Introduction
Die Entdeckung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) hat das Gebiet der regenerativen Medizin revolutioniert und bietet eine praktikable Methode zur Erzeugung von patientenspezifischen Stammzellen 1-3. hiPSCs wurden erfolgreich aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, 4,5, 6,7 hämatopoetischen Zellen, Nieren-Epithelzellen aus Urin 8 und Keratinozyten 9,10 erzeugt. Bisher Haut-Fibroblasten und blutbildenden Zellen stellen die am häufigsten verwendeten Zellquellen zur Erzeugung von patientenspezifischen iPSCs. Dies mag auf die Tatsache zurückzuführen, dass Hautbiopsien und Blutentnahme sind Routine medizinischen Verfahren und großen Biobanken von Patienten Blut oder Hautproben wurden in vielen Ländern etabliert.
Im Gegensatz zu den Blutzellen und Hautfibroblasten, die invasive Extraktionsmethoden erfordern, Keratinozyten stellen eine leicht zugängliche Zelltyp für hiPSC Generation. Keratinocytes sind Keratin-reiche Epithelzellen, die das Äußere epidermalen Barriere der Haut zu bilden und werden auch in Nägel und Haare 11 gefunden. Insbesondere kann auf die Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS) Haarfollikel von einer externen Zellschicht, die den Haarschaft zusammen mit dem inneren Wurzelscheide (IRS) Zellen (12, Figur 1) abgedeckt ermittelt werden. Wie Haar Sammlung ist ein einfaches Verfahren, das nicht die Unterstützung des medizinischen Personals erfordert, bietet es eine Chance für die Patienten zu sammeln und zu ihren eigenen Haarproben an Laboratorien, die die Sammlung von Patientenproben für hiPSC Generation erheblich erleichtern würde. Epidermiskeratinocyten auch eine höhere Wirksamkeit und eine schnellere Anpassung Umprogrammierung Kinetik im Vergleich zu Fibroblasten, zusätzlich zu den Vorteilen der Verwendung von Keratinozyten, wie die Ausgangszellen für die Erzeugung hiPSC 9,13. Weiterhin kann hiPSCs auch mit anderen Zellpopulationen in der Haarfollikel erzeugt werden,einschließlich der dermalen Papillenzellen an der Basis des Haarfollikels 14,15 entfernt.
Frühere Berichte des iPSC Generation mit Haar-abgeleiteten Zellen verwenden häufig retroviralen oder lentiviralen-basierte Verfahren der Reprogrammierung 9,14,15. Allerdings sind diese virale Verfahren einzuführen unerwünschte genomische Integration ausländischer Transgenen während Neuprogrammierung. Im Vergleich dazu ist die Verwendung von episomalen Vektoren, eine Möglichkeit, die nicht-virale Verfahren zum Umprogrammieren Integration freien iPSCs 4 zu erzeugen. Wir haben bereits eine einfache, kostengünstige und nicht-virale Verfahren zur effizienten umprogrammieren Keratinozyten in hiPSCs mit episomalen Vektoren 13 entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von Keratinozyten stamm hiPSCs, einschließlich der Ableitung von Keratinozyten aus gezupften Haare, Erweiterung und Wartung der Keratinozyten und anschließender Neuprogrammierung zu hiPSCs generieren.
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Protocol
Die Sammlung der menschlichen Haarprobe von Personen erfordert ethische Genehmigung durch die menschliche Forschung Ethik-Kommission in den Gasteinrichtungen und sollten in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt werden.
1. Isolierung von Keratinozyten aus Zupfinstrumente Haar
- Tau-extrazellulären Matrix (ECM) Lösung (dh Matrigel) auf Eis O / N.
- Verwendung vorgekühlte Pipettenspitzen, fügen Sie 200 ul ECM-Lösung zu 12 ml gekühltes DMEM / F12-Medium. Coat eine 12-Well-Platte mit 1 ml verdünnter ECM-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die beschichtete Platte O / N bei 37 ° C. Waschen Sie die beschichtete Platte mit vorgewärmten DMEM / F12-Medium vor der Verwendung.
- Sammeln primären menschlichen Haares von der individuellen Kopf, indem die Finger in der Nähe der Wurzel des Haares und Zupfen Sie die Haare in eine schnelle und gleichmäßige Bewegung. Überprüfen Sie, um zu bestätigen, dass jeder gesammelten Haaren enthält eine intakte Haarfollikel und bestimmen die Wachstumsphase der Haare unDer einem Binokular (Abbildung 1).
- Sammeln 5-10 Anagenhaare von jedem einzelnen auf Keratinozyten zu extrahieren. Verfahren gezupften Haare so schnell wie möglich zu einer erfolgreichen Ableitung Keratinozyten sicherzustellen.
ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt die Morphologie der Haare in unterschiedlichen Phasen des Wachstumszyklus. Anagenhaare ist in der Wachstumsphase mit einer sichtbaren äußeren Epithelschicht die Länge der Haare, da die ORS bekannten Umgebung. Auf der anderen Seite, Telogen Haar stellt Haare in der Ruhephase und muss nicht eine sichtbare ORS, aber hat eine klare Kugel von Zellen für den Wurzel des Haares, als Telogen Ausbuchtung bekannt.
- Sammeln 5-10 Anagenhaare von jedem einzelnen auf Keratinozyten zu extrahieren. Verfahren gezupften Haare so schnell wie möglich zu einer erfolgreichen Ableitung Keratinozyten sicherzustellen.
- Platzieren Sie die Haarprobe in eine Petrischale, die 10 ml mit Antibiotika Mix für 5 min bei RT waschen.
- Verwendung sterilisiert Schere und Pinzette, schneiden Sie übermäßigen Haarwelle, so dass ein Haar-Fragment mit einer intakten Haarfollikel und um 0,5 bis 1 cm von Haarschaft.
- Sorgfältig transfer 1 Haar-Fragment in jeder Vertiefung der ECM-beschichtete Platte mit einer Pinzette.
- Unter Verwendung einer 1 ml Pipette ca. 3 Tropfen Knockout Serum Replacement (KSR), Medium (~ 100 bis 200 & mgr; l) zu den Haarproben.
Hinweis: Halten Sie das Haar-Fragmente in engem Kontakt zur Plattenoberfläche, um für die Befestigung und die anschließende Keratinozyten Auswuchs zu ermöglichen. Hinzufügen von Seiten übermäßig in diesem Schritt kann bewirkt, dass die Haar-Fragmente zu schweben, und verringert die Chance einer erfolgreichen Haar Befestigung. - Die Haarproben in einer 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 inkubieren und lassen die Haarfollikel O befestigen / N. Am folgenden Tag, sanft weiteren hinzufügen 3 Tropfen KSR Medium (~ 100 bis 200 & mgr; l), um die Haarproben feucht zu halten.
- Beachten Sie die Haarproben täglich, um zu bestätigen, dass die Haarfollikel erfolgreich angeschlossen. Generell Befestigung der Haarfollikel ist offensichtlich innerhalb von 1-3 Tagen. Dicke Haare sind in der Regel leichter zu befestigen, verglichen mit feinen Haaren, wie feinen Haaren höher habenTendenz zu schweben, die die Befestigung behindern.
- Sobald das Haar haben auf die beschichtete Platte befestigt ist, fügen Sie 500 ul KSR Medium zum Brunnen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Hinzufügen des Mediums als Haarproben möglicherweise nicht fest angeschlossen haben. Von diesem Punkt zu ändern Medien alle 2 Tage.
Hinweis: Keratinozyten Auswüchse sollten von der ORS Bereich der Haar-Fragment nach 3-7 Tagen (2A-B) zu sehen sein. Lassen Sie die Keratinozyten bis zu 14 Tage vor aufwachsen Passagieren der Zellen, wie im nächsten Abschnitt beschrieben.
- Sobald das Haar haben auf die beschichtete Platte befestigt ist, fügen Sie 500 ul KSR Medium zum Brunnen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Hinzufügen des Mediums als Haarproben möglicherweise nicht fest angeschlossen haben. Von diesem Punkt zu ändern Medien alle 2 Tage.
2. Wartung und Passagieren von Keratinozyten
- Vorstrich eine 6-Well-Platte mit der Beschichtungsmatrix Kit. Fügen Sie 680 ul des Verdünnungsmedium aus dem Kit in jede Vertiefung, gefolgt von 6,8 & mgr; l Beschichtungsmatrix-Lösung. Schütteln Sie die Platte um eine gleichmäßige Verteilung der Beschichtungsmatrix-Lösung auf der Platte sicherzustellen.
- Lassen Sie den beschichtete Platte für 30 min bei RT inkubieren. Entfernendie Beschichtungsmatrix-Lösung vor dem Beschichten von Keratinozyten.
- Dissoziieren Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 500 ul 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung des Trypsins mit 500 ul Medium, das Serum enthält (beispielsweise fötales Rinderserum (FBS) mittel) und Sammeln in ein steriles 15 ml Röhrchen. Entfernen Sie die Haare Fragment mit sterilisierten Pinzette.
- Bestimmen Sie die Anzahl der geernteten Zellen mit einem Hämozytometer.
- Zentrifugieren der Zellen für 3 min bei 200 x g. Die Zellen mit PBS und wiederholen Zentrifugation waschen. Saugen Sie das PBS und Zellpellet in frischem Keratinozyten-Medium.
- Platte um 4 x 10 4 Keratinozyten in ein Well ECM-beschichtete Platte in Gegenwart von Keratinozyten-Medium. Halten die Keratinozyten in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 (Abbildung 2C). Ändern Medien jeden Tag und Passage-Zellen, wenn die Kultur ist ~ 80% konfluent, which kann etwa 2-7 Tage dauern, je nach Durchgang Nummer und Proliferationsrate der Keratinozyten. Die abgeleiteten Keratinozyten sollte erweitert werden, um ausreichend gefroren Aktien unter Verwendung von Standard langsam Einfrieren Kryokonservierung Methoden 16 zu erzeugen.
Anmerkung: Die hier beschriebenen Kulturbedingungen unterstützt die Ausdehnung des homogenen Population von Keratinozyten mit typischen Kopfsteinpflastermorphologie (Abbildung 2C). Gelegentlich können ein paar differenzierten Keratinozyten, mit großen und flachen Morphologie und haben replikative Potential verloren, in der Kultur zu beobachten. Charakterisierung von Keratinozyten durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen Cytokeratin 14 durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben 17. Gegründet Keratinozyten-Zelllinien sollte auch auf Mykoplasmen nach 1-3 Passagen mit kommerziell erhältlichen Kit getestet werden.
3. Erzeugung von hiPSCs von Keratinozyten Mit Episomale Vektoren
- Vorstrich eine 6-Well-Platte mit0,1% Gelatine (2 ml / Vertiefung). Gelatine mit Mantel für mindestens 20 min bei RT.
- Umprogrammierung Experiment Verwendung Keratinozyten spätestens Gang 6 Dissociate Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 1 ml 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung von Trypsin mit 1 ml Medium, das Serum (zB FBS-Medium) und sammeln Sie in einem 15-ml-Tube.
- Zentrifuge Zellen für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellen in Keratinozyten-Medium. Platte 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 pro Vertiefung Keratinozyten in einer gelatinierten Platte O / N.
- Am folgenden Tag (Tag 0), überprüfen Sie die Platte, um sicherzustellen, Zellen 50-60% konfluent.
Hinweis: Wenn Keratinozyten weniger als ~ 50% konfluent sie nicht gut nach der Transfektion wachsen könnte. - Am Tag 0, führen Transfektion der episomalen Vektoren Neuprogrammierung auf die Keratinozyten mit einem Verhältnis von 8 & mgr; Transfektionsreagenz bis 2 & mgr; g Gesamt-Plasmid-DNA.
- Nehmen 0,5 ug für jeden der 4 Plasmide (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOCT3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) und in 100 & mgr; l reduziert Serum-Medium (zB OPTI-MEM) verdünnt.
Hinweis: Das Plasmid pCXLE-eGFP verwendet, um die Transfektionseffizienz in Keratinozyten zu überwachen und ist nicht für eine erfolgreiche Neuprogrammierung erforderlich. - Sie 8 ul Transfektionsreagenz zu der verdünnten DNA. Mischen Sie durch Schwenken des Rohres. Lassen Sie die DNA-Reaktionsmischung bei RT 15 min ungestört zu entspannen.
- Ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium.
- Fügen Sie vorsichtig die DNA-Reaktionsmischung zu Keratinozyten-Kultur und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 4 Stunden.
Hinweis: Es wird nicht empfohlen, längeren Transfektion O / N in Keratinozyten durchzuführen, da sie geringe Überlebens nach der Transfektion aufweisen. - Nach 4 Stunden nach der Transfektion, ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium.
- Nehmen 0,5 ug für jeden der 4 Plasmide (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOCT3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) und in 100 & mgr; l reduziert Serum-Medium (zB OPTI-MEM) verdünnt.
- Am Tag 1 (1 Tag nach der transfection), ändern Sie die Keratinozyten-Medium und prüfen Transfektionseffizienz durch Schätzung der Anteil der eGFP positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Typischerweise> 60-70% Transfektionseffizienz für primären Keratinozyten unter Verwendung dieses Protokolls festgestellt.
- Am Tag 2 wiederholen Transfektion, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Zwei aufeinanderfolgenden Transfektionen typischerweise erreichen würde> 90% Transfektionseffizienz. Keratinocytenkultur Regel erreicht Mündung bis zum Ende der zweiten Transfektion.
- Bereiten Sie eine 10 cm Schüssel mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder für jede Neuprogrammierung Reaktion. Bereiten mitotisch inaktivierten MEF Feeder wie zuvor beschrieben 18.
- Precoat-10-cm-Schale mit 5 ml 0,1% Gelatine für mindestens 20 min. Platte 4 x 10 6 mitotisch inaktivierten MEF pro 10 cm Schale in FBS-Medium. Lassen Sie die Zellen absetzen und befestigen Sie O / N in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2.
- Am Tag 3, harWeste die Keratinozyten mit 0,25% Trypsin, wie in Schritt 3.2 und 3.3 beschrieben. Resuspendieren der Keratinozyten in KSR Medium und die Platte 90% der Keratinozyten aus 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte in eine 10 cm MEF Feeder-Gericht mit KSR Medium.
- Von Tag 4 ab, jeden Tag ändern Sie die KSR Medium.
- Alternativ nach Tag 18, ersetzen Sie jeden zweiten Tag Kulturmedium.
Hinweis: Nicht-Keratinozyten umprogrammiert wird aufhören zu vermehren, während hiPSC Kolonien mit definierten Grenze, die menschliche embryonale Stammzellen (hES) ähneln wird ab Tag 14 entstehen - 21.
- Alternativ nach Tag 18, ersetzen Sie jeden zweiten Tag Kulturmedium.
- Isolieren hiPSC Kolonien durch manuelle Dissektion von Tag 21 ab. Vermeiden hiPSC Kolonien, die eng zusammen gruppiert sind und nur hiPSC Kolonien, die sich deutlich von den anderen getrennt werden pflücken.
Anmerkung: hiPSC Kolonien können früher aufgenommen werden, aber die Kolonie mit definierten Grenzen möglicherweise nicht zu früheren Zeitpunkten offensichtlich, angesichts der geringen Koloniegröße. Neuprogrammierung Effizienzen zwischen diff variierenErent Patienten Keratinozyten und wird auch durch andere Faktoren wie beispielsweise Durchlaufhäufigkeit bzw. Proliferationsrate der Keratinozyten beeinflusst.- Für die manuelle Präparation der hiPSC Kolonien, verwenden Sie eine 26G Nadel hiPSC Kolonien unter einem Binokular geschnitten. Schneiden Sie ein hiPSC Kolonie in kleine Stücke rund 300 bis 600 & mgr; m in der Länge. Übertragen Sie die Stücke von einem hiPSC Kolonie in einen neuen MEF Feeder-Platte (2,5 x 10 4 MEF / cm 2), um eine klonale Linie der hiPSCs etablieren. Zu Beginn jeder Kultur hiPSC klonalen Linie in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte oder Organkulturschalen, erweitern Sie dann bis 6 Well-Plattenformat.
- Pflegen etablierten klonalen Linien hiPSCs in KSR Medium auf MEF Feeder. Sobald der Kultur zu erreichen 70-80% Konfluenz mit hiPSC Kolonien ~ 1,5 mm Durchmesser, Durchgang hiPSCs mit Standard-enzymatische Methoden Passagieren (Accutase, Dispase oder Collagenase IV) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Charakterisieren gegründet hiPSC Linies Pluripotenz und ihre Fähigkeit, in Zellen Vertreter der drei Keimblätter in vitro und / oder in vivo 13,19 differen bestätigen. Auch routinemäßig etablierten Test hiPSC Linien für Mykoplasmen mit kommerziell erhältlichen Kits zu gewährleisten, dass sie pathogen-frei sind. Genomische Stabilität hiPSC Linien durch Karyotypisierung oder Array-basierte Kopienzahl Variation (CNV) Analyse routinemäßig zu überwachen.
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Representative Results
Das Haar durchläuft drei verschiedene Phasen des Wachstumszyklus: Anagenphase (Wachstumsphase), catagen (die Regressionsphase) und Telogen (die Ruhephase) 20,21. Das Anagen Haarfollikel enthält mehrere Schichten von Epithel; Diese Schichten sind die ORS, IRS und den Haarschaft (Abbildung 1). Anagenhaar schließlich einen Übergang zu dem catagen Phase, die durch Apoptose der ORS und Beendigung der Haarschaft Differenzierung gekennzeichnet ist. Schließlich catagen Haar Übergang in die Telogenphase, in denen Apoptose aufhört und das Telogen Follikel wird Ruhe mit einem charakteristischen telogen wölben 20,21.
Abbildung 1 zeigt die Morphologie eines telogenen Haaren und einer Anagenhaare. Wir verwenden in der Regel Anagenhaar für Keratinozyten-Ableitung. Nach diesem Protokoll können Keratinozyten Auswüchse bereits 3 Tage nach der Haarbefestigungs (2A) beobachtet werden und wird p weiterroliferate (2B). Nach unseren Erfahrungen können einige Anagenhaare nicht zu befestigen oder nicht Keratinozyten Auswuchs zu beobachten; so sammeln mindestens 5-10 Anagenhaare von jedem einzelnen eine erfolgreiche Keratinozyten-Isolation zu gewährleisten. Anschließend können die Keratinozyten auf eine neue Platte passagiert und für mehrere Durchgänge (2C) gehalten werden. Es ist wichtig zu beachten, dass es besser ist, das Wachstum von Keratinozyten auf einer Beschichtungsmatrix mit Keratinozyten-Medium, wie in Abschnitt 2 mit KSR Medium beschrieben, auf Matrigel verglichen.
Nach Expansion, können die Keratinozyten neu programmiert, um hiPSCs erzeugen, wie in Abschnitt 3 3A nach 32 Tagen der Reprogrammierung beschrieben zeigt eine typische Keratinozyten stamm hiPSC Kolonie werden. Es ist üblich, eine Differenzierung in der Mitte des hiPSC Kolonie beobachten. Sobald manuell abgeholt, die abgeleiteten hiPSCs zeigen typischerweise hohe Zellkern zu Plasma-Relation und einem definierten Kolonie gebundenary (3B). Etablierte Zelllinien mit hiPSCs kann dann für Pluripotenz wie zuvor beschrieben 13,19, wie zum Beispiel die Expression von pluripotenten Marker OCT4, NANOG und TRA-160 (3C-E) charakterisiert werden.
Abbildung 1. Repräsentative Bilder der gezupften Haare in unterschiedlichen Wachstumsphasen. (A) Schematische Darstellung Haare in der Anagen oder Telogenphase. Phasenkontrastaufnahmen, die einen gezupften Haaren in (B) Telogenphase und (C) Anagenphase. HS = Haarschaft; IRS = Inner Wurzelscheide; ORS = äußeren Wurzelscheide. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Bilder von Haarstamm Keratinozyten. Phasenkontrastbilder einer gezupften Haare für (A) 3 Tage und (B) 10 Tage überzogen. Weiße Pfeile markieren den Auswuchs von Keratinozyten aus einer gezupften Haaren. (C) Phase Kontrast Bild von Tag 3 Keratinozyten-Kultur mit einer typischen Kopfsteinpflastermorphologie nach Passagieren. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Bilder von Keratinozyten stamm hiPSCs. (A) Phasenkontrast-Bild von einem Tag 32 Neuprogrammierung Kultur, die eine von Keratinozyten stamm hiPSC Colony. (B) manuell ausgewählt Keratinozyten stamm hiPSCs mit Morphologie ähnlich hESCs. Immunfärbung von hiPSCs mit pluripotenten Markierungen (C) NANOG und (D) OCT4 und (E) TRA-160 in Keratinozyten stamm hiPSCs. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Erzeugung von patientenspezifischer hiPSCs bietet einen einzigartigen Ansatz für die Untersuchung der Pathogenese in den erkrankten Zelltypen in vitro, und stellt auch eine Plattform zum Wirkstoff-Screening, neue Moleküle, die die Krankheitsphänotypen retten kann identifizieren. Diese Krankheit Modellansatz mit hiPSCs vielversprechende Ergebnisse für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Long-QT-Syndrom, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose 22 ergab. Mehrere Initiativen laufen bereits zu großen Bibliotheken von patientenspezifischen hiPSCs, einschließlich Konsortien in USA, Europa, Australien, China, Südkorea und Japan 23,24 etablieren.
Hier ein Protokoll zur hiPSCs Haarstamm Keratinozyten etablieren beschrieben, die das Potenzial zu erleichtern und Fast-Track die Errichtung von großen Bibliotheken von krankheitsspezifischen hiPSCs hat. Dieses Protokoll bietet zwei Vorteile: Zum einen die episomalSystem in diesem Protokoll verwendet erzeugt Integration freien hiPSCs mit einem Cocktail aus sechs Reprogrammierungsfaktoren (OCT4, SOX2, Klf4, L-MYC, Lin28, shRNA für p53) bei relativ hohen Effizienz 4. Im Vergleich zu retroviralen oder lentiviralen-vermittelte Verfahren der Reprogrammierung, die Verwendung von episomalen Vektor vermeidet unerwünschte genomische Integration ausländischer Transgenen während Neuprogrammierung., Daher viele Initiativen begünstigen die Verwendung von Integration freien Verfahren der Reprogrammierung zur Errichtung von großflächigen hiPSC Bibliotheken, wie episomalen Vektoren, Sendai-Virus oder mRNA, über integrative Verfahren der Reprogrammierung 23.
Zweitens ist Haar leicht zugänglich und kann von den Patienten selbst ohne die Verwendung von invasiven Verfahren oder die Teilnahme an medizinischen Personal geerntet werden. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit für die Patienten aus verschiedenen Regionen zu sammeln und zu Mail in ihre eigenen Haare Proben an das Labor für Keratinozyten-Ableitung und anschließender Reprogrammierung. Unterstützung der Durchführbarkeit dieser Strategie unserer unveröffentlichten Daten zeigen, dass Keratinozyten erfolgreich aus gezupften Haare, die bei 4 ° C für bis zu 10 Tage gelagert wurde, isoliert werden.
Die hier beschriebene Methodik wird die Ableitung von Keratinozyten aus gezupften Haare ermöglichen. Während Keratinozyten aus nur einem einzigen Haar abgeleitet werden, ist unsere Empfehlung, mindestens 5 Anagenhaare für Keratinozyten-Ableitung zu sammeln. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass einige Haare nicht gut zu befestigen und die Keratinozyten möglicherweise nicht wachsen. Dickeres Haar tendenziell besser zu befestigen, während feines Haar erfordert reduzierten Menge an Kulturmedium während des Plattierens zu vermeiden, schwimmend und verbessern Befestigung. Sobald Keratinozyten werden abgeleitet, ist es ratsam, zu erweitern und zu gefrieren unten Aktien unter Verwendung von Standard langsam Einfrieren Kryokonservierung Methoden 16. Nachfolgende Umprogrammierung der Keratinozyten können in diesem Protokoll beschriebenen folgenden Schritte durchgeführt werden. Es ist wichtig,beachten Sie, dass die Proliferationsrate der Ausgangszellen kann die Neuprogrammierung Effizienz auswirken, mit verringert Umprogrammierung Effizienz in späten Passagen beobachtet, wie Zellen erreichen zelluläre Seneszenz 25-27. In diesem Zusammenhang verwenden Keratinozyten spätestens Durchlass 6 für Neuprogrammierung Experimente. Außerdem kann eine Anpassung Wirkungsgrade zwischen den verschiedenen Einzel Keratinozyten variieren.
Neuere Studien legen nahe verbreiteten genetischen Mosaik in mehrere Arten von somatischen Geweben 28, mit ~ 30% berichtet, dass somatische CNVs im Genom 29 haben Hautfibroblasten. Diese CNVs kann durch Fehler in der DNA-Replikation, DNA-Reparatur oder Transposon Mobilisierung verursacht werden. Es ist auch möglich, dass bei längerer UV-Strahlung auf die Haut können zusätzliche CNV in epidermalen Zellen, einschließlich Fibroblasten und Keratinozyten zu verursachen, aber das Ausmaß dieser nicht gut verstanden. Wie CNVs in Keratinozyten während der Umprogrammierung über durchgeführt werden, ist es imwichtige Routine Karyotypisierung oder CNV Analyse durchzuführen, um sicherzustellen, dass die festgestellten hiPSCs halten genomische Stabilität. Zusammengefasst haben wir hier beschriebenen Verfahren für die Erzeugung von hiPSCs Haar abgeleitete Keratinozyten, die für Krankheitsmodelle und der regenerativen Medizin verwendet werden könnten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5x Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10 mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1 mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5 µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5 µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10 µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
References
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