Introduction
Opdagelsen af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) har revolutioneret inden for regenerativ medicin, hvilket giver en realistisk metode til generering af patientspecifikke stamceller 1-3. hiPSCs succes er blevet genereret fra forskellige somatiske celletyper, herunder fibroblaster 4,5, hæmatopoietiske celler 6,7, renale epitelceller fra urin 8 og keratinocytter 9,10. Til dato, hudfibroblaster og hæmatopoietiske celler repræsenterer de mest almindeligt anvendte cellekilder til generering patientspecifikke iPSCs. Velsagtens, dette skyldes det faktum, at hudbiopsier og blodprøvetagning er rutinemæssige medicinske procedurer og store biobanker af patientens blod eller hud prøver er blevet etableret i mange lande.
I modsætning til blodceller og hud fibroblast som kræver invasive ekstraktionsmetoder, repræsenterer keratinocytter et lettilgængeligt celletype for hiPSC generation. Keratinocytes er keratin-rige epitelceller, der danner det ydre epidermale barriere i huden og også findes i negle og hår 11. Især kan keratinocytter findes på den ydre rod kappe (ORS), i hårfollikler, et ydre cellulære lag, der dækkede håret sammen med den indre rod kappe (IRS) celler (12, figur 1). Da hår kollektion er en simpel procedure, der ikke kræver hjælp fra medicinsk personale, giver det en mulighed for patienter at indsamle og sende deres egne hårprøver til laboratorier, som i høj grad ville lette indsamlingen af patientprøver for hiPSC generation. Epidermiskeratinocytter har også en højere omprogrammering effektivitet og hurtigere omprogrammering kinetik i forhold til fibroblaster, hvilket bidrager til fordelene ved anvendelse keratinocytter som startende celler for hiPSC generation 9,13. Endvidere kan hiPSCs også genereres under anvendelse af andre cellepopulationer i hårsækken,herunder hudpapillen celler placeret i bunden af hårsækken 14,15.
Tidligere rapporter om iPSC generation bruger hår-afledte celler ofte udnytter retroviral eller lentiviral-baserede omprogrammering metoder 9,14,15. Men disse virale metoder indføre uønsket genomisk integration af udenlandske transgener under omprogrammering. Til sammenligning anvendelse af episomale vektorer udgør en realistisk, ikke-viral omprogrammering metode til at generere integration-fri iPSCs 4. Vi har tidligere udviklet en enkel, omkostningseffektiv og ikke-viral metode til effektivt at omprogrammere keratinocyt i hiPSCs hjælp episomale vektorer 13. Her giver vi en detaljeret protokol til generering af keratinocytafledte hiPSCs, herunder udledning af keratinocytter fra plukkede hår, udbygning og vedligeholdelse af keratinocytter og efterfølgende omprogrammering for at generere hiPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Indsamlingen af menneskehår prøve fra individer kræver etisk godkendelse af det menneskelige videnskabsetisk komité i værten institutioner og bør ske i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.
1. Isolering af Keratinocytter fra Plucked Hår
- Thaw ekstracellulære matrix (ECM) opløsning (dvs. Matrigel) på is O / N.
- Ved hjælp af pre-kølet pipettespidser, tilsættes 200 pi ECM løsning på 12 ml kølet DMEM / F12 medium. Coat en 12-brønds plade med 1 ml fortyndet ECM opløsning i hver brønd. Inkubér overtrukne plade O / N ved 37 ° C. Vask den overtrukne plade med forvarmet DMEM / F12-medium før brug.
- Indsamle primære menneskehår fra individets hoved ved at placere fingrene tæt på roden af håret og plukning af hår i en hurtig og jævn bevægelse. Check for at bekræfte, at hver opsamlet hår indeholder et intakt hårsækken og bestemme vækstfasen af hår unwhich et dissektionsmikroskop (figur 1).
- Saml 5-10 anagene hår fra hver enkelt til at udtrække keratinocytter. Proces plukkede hår så hurtigt som muligt for at sikre en vellykket afledning af keratinocytter.
Bemærk: Figur 1 illustrerer morfologien af hår i forskellige faser af cyklussen vækst. Anagen hår er i vækstfasen, med en synlig ydre lag af epitel omkring længden af hår, kendt som ORS. På den anden side, telogen hår repræsenterer hår i hvilefase og har ikke et synligt ORS, men har en klar kugle af celler, der dækker roden af håret, kendt som telogen bule.
- Saml 5-10 anagene hår fra hver enkelt til at udtrække keratinocytter. Proces plukkede hår så hurtigt som muligt for at sikre en vellykket afledning af keratinocytter.
- Placer hårprøver i en petriskål indeholdende 10 ml antibiotikablanding at vaske i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Ved hjælp af steriliserede sakse og tænger, afbrød overdreven hår akslen, hvilket efterlader et hår fragment med en intakt hårsækken og omkring 0,5-1 cm hårstrået.
- Omhyggeligt transfer 1 hår fragment i hver brønd i ECM-coatede plade ved hjælp af pincet.
- Ved hjælp af en 1 ml pipette, tilsættes ca. 3 dråber Knockout Serum Replacement (KSR) medium (~ 100-200 pi) til hårprøver.
Bemærk: Hold hår fragmenter i tæt kontakt til pladen overflade for at give mulighed for udlæg og efterfølgende keratinocyt udvækst. Tilføjelse overdreven medier på dette trin kan årsagerne hår fragmenterne til at flyde og formindsker chancen for en vellykket hår vedhæftet fil. - Inkubér hårprøver i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og tillade hårsækkene at fastgøre O / N. Den følgende dag, forsigtigt tilføje yderligere 3 dråber KSR medium (~ 100-200 pi) for at holde hårprøver fugtig.
- Overhold hårprøver dagligt for at bekræfte, at hårsækkene har vedhæftet med succes. Generelt fastgørelse af hårsækkene fremgår inden for 1-3 dage. Tykke hår er som regel lettere at vedhæfte sammenlignet med fine hår, som fine hår har højeretendens til at flyde som hindrer den vedhæftede fil processen.
- Når håret har knyttet til den coatede plade, tilsættes 500 pi KSR medium til brønden. Vær ekstra forsigtig, når du tilføjer mediet som hårprøver måske ikke har knyttet fast. Fra dette punkt, skifter medier hver 2 dage.
Bemærk: Keratinocytkulturer udvækster skal være synlig fra ORS region af håret fragmentet efter 3-7 dage (figur 2A-B). Tillade keratinocytter at vokse op til 14 dage før passage af celler som beskrevet i næste afsnit.
- Når håret har knyttet til den coatede plade, tilsættes 500 pi KSR medium til brønden. Vær ekstra forsigtig, når du tilføjer mediet som hårprøver måske ikke har knyttet fast. Fra dette punkt, skifter medier hver 2 dage.
2. Vedligeholdelse og Passage af Keratinocytter
- Precoaten en 6-brønds plade under anvendelse af Coating Matrix Kit. Tilføj 680 pi af fortyndings- medium fra kittet til hver brønd, efterfulgt af 6,8 pi Coating Matrix opløsning. Ryst pladen for at sikre ensartet fordeling af Coating Matrix løsning på pladen.
- Tillad overtrukne plade at inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. FjerneCoating Matrix opløsning før udpladning af keratinocytter.
- Dissociere keratinocytter i en enkelt cellesuspension med 500 pi 0,25% trypsin per brønd for 2-5 min ved 37 ° C. Inaktivere trypsin med 500 pi medium indeholdende serum (fx føtalt bovint serum (FBS) medium) og anbring i en steril 15 ml rør. Fjerne hår fragment under anvendelse steriliserede pincetter.
- Bestem antallet af høstede celler ved hjælp af en hæmocytometer.
- Centrifuger cellerne i 3 minutter ved 200 x g. Vask cellerne med PBS og gentag centrifugering. Aspireres PBS og resuspender cellepelleten i frisk keratinocyt medium.
- Plade down 4 × 10 4 keratinocytter i én brønd af ECM-coatede plade i nærværelse af keratinocyt medium. Hold keratinocytterne i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 (figur 2C). Skift medier hver dag og passage celler, når kulturen er ~ 80% sammenflydende, which kan tage ca. 2-7 dage afhængig af passagen antal og proliferationshastighed af keratinocytter. De afledte keratinocytter bør udvides til at generere tilstrækkelige frosne lagre ved hjælp af standard langsomme indefrysning kryopræservering metoder 16.
Bemærk: De beskrevne dyrkningsbetingelser støtte udvidelsen af homogen population af keratinocytter med typisk brosten morfologi (figur 2C). Indimellem kan et par differentierede keratinocytter, med store og flad morfologi og har mistet replikativ potentiale, observeres i kultur. Karakterisering af keratinocytter kan udføres ved immunofarvning under anvendelse af antistoffer mod cytokeratin 14 som tidligere beskrevet 17. Etablerede keratinocyt cellelinjer bør også testes for mycoplasma efter 1-3 passager under anvendelse af kommercielt tilgængeligt kit.
3. Frembringelse af hiPSCs fra keratinocytter Brug af episomale vektorer
- Precoaten en 6-brønds plade med0,1% gelatine (2 ml / brønd). Tillad gelatine til overtrækning i mindst 20 minutter ved stuetemperatur.
- For omprogrammering eksperiment, betjene keratinocytter senest passage 6. dissociere keratinocytter i en enkelt cellesuspension med 1 ml 0,25% trypsin per brønd i 2-5 minutter ved 37 ° C. Inaktivere trypsin med 1 ml medier indeholdende serum (f.eks FBS medier) og samles i en 15 ml rør.
- Centrifuger cellerne i 3 minutter ved 200 xg og resuspender cellerne i keratinocyt medium. Plade 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 keratinocytter per brønd i en gelatineret plade O / N.
- Den følgende dag (dag 0), skal du kontrollere pladen for at sikre celler er 50-60% sammenflydende.
Bemærk: hvis keratinocytter er mindre end ~ 50% konfluente de måske ikke vokser godt efter transfektion. - På dag 0, udføre transfektion af episomale omprogrammering vektorer på keratinocytterne, anvendelse af et forhold på 8 pi transfektionsreagens til 2 ug totalt plasmid-DNA.
- Tag 0,5 ug for hver af de 4 plasmider (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) og fortyndes i 100 ul Reduceret Serum medium (f.eks OPTI-MEM).
Bemærk: Plasmidet pCXLE-eGFP bruges til at overvåge transfektionseffektiviteter i keratinocytter og er ikke påkrævet for vellykket omprogrammering. - Tilføje 8 pi transfektionsreagens til den fortyndede DNA. Bland ved at tænde røret. Tillad DNA-reaktionsblandingen at hvile uforstyrret ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Udskift Keratinocyt medium med frisk medium.
- Tilføj forsigtigt DNA reaktionsblandingen til keratinocytkultur og inkuberes i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 4 timer.
Bemærk: Det anbefales ikke at udføre længerevarende transfektion O / N i keratinocytter, som de udviser lav overlevelse efter transfektion. - Efter 4 timer efter transfektion udskifte Keratinocyt medium med frisk medium.
- Tag 0,5 ug for hver af de 4 plasmider (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) og fortyndes i 100 ul Reduceret Serum medium (f.eks OPTI-MEM).
- På dag 1 (1 dag post-transinfektion), ændre keratinocyt mellemstore og tjek transfektion effektivitet ved at estimere procentdelen af eGFP positive celler under et fluorescerende mikroskop. Typisk observeres> 60-70% transfektionseffektivitet for primære keratinocytter ved hjælp af denne protokol.
- På dag 2, gentag transfektion som beskrevet i trin 3.5. To på hinanden følgende transfektioner vil typisk opnå> 90% transfektionseffektivitet. Keratinocytkultur sædvanligvis når konfluens ved udgangen af den anden transfektion.
- Forbered en 10 cm skål af mus embryonale fibroblast (MEF) feeder for hver omprogrammering reaktion. Forbered mitotisk inaktiverede MEF foderautomater som tidligere beskrevet 18.
- Precoaten en 10 cm skål med 5 ml 0,1% gelatine i mindst 20 min. Plate 4 × 10 6 mitotisk inaktiverede MEF pr 10 cm skål i FBS medium. Lade cellerne sætte sig og fastgøre O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- På dag 3, harvest keratinocytterne med 0,25% trypsin som beskrevet i trin 3.2 og 3.3. Resuspendere keratinocytter i KSR medium og pladen 90% af keratinocytter fra 1 brønd i en 6-brønds plade til en 10 cm MEF feeder skål med KSR medium.
- Fra dag 4 og frem, ændre KSR medium hver dag.
- Alternativt efter Dag 18, erstatte dyrkningsmedium hver anden dag.
Bemærk: Ikke-omprogrammeret keratinocytter vil ophøre med at formere sig, mens hiPSC kolonier med defineret grænse, der ligner humane embryonale stamceller (hESCs) vil dukke op fra dag 14-21.
- Alternativt efter Dag 18, erstatte dyrkningsmedium hver anden dag.
- Isoler hiPSC kolonier ved manuel dissektion fra dag 21 og frem. Undgå hiPSC kolonier, der er tæt grupperet sammen, og kun vælge hiPSC kolonier, der er klart adskilt fra andre.
Bemærk: hiPSC kolonier kan plukkes tidligere, men kolonien med definerede grænser muligvis ikke være indlysende på tidligere tidspunkter betragtning af den lille koloni størrelse. Omprogrammering effektivitet kan variere mellem different patientens keratinocytter, og er også påvirket af andre faktorer, såsom antallet passage eller spredning på keratinocytter.- Til manuel dissektion af hiPSC kolonier, så brug en 26G nål til at skære hiPSC kolonier under et dissektionsmikroskop. Skær en hiPSC koloni i små stykker omkring 300-600 um i længden. Overfør stykker fra den ene hiPSC koloni til en ny MEF feeder plade (2,5 × 10 4 MEF / cm2) for at etablere en klonal linje af hiPSCs. Indledningsvis kultur hver hiPSC klonal linie i en brønd i en 12 brønds-plade eller organ dyrkningsskåle, derefter udvide til 6 brønds plade format.
- Vedligehold etablerede klonale linjer af hiPSCs i KSR medium på MEF foderautomater. Når kulturen nå 70-80% konfluens med hiPSC kolonier ~ 1,5 mm i diameter, passage hiPSCs anvendelse af standard enzymatiske overførselsteknikker metoder (Accutase, Dispase eller Collagenase IV) i henhold til producentens anvisninger.
- Karakterisere etableret hiPSC linjes for at bekræfte pluripotens og deres evne til at differentiere til celler repræsentative for de tre kimlag in vitro og / eller in vivo 13,19. Også, rutinemæssigt tester etablerede hiPSC linjer for mycoplasma under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits sikre at de er patogen-fri. Rutinemæssigt overvåge genomisk stabilitet hiPSC linjer ved karyotypebestemmelse eller matrix-baseret kopital variation (CNV) analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Håret går gennem 3 forskellige faser af vækst cyklus: anagen (vækstfasen), catagen (regression fase) og telogen (resten fase) 20,21. Anagen hårsækken indeholder multiple lag af epitel; disse lag omfatter ORS, IRS og håret (figur 1). Anagen hår til sidst gennemgår overgangen til den catagen fase, som er præget af apoptose af ORS og afslutning hårstrået differentiering. Endelig catagen hår overgangen til den telogene fase, hvor apoptose ophører, og telogen follicle bliver hvilende med en karakteristisk telogen bule 20,21.
Figur 1 illustrerer morfologien af en telogen hår og en anagen hår. Vi anvender typisk anagen hår for keratinocyt afledning. Efter denne protokol, kan keratinocytkulturer udvækster observeres så tidligt som 3 dage efter hår vedhæftet fil (figur 2A), og vil fortsætte med at proliferate (figur 2B). Det er vores erfaring, kan nogle anagene hår undlader at vedhæfte eller undlader at iagttage keratinocyt udvækst; således indsamle mindst 5 - 10 anagene hår fra hver enkelt at sikre en vellykket keratinocyt isolation. Efterfølgende kan keratinocytterne passeres på en ny plade og opretholdt i flere passager (figur 2C). Det er vigtigt at bemærke, at der er bedre vækst af keratinocytter på en Coating Matrix med Keratinocyt medium som beskrevet i afsnit 2, i forhold til Matrigel med KSR medium.
Efter ekspansion kan keratinocytter omprogrammeres til at generere hiPSCs som beskrevet i afsnit 3. Figur 3A viser en typisk keratinocyt-afledt hiPSC koloni efter 32 dages omprogrammering. Det er almindeligt at observere nogle differentiering i centrum af hiPSC koloni. Når manuelt plukkes af de afledte hiPSCs typisk udviser høj kerne og cytoplasma-forhold og en defineret koloni bundetAry (figur 3B). Etablerede cellelinjer af hiPSCs kan derefter karakteriseres pluripotens som beskrevet tidligere 13,19, såsom ekspressionen af pluripotente markører OCT4, NANOG og TRA-160 (figur 3C-E).
Figur 1. Repræsentative billeder af plukkede hår på forskellige vækstfaser. (A) Diagram, som viser hår i anagen eller telogen fase. Fase kontrast billeder, der viser en plukkede hår i (B) telogen fase og (C) anagene fase. HS = hårstrået; IRS = Inner Root Skede; ORS = Udvendig Root Skede. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative billeder af hår-afledte keratinocytter. Fasekontrast billeder af en plukket hår belagt ned for (A) 3 dage og (B) 10 dage. Hvide pile markerer udvækst af keratinocyt fra en plukket hår. (C) fase kontrast billede af Dag 3 keratinocytkultur med en typisk brosten morfologi efter passage. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative billeder af keratinocytafledte hiPSCs. (A) fase kontrast billede af en dag 32 omprogrammering kultur viser en keratinocytafledt hiPSC coLony. (B) manuelt valgte keratinocytafledte hiPSCs med morfologi ligner hESCs. Immunfarvning af hiPSCs med pluripotente markører (C) NANOG og (D) OCT4 og (E) TRA-160 i keratinocytafledte hiPSCs. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generation af patient-specifikke hiPSCs tilbyder en unik tilgang til at studere patogenese i de syge celletyper in vitro, og giver også en platform for narkotika screening for at identificere nye molekyler, der kan redde sygdommen fænotyper. Denne sygdom modelmetode hjælp hiPSCs har givet lovende resultater for en række sygdomme, herunder Long QT-syndrom, Huntingtons sygdom, Parkinsons sygdom og amyotrofisk lateral sklerose 22. Flere initiativer er allerede i gang for at etablere store biblioteker af patient-specifikke hiPSCs, herunder konsortier i USA, Europa, Australien, Kina, Sydkorea og Japan 23,24.
Her en protokol til at etablere hiPSCs fra hår-afledte keratinocytter beskrives, som har potentiale til at lette og hurtigt spore etablering af store biblioteker af sygdomsspecifikke hiPSCs. Denne protokol giver to fordele: For det første episomaleSystemet anvendes i denne protokol genererer integration-fri hiPSCs ved hjælp af en cocktail af seks omprogrammering faktorer (OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, shRNA for p53) ved relativt høj effektivitet 4. Sammenlignet med retroviral eller lentiviral-medieret omprogrammering metoder, brug af episomal vektor undgår uønsket genomisk integration af udenlandske transgener under omprogrammering., Derfor er mange initiativer fremme anvendelsen af integration-fri omprogrammering metoder til etablering af store hiPSC biblioteker, såsom episomale vektorer, Sendai-virus eller mRNA over integrative omprogrammering metoder 23.
For det andet hår er let tilgængelig og kan høstes af patienterne selv uden brug af invasive procedurer eller deltagelse af medicinske stabe. Dette giver en unik mulighed for patienter fra forskellige regioner til at indsamle og mail i deres egne hårprøver til laboratoriet til keratinocyt afledning og efterfølgende omprogrammering. Til støtte for gennemførligheden af denne strategi, vores upublicerede data indikerer, at keratinocytter held kan isoleres fra plukkede hår, der blev opbevaret ved 4 ° C i op til 10 dage.
Den her beskrevne metode vil gøre det muligt afledning af keratinocyt fra plukket hår. Mens keratinocytter kan afledes fra blot en enkelt hår, vores anbefaling er at indsamle mindst 5 anagen hår for keratinocyt afledning. En begrænsning af denne protokol, er, at nogle hår ikke kan knytte godt og keratinocytter kan ikke vokse. Tykkere hår tendens til at knytte bedre, mens fint hår kræver reduceret mængde dyrkningsmedium under plating at undgå flydende og forbedre vedhæftning. Når keratinocytter er afledt, er det tilrådeligt at udvide og fryse ned bestande ved anvendelse af standard langsom-frysning kryopræservering metoder 16. Efterfølgende omprogrammering af keratinocytter kan udføres følgende trin er beskrevet i denne protokol. Det er vigtigt atBemærk, at spredningen på de startende celler kan påvirke omprogrammering effektivitet med nedsat omprogrammering effektivitet observeret i sene passager som celler nå cellulære senescens 25-27. I denne forbindelse anvender keratinocytter senest passage 6 for omprogrammering eksperimenter. Derudover kan omprogrammering effektivitet variere mellem forskellige individs keratinocytter.
Nylige undersøgelser tyder på udbredt genetisk mosaicisme i flere forskellige typer somatiske væv 28, med ~ 30% af hudfibroblaster rapporteret at have somatisk CNVs i genomet 29. Disse CNVs kan være forårsaget af fejl i DNA-replikation, DNA-reparation eller transposon mobilisering. Det er også muligt at langvarig UV eksponering af huden kan medføre yderligere CNVs i epidermale celler, herunder fibroblaster og keratinocytter, men omfanget af dette er ikke godt forstået. Som CNVs i keratinocytter vil blive gennemført i løbet af under omprogrammering processen, er det imtigt at udføre rutinemæssige karyotypebestemmelse eller CNV analyse for at sikre, at de etablerede hiPSCs opretholde genomisk stabilitet. Sammenfattende her vi beskrev procedurer til generering af hiPSCs fra hår-afledte keratinocytter, som kunne anvendes til sygdom modellering og regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
- Fuchs, E.
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M.
- Alonso, L., Fuchs, E.
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
