그들이 낮은 생존 후 형질을 나타내는으로 각질 세포에 장기간 형질 전환 O / N을 수행하지 않는 것이 좋습니다. - 4 시간 포스트 형질 전환 한 후, 신선한 매체와 각질 세포 매체를 교체합니다.
- 4 플라스미드 (pCXLE-eGFP는, pCXLE-hOct3 / 4 shP53F, pCXLE - HSK, pCXLE - 훌)의 각각 0.5 μg의를 타고 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM) 100 ㎕에 희석.
- 1 일에 (1 일 이후 트랜스fection), 각질 세포 배지를 변경하고, 형광 현미경 하에서 eGFP는 양성 세포의 비율을 추정하여 형질 감염 효율을 확인한다. 전형적> 60~70% 형질 효율이 프로토콜을 이용하여 일차 각질 세포에 대해 관찰된다.
- 단계 3.5의 설명에 따라 2 일에서 형질를 반복합니다. 두 개의 연속 된 형질 감염은 일반적으로> 90 %의 형질 전환 효율을 달성하는 것이다. 각질 세포 문화는 일반적으로 두 번째 형질의 말에 합류에 도달한다.
- 각 프로그래밍 반응에 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 피더 10cm 접시를 준비합니다. 이전 18 설명 된대로 mitotically 불 활성화 MEF 피더를 준비합니다.
- 프리 코트를 적어도 20 분 동안 0.1 % 젤라틴을 5 ml와 10cm 접시. FBS 배지에서 10cm 접시 당 플레이트 4 × 10 6 mitotically 비활성화 MEF. 세포가 정착 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 O / N을 첨부 할 수 있습니다.
- 3 일에, HAR단계 3.2 및 3.3에 설명 된대로 0.25 % 트립신과 각질을 가득. KSR 배지에서 각질 세포를 재현 탁하고 KSR 배지 MEF 10cm 접시에 피더 6 웰 플레이트의 한 웰에서 각질 세포의 90 %를 접시.
- 이후 4 일부터 매일 KSR 매체를 변경합니다.
- 또한 18 일 후, 모든 둘째 날 문화 매체를 교체합니다.
참고 : 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 닮은 정의 된 경계와 hiPSC 식민지가 날 14에서 등장 반면 비 재 각질 세포가 증식 중단됩니다 - (21).
- 또한 18 일 후, 모든 둘째 날 문화 매체를 교체합니다.
- 이후의 날 (21)로부터 수동 절개로 hiPSC 식민지를 분리합니다. 긴밀 클러스터 만 명확하게 다른 사람에서 분리 hiPSC 식민지를 선택하고 있습니다 hiPSC 식민지를 피하십시오.
참고 : hiPSC 식민지 이전 포착 할 수 있지만 정의 된 경계와 식민지 작은 식민지 크기 주어진 이전 시점에서 명확하지 않을 수 있습니다. 재 프로그래밍 효율은 DIFF에 따라 다를 수 있습니다erent 환자의 각질 세포 및 또한 이러한 통로 번호 또는 각질 세포의 증식 속도와 같은 다른 요인들에 의해 영향을 받는다.- hiPSC 식민지의 수동 해부를 들어, 해부 현미경 hiPSC 식민지를 잘라 26G 바늘을 사용합니다. 길이 600 μm의 - (300)의 주위에 작은 조각으로 hiPSC 식민지를 잘라. hiPSCs의 클론 라인을 설정하는 새로운 MEF 공급 판 (2.5 × 10 4 MEF / ㎠)로 한 hiPSC 식민지에서 조각을 전송합니다. 처음에, 문화는 12 웰 플레이트 또는 기관 배양 요리 잘 하나에 각 hiPSC 클론 라인은 다음 6 웰 플레이트 형식으로 확장합니다.
- MEF 피더에 KSR 매체에 hiPSCs의 설립 클론 라인을 유지한다. 문화 일단 70에 도달 - hiPSC 식민지와 80 %의 포화 상태 ~ 직경 1.5 mm, 제조업체의 지시에 따라 표준 효소 계대 방법 (Accutase, 스파 아제 (Dispase) 또는 콜라게나 IV)를 사용하여 통과 hiPSCs.
- 설립 hiPSC 라인을 특성화S는 만능과 시험 관내 및 / 또는 생체 내 13, 19, 21, 23의 3 배엽 세포의 대표로 분화 할 수있는 능력을 확인합니다. 또한, 시판 키트를 사용하여 마이코 플라스마 정기적으로 설립으로 테스트합니다 hiPSC 라인은 무균 있는지 확인합니다. 정기적으로 핵형 또는 어레이 기반 복제 수 변이 (CNV) 분석에 의한 hiPSC 라인의 게놈 안정성을 모니터링 할 수 있습니다.
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Representative Results
성장기 (성장 단계), 퇴행기 (회귀 상) 및 휴지기 (나머지 상) (20, 21) : 머리는 3 가지 성장주기의 단계를 통해 간다. 성장기 모낭은 상피 세포의 여러 계층을 포함, 이들 층은 ORS, IRS 및 모간 (도 1)를 포함한다. 성장기의 머리는 결국 ORS 헤어 샤프트 차별화 종료의 사멸로 표시됩니다 퇴행기 단계로 전환 겪는다. 마지막으로, 세포 사멸의 멈추고 휴지기 모낭이 휴지기 특성과 정지가되는 휴지기 단계에 퇴행기 모발 전환 (20, 21)를 팽창.
그림 1은 휴지기 머리와 성장기 모발의 형태를 보여줍니다. 우리는 일반적으로 각질 세포의 유도를위한 성장기 머리를 사용합니다. 이 프로토콜에 따라, 각질 세포의 outgrowths은 빠르면 3 일 정도 머리 부착 (그림 2A) 후에 관찰 할 수 있으며 페이지에 계속roliferate (그림 2B). 우리의 경험에 의하면, 일부 성장기 머리카락은 첨부하거나 각질 세포 부산물을 준수하지 못할 수 있습니다; 성공적인 각질 세포의 분리를 보장하기 위해 각 10 성장기 모발 - 따라서 적어도 5를 수집합니다. 그 후, 각질 세포는 새로운 플레이트에 계대 복수의 통로 (도 2c)에 대해 유지 될 수있다. 그것은 KSR 매체 마트 리겔에 비해, 제 2 항에 기재된 바와 같이 각질 매질과 코팅 행렬에 각질 세포를보다 효율적으로 성장이 있음을 주목하는 것이 중요하다.
팽창 후, 각질 세포 리 프로그래밍 32 일 후에 부 (3)도 3a에 전형적인 각화 세포 - 유래 hiPSC 콜로니를 도시 한 바와 같이 hiPSCs를 생성하도록 재 프로그램 될 수있다. 그것은 hiPSC 콜로니의 중심에서 약간의 분화를 관찰하는 것이 일반적이다. 일단 수동으로 포착, 파생 hiPSCs는 일반적으로 세포질 비율과 결합 정의 식민지 높은 핵을 표시진 (그림 3B). 이러한 다 능성 마커 OCT4, NANOG 및 TRA-160 (도 3C-E)의 식으로, 이전에 기술 된 바와 같이 13, 19 hiPSCs의 설립 세포주는 다 능성 대해 특성화 될 수있다.
그림 1. 다른 성장 단계에서 뜯어 낸 머리카락의 대표 이미지. (A) 다이어그램은 성장기 또는 휴지기 단계에서 머리카락을 설명. (B) 및 휴지기 단계 (C) 상에 성장기 모발을 뽑아 나타내는 위상차 이미지. HS = 머리 샤프트; 국세청 = 내부 루트 칼집; ORS = 외부 루트 시스. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
뽑아 머리의 그림 머리 유래 각질 세포의 2. 대표 이미지. 위상차 이미지는 (A) 3 일 (B) 십일 위해 아래로 도금. 흰색 화살표는 뽑아 머리에서 각질 세포의 가지를 표시합니다. 계대 후 일반적인 조약돌 형태와 3 일 각질 세포 배양의 (C) 위상 대비 이미지. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 각질 세포에서 파생 된 hiPSCs 3. 대표 이미지. 각질 세포 유래 hiPSC 공동 보여주는 일 32 재 프로그래밍 문화의 (A) 위상 콘트라스트 이미지lony. (B)는 수동으로 인간 배아 줄기 세포와 유사한 형태로 각질 세포에서 파생 된 hiPSCs을 선택했습니다. 만능 마커 (C) NANOG와 (D) OCT4와 함께 hiPSCs의 면역 염색 (E) 각질 세포에서 파생 된 hiPSCs에서 TRA-160. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
환자 별 hiPSCs의 생성은 시험관 내에서 질환 세포 유형의 발병 기전 연구를위한 독특한 방법을 제공하고, 또한 질환의 표현형을 구출 할 신규 한 분자를 식별하는 약물 스크리닝에 대한 플랫폼을 제공한다. hiPSCs를 이용하여 질병이 모델링 접근법은 긴 QT 증후군, 헌팅 톤병, 파킨슨 질환 및 근 위축성 측삭 경화증 (22)을 포함하여 다양한 질환에 대한 유망한 결과를 수득했다. 여러 이니셔티브는 이미 미국, 유럽, 호주, 중국, 한국, 일본 (23, 24)에 컨소시엄을 포함하여 환자 별 hiPSCs의 대규모 라이브러리를 구축 할 진행되고있다.
여기서 헤어 유래 케 라티노 사이트에서 hiPSCs을 확립 프로토콜 촉진하고 질병 특정한 hiPSCs의 대규모 라이브러리의 구축을 빠르게 추적 할 수있는 잠재력을 가지고있는 기재되어있다. 우선, 에피 솜 :이 프로토콜은 두 개의 이점을 제공한다이 프로토콜에 사용되는 시스템은 여섯 프로그래밍 요소의 칵테일을 사용하여 통합없는 hiPSCs를 생성 (OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, p53에 대한 shRNA를) 상대적으로 높은 효율을 4. 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 - 매개 된 리 프로그래밍 방법에 비해, 에피 솜 벡터의 사용은 재 프로그래밍시 외래 유전자의 바람직하지 않은 게놈 통합을 피할 수있다. 따라서, 많은 노력과 같은 대규모 hiPSC 라이브러리의 구축을위한 통합 무 리 프로그래밍 방법의 사용을 선호 에피 솜 벡터, 통합 프로그래밍 방법 (23)를 통해 센다이 바이러스 또는 mRNA를,.
둘째, 머리는 쉽게 접근 및 침입 절차의 사용 또는 의료 직원의 출석없이 환자 스스로를 수확 할 수있다. 이 각질 세포의 유도 및 후속 프로그래밍을위한 실험실로 자신의 머리카락 샘플에서 독특한 수집하는 다른 지역의 환자에 대한 기회와 메일을 제공합니다. 이 전략의 타당성을 지원, 우리의 출판되지 않은 데이터는 각질 세포가 성공적으로 최대 10 일 동안 4 ℃에서 보관 하였다 발현 악기 머리에서 분리 될 수 있음을 나타냅니다.
여기에 설명 된 방법은 뽑아 머리에서 각질 세포의 유도를 허용합니다. 케 라티노 사이트는 단지 하나의 모발로부터 유도 될 수 있지만, 우리는 추천 각화 유도하기위한 적어도 5 성장기 모발을 수집하는 것이다. 이 프로토콜의 한 제한은 털이 잘 연결되지 않을 수 있으며 각질 세포가 성장하는 데 실패 할 수 있다는 것입니다. 두꺼운 머리는 좋은 머리를 첨부 부동 방지하고 강화하기 위해 도금 동안 배양 배지의 감소 금액을 요구하면서, 더 나은 연결하는 경향이있다. 각질 세포가 유도되면, 그것은 확장 표준 느린 냉동 냉동 보존 방법 (16)을 이용하여 주식을 동결하는 것이 좋습니다. 각화 세포의 후속 프로그래밍이 프로토콜에 기재된 다음과 같이 수행 될 수있다. 그것은 중요하다감소 리 프로그래밍 효율이 늦은 통로에서 관찰하여 세포가 세포 노화 25-27 도달로 출발 세포의 증식 속도가, 리 프로그래밍의 효율에 영향을 미칠 수 있음에 유의. 이와 관련하여, 늦어도 프로그래밍 실험을위한 통로 (6)보다 각질 세포를 사용하지 않습니다. 또한, 프로그래밍의 효율성은 다른 개인의 각질 세포 사이에 차이가있을 수 있습니다.
최근의 연구는 ~와 함께, 게놈 (29)에 체세포 CNVs 것으로보고 피부 섬유 아세포의 30 %를 체세포 조직 (28)의 여러 유형에 널리 유전 염색체를 제안한다. 이 CNVs는 DNA 복제, DNA 복구 또는 트랜스포존 동원의 오류가 발생할 수 있습니다. 이는 피부에 장기간 UV 노출 섬유 아세포 및 각질 세포를 포함한 상피 세포에서 추가 CNVs을 일으킬 수 있다는 것도 가능하지만,이 정도는 잘 알려져 있지 않다. 케 라티노 사이트에서 CNVs가 재 프로그래밍 과정을 통해 수행 될 수있는 바와 같이, 이는 IM이고으로 중요은 설립 hiPSCs는 게놈 안정성을 유지하도록 루틴 핵형 또는 CNV 분석을 수행 할 수 있습니다. 요약하면, 여기에 우리가 질병 모델링 및 재생 의학에 사용될 수 있습니다 머리 유래 각질 세포에서 hiPSCs의 생성을위한 절차를 설명했다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
- Fuchs, E.
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M.
- Alonso, L., Fuchs, E.
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
