Introduction
Upptäckten av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) har revolutionerat området för regenerativ medicin, vilket ger en möjlig metod för att generera patientspecifika stamceller 1-3. hiPSCs har framgångsrikt genereras från olika somatiska celltyper, inklusive fibroblaster 4,5, hematopoetiska celler 6,7, njur epitelceller från urin 8 och keratinocyter 9,10. Hittills hudfibroblaster och hematopoetiska celler representerar de mest använda källorna cell för alstring av patientspecifika iPSCs. Förmodligen beror detta på det faktum att huden biopsier och blodinsamling är rutinmässiga medicinska procedurer och stora biobanker patient blod- eller hudprover har fastställts i många länder.
I motsats till blodkroppar och huden fibroblast som kräver invasiva metoder för extraktion, keratinocyter representerar en lättillgänglig celltyp för hiPSC generation. Keratinocytes är keratin-rika epitelceller som bildar den yttre epidermala barriären i huden och är även hittats i naglar och hår 11. I synnerhet kan keratinocyter hittas på den yttre rotskidan (ORS) av hårsäckar, en extern cellulär skikt som täckte hårstrået tillsammans med inner rotskidan (IRS) celler (12, figur 1). Eftersom hår kollektionen är en enkel procedur som inte kräver hjälp av medicinsk personal, ger det en möjlighet för patienter att samla in och skicka sina egna hårprover till laboratorier, som i hög grad skulle underlätta insamlingen av patientprover för hiPSC generation. Epidermala keratinocyter har också en högre omprogrammering effektivitet och snabbare omprogrammering kinetik jämfört med fibroblaster, lägga till fördelarna med att använda keratinocyter som start celler för hiPSC generation 9,13. Dessutom kan hiPSCs även genereras med hjälp av andra cellpopulationer i hårsäcken,inklusive dermalpapillen cellerna placerade vid basen av hårsäcken 14,15.
Tidigare rapporter IPSC generation använder hår-härledda celler utnyttjar ofta retrovirala eller lentivirala baserade omprogrammering metoder 9,14,15. Dessa virala metoder införa oönskad genomisk integrering av utländska transgener under omprogrammering. I jämförelse, användning av episomala vektorer representerar en möjlig, icke-viral omprogrammering metod för att generera integrationsfria iPSCs 4. Vi har tidigare utvecklat en enkel, kostnadseffektiv och icke-virala metod för att på ett effektivt sätt programmera keratinocyt i hiPSCs använder episomala vektorer 13. Här ger vi ett detaljerat protokoll för alstring av keratinocythärledda hiPSCs, inklusive härledning av keratinocyter från plockade hår, expansion och underhåll av keratinocyterna och efterföljande omprogrammering för att generera hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Insamlingen av människohår prov från individer kräver etiskt godkännande av den mänskliga forskningsetisk kommitté i värd institutionerna och bör göras i enlighet med de institutionella riktlinjer.
1. Isolering av keratinocyter från Knäpp Hår
- Tina Extracellular Matrix (ECM) lösning (dvs Matrigel) på is O / N.
- Använda för-kylda pipettspetsar, tillsätt 200 | il ECM-lösning till 12 ml kyld DMEM / F12-medium. Coat en 12-brunnar med 1 ml utspädd ECM-lösning i varje brunn. Inkubera den belagda plattan O / N vid 37 ° C. Tvätta den belagda plattan med förvärmda DMEM / F12-medium före användning.
- Samla primära människohår från individens huvud genom att placera fingrarna nära roten av håret och plockning håret i en snabb och smidig rörelse. Kontrollera för att bekräfta att varje insamlad hår innehåller en intakt hårsäcken och bestämma tillväxtfasen av håret under ett dissektionsmikroskop (figur 1).
- Samla 5-10 anagena hårstrån från varje individ för att extrahera keratinocyter. Process plockade hårstrån så snart som möjligt för att säkerställa ett framgångsrikt härledning av keratinocyter.
OBS: Figur 1 visar morfologin av hår i olika faser av tillväxtcykeln. Anagen hår är i tillväxtfasen, med en synlig yttre skikt av epitel kring längden på håret, känd som ORS. Å andra sidan, representerar telogen hår i vilofasen och inte har en synlig ORS, men har en tydlig boll av celler som täcker roten av håret, känd som telogen bula.
- Samla 5-10 anagena hårstrån från varje individ för att extrahera keratinocyter. Process plockade hårstrån så snart som möjligt för att säkerställa ett framgångsrikt härledning av keratinocyter.
- Placera hårprover i en petriskål innehållande 10 ml Antibiotic Mix att tvätta i 5 minuter vid RT.
- Använda steriliserade sax och pincett, avskurna överdriven hårstrået, lämnar ett hår fragment med en intakt hårsäck och omkring 0,5-1 cm hårstrået.
- Noggrant transfer en hår-fragmentet i varje brunn i ECM-belagda plattan med hjälp av pincett.
- Med hjälp av en 1 ml pipett, tillsätt ca 3 droppar Knockout Serum Byte (KSR) medium (~ 100-200 il) till hårprover.
Obs: Håll håret fragment i nära kontakt med plattans yta för att möjliggöra fastsättning och efterföljande keratinocyt utväxt. Lägga driven media vid detta steg kan orsakar håret fragmenten att flyta och minskar risken för framgångsrik hår fäste. - Inkubera de hårstråprov i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 och tillåta hårsäckarna att fästa O / N. Dagen därpå, försiktigt lägga ytterligare 3 droppar KSR medium (~ 100-200 l) för att hålla hårprover fuktig.
- Observera hårprover dagligen för att bekräfta att hårsäckarna har fäst framgångsrikt. Generellt fastsättning av hårsäckarna är påtaglig inom 1-3 dagar. Tjocka hår är oftast lättare att fästa jämfört med fina hår, som fina hår har högretendens att flyta som hindrar fästprocessen.
- När håret har fäst till den belagda plattan, tillsätt 500 | il av KSR medium till brunnen. Var extra försiktig när du lägger mediet som hårprover kanske inte har fäst ordentligt. Från denna punkt, ändra media varje 2 dagar.
Obs: Keratinocyt utväxter ska vara synlig från ORS regionen håret fragment efter 3-7 dagar (Figur 2A-B). Låt keratinocyterna att växa upp till 14 dagar innan passage cellerna som beskrivs i nästa avsnitt.
- När håret har fäst till den belagda plattan, tillsätt 500 | il av KSR medium till brunnen. Var extra försiktig när du lägger mediet som hårprover kanske inte har fäst ordentligt. Från denna punkt, ändra media varje 2 dagar.
2. Underhåll och Passaging av keratinocyter
- Förbeläggning en 6-brunnsplatta med användning av beläggningsgrundmassa Kit. Lägg 680 ul av utspädningsmediet ur satsen till varje brunn, följt av 6,8 pl Coating Matrix-lösning. Skaka plattan för att säkerställa likformig fördelning av beläggningsmatrislösningen på plattan.
- Tillåt den belagda plattan inkubera under 30 min vid RT. Avlägsnaden Coating Matrix lösningen före plätering av keratinocyter.
- Dissociera keratinocyter till en enda cellsuspension med 500 ul av 0,25% trypsin per brunn för 2-5 minuter vid 37 ° C. Inaktivera trypsin med 500 pl medium innehållande serum (t.ex. fetalt bovint serum FBS) medium () och samla upp i ett sterilt 15 ml rör. Ta håret fragment med hjälp av steriliserade pincett.
- Bestäm antalet skördade celler genom att använda en hemocytometer.
- Centrifugera cellerna under 3 minuter vid 200 x g. Tvätta cellerna med PBS och upprepad centrifugering. Aspirera PBS och resuspendera cellpelleten i färskt Keratinocyte medium.
- Plattan 4 x 10 4 keratinocyter i en brunn av ECM-belagd platta i närvaro av Keratinocyt medium. Håll keratinocyterna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 (figur 2C). Ändra media varje dag och passageceller när kulturen är ~ 80% konfluenta, WHIlm kan ta ca 2-7 dagar beroende på passagenummer och proliferationshastighet av keratinocyterna. De härledda keratinocyter bör utvidgas till att generera tillräckliga frysta lager genom att använda standard långsamt frysa frysförvaring metoder 16.
Obs: De beskrivna odlingsbetingelser stödja utbyggnaden av homogen population av keratinocyter med typisk kullersten morfologi (Figur 2C). Ibland kan några differentierade keratinocyter, med stor och platt morfologi och har förlorat replika potential, observeras i kultur. Karakterisering av keratinocyter kan utföras genom immunfärgning med användning av antikroppar mot cytokeratin 14 såsom tidigare beskrivits 17. Etablerade keratinocyt cellinjer bör också testas för mykoplasma efter 1-3 passager med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit.
3. Framställning av hiPSCs från keratinocyter Använda episomala vektorer
- Förbeläggning en 6-brunnsplatta med0,1% gelatin (2 ml / brunn). Låt gelatin för att belägga åtminstone 20 minuter vid RT.
- För omprogrammering experiment använda keratinocyter senast passagen 6. dissociera keratinocyter in i en enkelcellsuspension med 1 ml av 0,25% trypsin per brunn under 2-5 min vid 37 ° C. Inaktivera trypsin med 1 ml medium innehållande serum (t.ex. FBS media) och samla upp i en 15 ml tub.
- Centrifugera cellerna för tre minuter vid 200 xg och återsuspendera cellerna i Keratinocyt medium. Plate 1 × 10 5 -1,5 x 10 5 keratinocyter per brunn i en gelatinerad platta O / N.
- På följande dag (dag 0), kontrollera plattan för att säkerställa celler är 50-60% sammanflytande.
Obs: Om keratinocyter är mindre än ~ 50% konfluenta de kanske inte växer bra efter transfektion. - På dag 0, utföra transfektion av episomala omprogrammering vektorer på keratinocyterna, med användning av ett förhållande av 8 pl transfektionsreagens till 2 | j, g totalt plasmid-DNA.
- Ta 0,5 mikrogram för var och en av de fyra plasmiderna (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-hul) och späd i 100 pl av minskade serum medium (t.ex., OPTI-MEM).
Obs: Plasmiden pCXLE-EGFP används för att övervaka transfektionseffektivitet i keratinocyter och krävs inte för framgångsrik omprogrammering. - Lägg 8 pl av transfektionsreagens till den utspädda DNA. Blanda genom att ställa röret. Låt DNA-reaktionsblandningen för att vila ostörd vid RT under 15 minuter.
- Byt ut Keratinocyt medium med färskt medium.
- Försiktigt till DNA reaktionsblandningen för att keratinocyt kulturen och inkubera i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 4 timmar.
OBS: Det är inte rekommenderat att utföra långvarig transfektion O / N i keratinocyter som de uppvisar låg överlevnad efter transfektion. - Efter 4 timmar efter transfektion, byt ut Keratinocyt medium med färskt medium.
- Ta 0,5 mikrogram för var och en av de fyra plasmiderna (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-hul) och späd i 100 pl av minskade serum medium (t.ex., OPTI-MEM).
- På dag 1 (en dag efter trans-fection), ändra keratinocyt mediet och kontrollera transfektionseffektiviteten genom att uppskatta andelen EGFP positiva celler under ett fluorescerande mikroskop. Typiskt> 60-70% transfektionseffektivitet observeras för primära keratinocyter som använder detta protokoll.
- Dag 2, upprepa transfektion som beskrivs i steg 3,5. Två transfections rad typiskt uppnå> 90% transfektionseffektivitet. Keratinocyte kulturen når vanligen sammanflödet i slutet av den andra transfektion.
- Förbered en 10 cm skål av mus embryonala fibroblaster (MEF) matare för varje omprogrammering reaktion. Förbered mitotiskt inaktiverade MEF matare som tidigare beskrivits 18.
- Förbeläggning en 10 cm skål med 5 ml av 0,1% gelatin i minst 20 minuter. Plate 4 × 10 6 mitotiskt inaktiv MEF per 10 cm skål i FBS medium. Låt cellerna sedimentera och fästa O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Dag 3, harvästen keratinocyterna med 0,25% trypsin som beskrivs i steg 3,2 och 3,3. Resuspendera keratinocyterna i KSR medium och plattan 90% av keratinocyter från 1 brunn i en 6-brunnar i en 10 cm MEF matare skålen med KSR medium.
- Från dag 4 och framåt ändrar KSR medellång varje dag.
- Alternativt efter dag 18, byt odlingsmedium varannan dag.
Obs: Icke-omprogrammeras keratinocyter kommer att upphöra att föröka sig, medan hiPSC kolonier med definierad gräns som liknar mänskliga embryonala stamceller (hESCs) kommer att dyka upp från dag 14-21.
- Alternativt efter dag 18, byt odlingsmedium varannan dag.
- Isolera hiPSC kolonier genom manuell dissektion från dag 21 och framåt. Undvik hiPSC kolonier som är nära grupperade tillsammans och bara plocka hiPSC kolonier som är klart avgränsade från andra.
Obs: hiPSC kolonier kan plockas tidigare, men kolonin med definierade gränser kanske inte är självklar vid tidigare tidpunkter med tanke på den lilla kolonistorlek. Omprogrammering effektiviteter kan variera mellan difftekniker när patientens keratinocyter, och påverkas också av andra faktorer, såsom passagenummer eller proliferationshastighet av keratinocyter.- För manuell dissektion av hiPSC kolonier, använd en 26G nål för att skära hiPSC kolonier under ett dissektionsmikroskop. Skär en hiPSC koloni i små bitar runt 300-600 nm i längd. Överför bitar från en hiPSC koloni till en ny MEF matare plattan (2,5 × 10 4 MEF / cm2) att upprätta en klonal linje av hiPSCs. Inledningsvis kultur varje hiPSC klon linje i en brunn på en 12 brunnar eller organodlingsskålar, sedan expandera till 6 brunnar format.
- Behåll etablerade klonala linjer av hiPSCs i KSR medium på MEF matare. När kulturen når 70-80% konfluens med hiPSC kolonier ~ 1,5 mm i diameter, passage hiPSCs användning av standard enzymatiska passage metoder (Accutase, dispas eller kollagenas IV) enligt tillverkarens anvisningar.
- Karaktärisera etablerade hiPSC linjear för att bekräfta pluripotens och deras förmåga att differentiera till celler representativa för de tre germinallager in vitro och / eller in vivo 13,19. Dessutom, för att rutinmässigt testa etablerade hiPSC linjer för mykoplasma med användning av kommersiellt tillgängliga kit att de är patogen fria. Rutinmässigt övervaka genomisk stabilitet hiPSC linjer genom karyotypning eller array-baserade antal kopior variation (CNV) analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Håret går igenom 3 olika faser av tillväxt cykel: anagen (tillväxtfasen), katagen (regressionsfasen) och telogen (vilofasen) 20,21. Den anagena hårsäcken innehåller flera skikt av epitel; dessa skikt inkluderar ORS, IRS och hårstrået (Figur 1). Anagen hår genomgår så småningom övergå till catagen fasen, som kännetecknas av apoptos av ORS och uppsägning av hårstrået differentiering. Slutligen katagen hår övergången till telogen fas, där apoptos upphör och telogen follikelstimulerande blir vilande med en karakteristisk telogen bula 20,21.
Figur 1 illustrerar morfologin hos en telogena hår och ett anagent hår. Vi använder vanligtvis anagen hår för keratinocyt härledning. Efter detta protokoll, kan observeras keratinocytceller utväxter så tidigt som 3 dagar efter håret fäste (Figur 2A) och kommer att fortsätta att proliferate (Figur 2B). I vår erfarenhet, kan vissa anagena hårstrån inte bifoga eller underlåter att iaktta keratinocyt utväxt; alltså samla åtminstone 5 - 10 anagena hårstrån från varje individ för att säkerställa en framgångsrik keratinocyt isolering. Därefter kan keratinocyterna passe på en ny plåt och hölls där under flera passager (Figur 2C). Det är viktigt att notera att det finns bättre tillväxt av keratinocyter på en beläggning Matrix med Keratinocyt medium som beskrivits i avsnitt 2, jämfört med Matrigel med KSR medium.
Efter expansion kan keratinocyterna omprogrammeras för att generera hiPSCs som beskrivs i avsnitt 3. Figur 3A visar en typisk keratinocythärledda hiPSC koloni efter 32 dagars omprogrammering. Det är vanligt att observera en viss differentiering i centrum för den hiPSC kolonin. När manuellt plockas av härledda hiPSCs visar vanligtvis hög kärna till cytoplasma förhållande och en definierad koloni bundenAry (figur 3B). Etablerade cellinjer av hiPSCs kan sedan karakteriseras för pluripotens såsom beskrivits tidigare 13,19, såsom uttrycket av pluripotenta markörer Oct4, Nanog och TRA-160 (Figur 3C-E).
Figur 1. Representant bilder av plockade hårstrån på olika tillväxtfaser. (A) Diagram som visar hårstrån i anagen eller telogen fas. Fas kontrastrika bilder som visar en plockade hår i (B) telogen fas och (C) anagenfasen. HS = hårstrået; IRS = Inre rotskidan; ORS = Yttre rotskidan. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant bilder av hår härrörande keratinocyter. Fas kontrastrika bilder av en plockad hår pläterad ner för (A) 3 dagar och (b) 10 dagar. Vita pilar markerar utväxt av keratinocyter från en plockad hår. (C) Faskontrast bilden av Dag 3 keratinocyt kultur med en typisk kullersten morfologi efter passage. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa bilder av keratinocythärledda hiPSCs. (A) Faskontrast bild av en dag 32 omprogrammering kultur visar en keratinocythärledda hiPSC coLony. (B) manuellt valda keratinocythärledda hiPSCs med morfologi liknar hESCs. Immunfärgning av hiPSCs med pluripotenta markörer (C) NANOG och (D) Oct4 och (E) TRA-160 i keratinocythärledda hiPSCs. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generation av patientspecifika hiPSCs erbjuder en unik metod för att studera patogenesen i sjuka celltyper in vitro, och ger också en plattform för läkemedelsscreening för att identifiera nya molekyler som kan rädda fenotyperna sjukdomstillstånd. Denna sjukdom modellering med hjälp av hiPSCs har gett lovande resultat för en mängd olika sjukdomar, inklusive långt QT-syndrom, Huntingtons sjukdom, Parkinsons sjukdom och amyotrofisk lateralskleros 22. Flera initiativ har redan inletts för att fastställa storskaliga bibliotek av patientspecifika hiPSCs, inklusive konsortier i USA, Europa, Australien, Kina, Sydkorea och Japan 23,24.
Här ett protokoll för att etablera hiPSCs från hår härrörande keratinocyter beskrivs som har potential att underlätta och snabba spår inrättandet av storskaliga bibliotek av sjukdomsspecifika hiPSCs. Detta protokoll ger två fördelar: För det första, den episomalasystem som används i detta protokoll genererar integrationsfria hiPSCs med en cocktail av sex omprogrammering faktorer (Oct4, Sox2, Klf4, L-MYC, LIN28, shRNA för p53) vid relativt hög verkningsgrad 4. Jämfört med retroviral eller Lentiviral-medierad omprogrammering metoder, användning av episomal vektor undviker oönskad genomisk integrering av utländska transgener under omprogrammering., Därför många initiativ främja användningen av integrationsfria omprogrammering metoder för etablering av storskalig hiPSC bibliotek, såsom episomala vektorer, Sendai-virus eller mRNA, över integrativa omprogrammering metoder 23.
För det andra är håret lättillgänglig och kan skördas av patienterna själva utan användning av invasiva procedurer eller närvaro av medicinska personal. Detta ger en unik möjlighet för patienter från olika regioner för att samla in och e-post i sitt eget hår proverna till laboratoriet för keratinocyt härledning och efterföljande omprogrammering. Till stöd för genomförbarheten av denna strategi, våra opublicerade data tyder på att keratinocyter framgångsrikt kan isoleras från plockade hår som förvarades vid 4 ° C i upp till 10 dagar.
Den metod som beskrivs här kommer att tillåta härledning av keratinocyt från plockade hår. Medan keratinocyter kan härledas från bara ett enda hårstrå, är vår rekommendation att samla minst 5 anagena hårstrån för keratinocyt härledning. En begränsning av detta protokoll är att några hårstrån inte kan fästa bra och keratinocyterna kan misslyckas med att växa. Tjockare hår tenderar att fästa bättre, medan fina hår kräver reducerad mängd av kulturmedium under pläteringen att undvika flytande och förbättra fastsättning. När keratinocyter härrör, är det lämpligt att utöka och frysa ned lagren med hjälp av standard långsamt frysa frysförvaring metoder 16. Efterföljande omfördelningar av keratinocyter kan utföras följande steg som beskrivs i detta protokoll. Det är viktigt attObservera att spridningen hastigheten av utgångsceller kan påverka omprogrammering effektivitet, med minskad omprogrammering effektivitet observerades i slutet av passager som cellerna når cellulärt åldrande 25-27. I detta avseende använder keratinocyter senast passage 6 för omprogrammering experiment. Dessutom kan omprogrammering effektivitet varierar mellan olika individers keratinocyter.
Nyligen genomförda studier tyder på omfattande genetisk mosaicism i flera olika typer av somatiska vävnader 28, med ~ 30% av hudfibroblaster rapporteras ha somatisk CNVs i genomet 29. Dessa CNVs kan orsakas av fel i DNA-replikation, DNA-reparation eller transposon mobilisering. Det är också möjligt att långvarig UV-exponering på huden kan orsaka ytterligare CNVs i epidermalceller inklusive fibroblaster och keratinocyter, men omfattningen av detta är inte känd. Som CNVs i keratinocyter kommer att föras över under omprogrammering processen, är det imtigt att utföra rutin karyotypning eller CNV analys för att se till att de etablerade hiPSCs upprätthålla genomisk stabilitet. Sammanfattningsvis, här har vi beskrivit förfaranden för generering av hiPSCs från hår härrörande keratinocyter, som kan användas för sjukdomsmodellering och regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
- Fuchs, E.
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M.
- Alonso, L., Fuchs, E.
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
