Introduction
Oppdagelsen av menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) har revolusjonert innen regenerativ medisin, og gir en mulig metode for generering av pasientspesifikke stamceller 1-3. hiPSCs har blitt generert fra ulike somatiske celletyper, inkludert fibroblaster 4,5, hematopoetiske celler 6,7, nyre epitelceller fra urin 8 og keratinocytter 9,10. Til dags dato, hudfibroblaster og blodkreft cellene representerer de mest brukte celle kilder for å generere pasientspesifikke iPSCs. Uten tvil, dette er på grunn av det faktum at huden biopsier og blodprøvetaking er rutinemessige medisinske prosedyrer og store biobanker av pasientens blod eller hud prøver har blitt etablert i mange land.
I motsetning til blodceller og hud-fibroblast som krever invasive ekstraksjonsmetoder, keratinocytter representerer en lett tilgjengelig celletype for hiPSC generasjon. Keratinocytes er keratin-rik epitelceller som danner den ytre epidermal barriere på huden, og er også funnet i negler og hår 11. Spesielt kan keratinocytter finnes på den ytre rot skjede (ORS) av hårsekkene, et ytre cellelag som dekket håret sammen med den indre rot skjede (IRS) celler (12, figur 1). Som håret kolleksjonen er en enkel prosedyre som ikke krever hjelp fra medisinsk personell, gir det en mulighet for pasienter å samle inn og sende sine egne hårprøver til laboratorier, som i stor grad vil lette innsamling av prøver for hiPSC generasjon. Epidermale keratinocytter har også en høyere effektivitet og omprogrammering raskere reprogrammerings-kinetikk i forhold til fibroblaster, og legger til fordelene ved å bruke keratinocytter som utgangsceller for hiPSC generering 9,13. Videre kan hiPSCs også genereres ved å bruke andre cellepopulasjoner i hårsekken,inkludert dermal papilla celler lokalisert i bunnen av hårsekken 14,15.
Tidligere rapporter om IPSC generasjon som bruker hair-deriverte celler utnytter ofte retrovirale eller lentiviral baserte omprogrammering metoder 9,14,15. Men disse virale metoder innføre uønsket genomisk integrering av utenlandske transgener under omprogrammering. Til sammenligning bruk av episomale vektorer som representerer en mulig, ikke-viral omprogrammering metode for å generere integrasjonsfrie iPSCs 4. Vi har tidligere utviklet en enkel, kostnadseffektiv og ikke-viral metode for å effektivt omprogrammere keratinocyte inn hiPSCs bruker episomale vektorer 13. Her har vi gi en detaljert protokoll for generering av keratinocytt-avledet hiPSCs, herunder avledning av keratinocytter fra plukket hår, utvidelse og vedlikehold av keratinocytter og påfølgende omprogrammering for å generere hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samlingen av menneskehår prøve fra enkeltpersoner krever etisk godkjenning av det menneskelige forskningsetisk komité i vertsinstitusjonene og bør gjøres i henhold til institusjonelle retningslinjer.
1. Isolering av keratinocytter fra Plucked Hair
- Tine ekstracellulær matriks (ECM) løsning (dvs. Matrigel) på is O / N.
- Ved hjelp av pre-kjølt pipettespisser, tilsett 200 mL ECM-løsningen til 12 ml avkjølt DMEM / F12 medium. Coat en 12-brønns plate med en ECM ml fortynnet oppløsning i hver brønn. Inkuber belagte plate O / N ved 37 ° C. Vask belagt plate med forvarmet DMEM / F12 medium før bruk.
- Samle primære menneskehår fra den enkeltes hode ved å plassere fingrene nær roten av håret og plukker håret i en rask og jevn bevegelse. Sjekk for å bekrefte at hver innsamlet hår inneholder en intakt hårsekken og bestemme vekstfasen av håret unDer en dissekere mikroskop (figur 1).
- Samle 5-10 anagen hår fra hver enkelt å trekke ut keratinocytter. Prosessen plukket hårene så snart som mulig for å sikre en vellykket avledning av keratinocytter.
Merknad: Figur 1 illustrerer morfologien av hår i forskjellige faser av vekstsyklusen. Anagen hår er i vekstfasen, med en synlig ytre lag av epitel som omgir lengden av håret, kjent som ORS. På den annen side, telogen hår representerer håret i hvilefasen og ikke har en synlig ORS, men har en klar ball av celler som dekker roten av håret, kjent som telogen bule.
- Samle 5-10 anagen hår fra hver enkelt å trekke ut keratinocytter. Prosessen plukket hårene så snart som mulig for å sikre en vellykket avledning av keratinocytter.
- Plasser hårprøver i en petriskål inneholdende 10 ml av antibiotikablanding for å vaske i 5 min ved RT.
- Bruke steriliserte saks og pinsett, avskåret dreven håret, og etterlater et hår fragment med en intakt hårsekken og rundt 0,5 til 1 cm av håret.
- Nøye transfer en hair fragmentet i hver brønn av ECM-belagt plate ved hjelp av pinsett.
- Ved hjelp av en 1 ml pipette, tilsett ca 3 dråper Knockout Serum Replacement (KSR) medium (~ 100-200 mL) til de hårprøver.
Merk: Hold håret fragmenter i nær kontakt til plate overflaten for å tillate festing og påfølgende keratinocyte utvekst. Legge dreven media på dette trinnet kan forårsaker håret fragmenter å flyte og minsker sjansen for vellykket hår vedlegg. - Inkuber hårprøver i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2 og la hårsekkene til å feste O / N. På den påfølgende dagen, tilsett ytterligere 3 dråper KSR medium (~ 100-200 mL) for å holde hårprøver fuktig.
- Observere hårprøver daglig for å bekrefte at hårsekkene har festet med hell. Vanligvis feste av hårsekkene er tydelig innen 1-3 dager. Tykke hår er vanligvis lettere å feste i forhold til fine hår, som fine hår har høyeretendens til å flyte som hindrer festeprosessen.
- Når håret er festet til den belagte plate tilsettes 500 mL av KSR medium til brønnen. Vær ekstra forsiktig når du legger mediet som hårprøver har kanskje ikke satt riktig inn. Fra dette punktet, endre media hver 2 dager.
Merk: keratinocytt utvekster skal være synlig fra den ORS område av håret fragment etter 3-7 dager (Figur 2A-B). Tillate keratinocytter å vokse opp til 14 dager før aging cellene som beskrevet i neste avsnitt.
- Når håret er festet til den belagte plate tilsettes 500 mL av KSR medium til brønnen. Vær ekstra forsiktig når du legger mediet som hårprøver har kanskje ikke satt riktig inn. Fra dette punktet, endre media hver 2 dager.
2. Vedlikehold og passaging av keratinocytter
- Pre-coat en seks-brønns plate med Coating Matrix Kit. Legg 680 ul av fortynningen medium fra settet til hver brønn, etterfulgt av 6,8 ul av belegg Matrix-løsning. Rist platen for å sikre jevn fordeling av belegg Matrix løsning på tallerkenen.
- Tillat den belagte platen inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur. Fjerneden Coating Matrix-løsning før plating av keratinocytter.
- Dissosiere keratinocytter til en enkelt cellesuspensjon med 500 ul av 0,25% trypsin per brønn i 2-5 minutter ved 37 ° C. Inaktivere trypsin med 500 ul medium inneholdende serum (for eksempel føtalt bovint serum (FBS) medium) og samles opp i et sterilt 15 ml rør. Fjerne hår fragment bruker sterilisert pinsett.
- Bestem antall høstet celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Sentrifuger cellene i 3 minutter ved 200 x g. Vask cellene med PBS og gjenta sentrifugering. Aspirer PBS og cellepelleten suspenderes i frisk keratinocyte medium.
- Platen ned 4 × 10 4 keratinocytter i ett godt av ECM-belagt plate i nærvær av keratinocyte medium. Hold keratinocytter i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2 (Figur 2C). Endre media hver dag og passage celler når kulturen er ~ 80% sammenflytende, WHIch kan ta omtrent 2-7 dager, avhengig av antallet og passasjen formeringshastigheten av keratinocytter. De avledede keratinocytter bør utvides til å generere tilstrekkelig frossen fisk ved hjelp av standard sakte frysing nedfrysing metoder 16.
Merk: De beskrevne dyrkningsforhold støtte utvidelse av homogen befolkning av keratinocytter med typisk brostein morfologi (Figur 2C). Av og til kan noen få differensierte keratinocytter, med stor og flat morfologi og har mistet replikativ potensial, observeres i kultur. Karakterisering av keratinocytter kan utføres av immunfarging ved hjelp av antistoffer mot cytokeratin 14 som tidligere beskrevet 17. Etablerte keratinocytt cellelinjer bør også bli testet for mycoplasma etter 1-3 passasjer bruker kommersielt tilgjengelige kit.
3. generasjon av hiPSCs fra Keratinocytter Bruke episomal vektorer
- Pre-coat en 6-brønns plate med0,1% gelatin (2 ml / brønn). Tillat gelatin for å belegge minst 20 minutter ved RT.
- For omprogrammering eksperimentet anvender keratinocytter senest passasje 6. dissociate keratinocytter til en enkelt cellesuspensjon med 1 ml av 0,25% trypsin per brønn i 2-5 minutter ved 37 ° C. Inaktivere trypsin med 1 ml medium inneholdende serum (f.eks FBS media) og samles opp i et 15 ml rør.
- Sentrifuger cellene i 3 minutter ved 200 xg og resuspender cellene i keratinocytt medium. Plate 1 × 10 5 -1,5 x 10 5 keratinocytter per brønn i en gelatinized plate O / N.
- På den påfølgende dagen (dag 0), sjekk plate for å sikre celler er 50-60% konfluent.
Merk: Hvis keratinocytter er mindre enn ~ 50% konfluent de kanskje ikke vokser godt etter transfeksjon. - På dag 0, utføre transfeksjon av episomal reprogrammerings vektorer på keratinocytter, ved hjelp av et forhold på 8 pl transfeksjon reagens til 2 ug totalt plasmid-DNA.
- Ta 0,5 mikrogram for hver av de fire plasmider (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) og fortynnet i 100 pl Redusert Serum medium (f.eks OPTI-MEM).
Merk: plasmid pCXLE-EGFP brukes til å overvåke transfeksjonseffektiviteter i keratinocytter og er ikke nødvendig for vellykket omprogrammering. - Tilsett 8 mL av transfeksjon reagens til den fortynnede DNA. Bland ved å dra røret. Tillat DNA reaksjonsblandingen for å hvile uforstyrret ved romtemperatur i 15 min.
- Bytt ut keratinocyte medium med frisk medium.
- Tilsett DNA reaksjonsblandingen til keratinocyttkulturmedium og inkuberes i et 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 4 timer.
Merk: Det anbefales ikke å utføre langvarig transfeksjon O / N i keratinocytter som de viser lav overlevelse etter transfeksjon. - Etter fire timer etter transfeksjon, erstatte keratinocyte medium med friskt medium.
- Ta 0,5 mikrogram for hver av de fire plasmider (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) og fortynnet i 100 pl Redusert Serum medium (f.eks OPTI-MEM).
- På dag 1 (1 dag post-transfection), endre keratinocyte medium og sjekke transfeksjonseffektiviteten ved beregning av prosenten av EGFP positive celler under et fluorescerende mikroskop. Vanligvis> 60-70% transfeksjonseffektivitet observeres for primære keratinocytter som bruker denne protokollen.
- På dag 2, gjentas transfeksjon som beskrevet i trinn 3.5. To påfølgende trans vanligvis ville oppnå> 90% transfeksjonseffektivitet. Keratinocyttkulturmedium når vanligvis løpet ved slutten av den andre transfeksjon.
- Forbered en 10 cm tallerken av mus embryonale fibroblast (MEF) mater for hver omprogrammering reaksjon. Forbered mitotisk inaktiv MEF matere som tidligere beskrevet 18.
- Pre-coat en 10 cm plate med 5 ml 0,1% gelatin i minst 20 min. Plate 4 × 10 6 mitotisk inaktivert MEF per 10 cm rett i FBS medium. La cellene å bosette og feste O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- På dag 3 Harinnvunnet keratinocytter med 0,25% trypsin som beskrevet i trinn 3.2 og 3.3. Suspender keratinocytter i KSR medium og plate 90% av keratinocytter fra en brønn i en seks-brønns plate inn i en 10 cm MEF mater tallerken med KSR medium.
- Fra dag 4 og utover, endrer KSR medium hver dag.
- Alternativt etter Dag 18, erstatte kultur medium annenhver dag.
Merk: Ikke-omprogrammeres keratinocytter vil slutte å spre seg, mens hiPSC kolonier med definert grense som ligner menneskelige embryonale stamceller (hESCs) vil dukke opp fra dag 14-21.
- Alternativt etter Dag 18, erstatte kultur medium annenhver dag.
- Isoler hiPSC kolonier ved manuell disseksjon fra dag 21 og utover. Unngå hiPSC kolonier som er tett gruppert sammen og bare plukke hiPSC kolonier som er klart atskilt fra andre.
Merk: hiPSC kolonier kan plukkes tidligere, men kolonien med definerte grenser kan ikke være opplagt på tidligere tidspunkt gitt den lille kolonistørrelse. Omprogrammering effektivitet kan variere mellom different pasientens keratinocytter, og påvirkes også av andre faktorer som for eksempel passasje nummer eller formeringshastigheten av keratinocytter.- For manuell disseksjon av hiPSC kolonier, bruk en 26G nål å kutte hiPSC kolonier under et dissekere mikroskop. Skjær en hiPSC koloni i små biter rundt 300-600 mikrometer i lengde. Overfør stykker fra en hiPSC kolonien inn i en ny MEF mater plate (2,5 × 10 4 MEF / cm 2) å etablere en klonal linje av hiPSCs. Utgangspunktet, kultur hver hiPSC klonal linje i en brønn av en 12 brønners plate eller organ kultur retter, deretter utvide til seks brønn plate format.
- Opprettholde etablerte klonale linjer hiPSCs i KSR medium på MEF matere. Når kulturen nå 70 - 80% confluency med hiPSC kolonier ~ 1,5 mm i diameter, passage hiPSCs bruke standard enzymatiske aging metoder (Accutase, dispase eller Kollagenase IV) i henhold til produsentens anvisninger.
- Karakter etablert hiPSC linjes å bekrefte pluripotency og deres evne til å differensiere til cellene er representative for de tre bakterie lag in vitro og / eller in vivo 13,19. Også for å rutinemessig analyserer etablerte hiPSC linjer for mycoplasma ved bruk av kommersielle kits sikre at de er patogen-fri. Rutinemessig genomisk stabilitet hiPSC linjer ved karyotyping eller matrise-basert kopiantall variasjon (CNV) analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Håret går gjennom tre forskjellige faser av vekstsyklusen: anagen (vekstfasen), catagen (regresjon fase) og telogen (resten fase) 20,21. Anagen hårsekken inneholder flere lag av epitel; disse lagene inkluderer ORS, IRS og håret (figur 1). Anagen håret til slutt gjennomgår overgang til catagenfasen, som er preget av apoptose av ORS og oppsigelse av håret differensiering. Endelig Katagen hår overgangen til telogen fase, hvor apoptose opphører og telogen hårsekken blir sovende med en karakteristisk telogen bule 20,21.
Figur 1 illustrerer morfologien til en telogen hår og en anagen hår. Vi vanligvis bruker anagen håret for keratinocyte avledning. Etter denne protokollen, kan keratinocytt utvekster observeres så tidlig som 3 dager etter håret vedlegg (Figur 2A) og vil fortsette å proliferate (figur 2B). I vår erfaring, kan enkelte anagen hår klarer å feste eller unnlater å observere keratinocyte utvekst; dermed samle minst 5 - 10 anagen hår fra hver enkelt å sikre en vellykket keratinocyte isolasjon. Deretter kan keratinocytter bli passert mot en ny plate og holdt i flere passasjer (figur 2C). Det er viktig å merke seg at det er bedre vekst av keratinocytter på en Coating Matrix med keratinocyte medium som beskrevet i kapittel 2, sammenlignet med Matrigel med KSR medium.
Etter utvidelsen kan keratinocytter omprogrammeres til å generere hiPSCs som beskrevet i kapittel 3. Figur 3A viser en typisk keratinocyte-avledet hiPSC koloni etter 32 dager med omprogrammering. Det er vanlig å observere noen differensiering ved midten av hiPSC kolonien. Når manuelt plukket, de avledet hiPSCs viser vanligvis høy kjernen til cytoplasma ratio og en definert koloni innbundetær (Figur 3B). Etablerte cellelinjer av hiPSCs kan deretter karakteriseres for pluripotency 13,19 som tidligere beskrevet, slik som uttrykket av pluripotent markører OCT4, Nanog og TRA-160 (figur 3C-E).
Figur 1. Representative bilder av rykket hår på forskjellige vekstfaser. (A) Diagram som illustrerer hår i anagen eller telogen fase. Bilder fase kontrast viser en ribbet hår i (B) telogen fase og (C) anagenfasen. HS = håret; IRS = Inner Root skjede; ORS = Ytre Root skjede. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilder av en rev hår Figur 2. Representative bilder av hår-avledet keratinocytter. Fase kontrast belagt ned for (A) 3 dager og (B) 10 dager. Hvite piler markere utvekst av keratinocyte fra en ribbet hår. (C) Fase kontrast bilde av Dag 3 keratinocyttkulturmedium med en typisk brostein morfologi etter passaging. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative bilder av keratinocytt-avledet hiPSCs. (A) Fase kontrast bilde av en Day 32 omprogrammering kultur viser en keratinocyte-avledet hiPSC coLony. (B) manuelt valgt keratinocytt-avledet hiPSCs med morfologi lik hESCs. Farging av hiPSCs med pluripotent markører (C) Nanog og (D) OCT4 og (E) TRA-160 i keratinocytt-avledet hiPSCs. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av pasientspesifikke hiPSCs tilbyr en unik tilnærming for å studere patogenesen i syke celletyper in vitro, og gir også en plattform for narkotika-screening for å identifisere nye molekyler som kan redde sykdommen fenotyper. Denne sykdommen modellering tilnærming ved hjelp hiPSCs har gitt lovende resultater for en rekke sykdommer, blant annet Long QT-syndrom, Huntingtons sykdom, Parkinsons sykdom og amyotrofisk lateral sklerose 22. Flere tiltak er allerede i gang med å etablere store biblioteker av pasientspesifikke hiPSCs, inkludert konsortier i USA, Europa, Australia, Kina, Sør-Korea og Japan 23,24.
Her en protokoll for å etablere hiPSCs fra hår-avledet keratinocytter er beskrevet, som har potensial til å forenkle og fast-track etablering av store biblioteker av sykdomsspesifikke hiPSCs. Denne protokollen gir to fordeler: For det første, episomalSystemet benyttes i denne protokollen genererer integrasjonsfritt hiPSCs ved hjelp av en cocktail av seks omprogrammering faktorer (OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shRNA for p53) ved relativt høy effektivitet 4. Sammenlignet med retrovirale eller lentiviral-mediert reprogrammerings metoder, bruk av episomal vektor unngår uønsket genomisk integrering av utenlandske transgener under omprogrammering., Derfor mange tiltak favorisere bruk av integrasjonsfrie omprogrammering metoder for etablering av store hiPSC biblioteker, for eksempel episomale vektorer, Sendai virus eller mRNA, over integrerende omprogrammering metoder 23.
Dernest er håret lett tilgjengelig og kan høstes av pasientene selv uten bruk av invasive prosedyrer eller deltakelse av medisinske staber. Dette gir en unik mulighet for pasienter fra ulike regioner for å samle inn og post i sine egne hårprøver til laboratoriet for keratinocyte derivasjon og påfølgende omprogrammering. Til støtte for gjennomførbarheten av denne strategien våre upubliserte data indikerer at keratinocytter med hell kan isoleres fra ribbet hår som ble lagret ved 4 ° C i opp til 10 dager.
Metodikken er beskrevet her vil tillate avledning av keratinocytt fra plukket hår. Mens keratinocytter kan utledes fra bare et eneste hår, er vår anbefaling å samle minst 5 anagen hår for keratinocyte avledning. En begrensning av denne protokollen er at noen hår ikke kan feste godt og keratinocytter kan mislykkes i å vokse. Tykkere hår har en tendens til å feste bedre, mens fine hår krever redusert mengde kulturmedium under plating å unngå flytende og forbedre vedlegg. Når keratinocytter er utledet, er det tilrådelig å utvide og fryse ned aksjer ved hjelp av standard sakte frysing nedfrysing metoder 16. Etterfølgende omprogrammering av keratinocytter kan utføres ved å følge fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen. Det er viktig åMerk at formeringshastigheten av utgangscellene kan påvirke omprogrammering effektivitet, med redusert omprogrammering effektivitet observert sent i passasjene når cellene når celle senescens 25-27. I denne forbindelse brukes keratinocytter senest passasje 6 for omprogrammering eksperimenter. I tillegg kan omprogrammering effektivitet variere mellom ulike enkeltes keratinocytter.
Nyere studier tyder på utbredt genetisk mosaicism i flere typer somatiske vev 28, med ~ 30% av hudfibroblaster rapportert å ha somatisk CNVs i genomet 29. Disse CNVs kan være forårsaket av feil i DNA-replikasjon, DNA-reparasjon eller transposon mobilisering. Det er også mulig at langvarig UV-eksponering på huden kan forårsake ytterligere CNVs i epidermale celler innbefattende fibroblaster og keratinocytter, men omfanget av denne er ikke godt forstått. Som CNVs i keratinocytter vil bli overført i løpet av omprogrammeringen prosessen, er det imtig å utføre rutinemessig karyotyping eller CNV analyse for å sikre at de etablerte hiPSCs opprettholde genomisk stabilitet. I sammendraget, her har vi beskrevet prosedyrer for generering av hiPSCs fra hår-avledet keratinocytter, som kan brukes for sykdom modellering og regenerativ medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
- Fuchs, E.
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M.
- Alonso, L., Fuchs, E.
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
