Protocol
1. הכנת צלחות אגר הזרקה (זמן: 45 דקות)
- מרתיחים agarose 2% עד 3% בתקשורת E3 ולאפשר פתרון להתקרר מעט על ספסל. הערה: מספר צלחות הזרקת הכנה מכתיב את כמות agarose הנדרשת. כל צלחת הזרקה צריכה כ 35 מיליליטר של פתרון agarose.
- לאחר הרתיחה, לאפשר agarose להתקרר עד לטמפרטורה רצויה (למשל., C ° 45) כמו לכל הוראות יצרן עובש הזרקה.
- יוצקים כ 35 מיליליטר של מקורר agarose לתוך צלחת 100 מ"מ.
- מניחים בקצה אחד של עובש הזרקה מועדפת לפתרון, אז שכב שארית העובש על פתרון agarose (זה יעזור להפחית את ההתרחשות של בועות אוויר).
- אפשר פתרון agarose כדי לחזק או ב RT או 4 מעלות צלזיוס למשך כ 30 דקות.
- השתמש במרית כדי להפריד קצה אחד של העובש מagarose המוצק. לאט לאט להסיר את שארית מ ' יָשָׁן.
2. הכנת אוונס הכחול צבע (EBD) הזרקת מיקס (זמן: 30 דקות)
- הפוך מניית 1% מEBD בפתרון של 1X רינגר (155 מ"מ NaCl; 5 מ"מ KCl; 2 מ"מ CaCl 2; 1 מ"מ MgCl 2; 2 מ"מ Na 2 4 HPO; 10 מ"מ HEPES; 10 גלוקוז מ"מ; pH 7.2), אשר יכול להיות מאוחסן בRT.
- הפוך פתרון מניות של isothiocyanate והעמסת (FITC) -dextran MW 10,000 kDa ב 25 מ"ג / מ"ל בפתרון של 1X רינגר ולאחסן ב -20 ° C.
- הכן תערובת הזרקה על ידי דילול EBD 0.1% ישירות במניות פתרון של מניית FITC-dextran (כלומר, לעבודת נפח סופי של 100 μl:. מערבבים 10 μl של EBD 1% ב -90 μl של מניית dextran FITC).
- ביסודיות לערבב זריקת מערבולת (זה צריך להפוך ירוק) ולשמור את האור הישיר על ידי עטיפת צינור תערובת הזרקה ברדיד אלומיניום.
3. הזרקת EBD הכנה (זמן: כ -30 דקות)
אף אוזן גרון "> הערה: הפרוטוקול עובד הכי טוב עם זחלים מן 3-7 ימים לאחר הפריה (DPF).- צלחת הזרקה טרום חמה לRT.
- הגדרת מנגנון הזרקה על ידי סידור micromanipulator על לוחית מתכת ולעמוד ליד מיקרוסקופ משמש להזרקה. הפעל בקר microinjection אוויר מונע. הערה: מערכת ההזרקה העדיפה תשתנה על ידי מעבדה ולא צריך לשנות תוצאה של ניתוח.
- חזרה למלא מחט זריקה עם כ 2-4 μl של תערובת EBD.
- לכייל נפח הזרקה לכ 5 NL של תערובת EBD. הערה: כיול נפח הזרקה יהיה תלוי בשיטת כיול. הזרקת בוכנה מונעת ניתן להגדיר ישירות לניתן זריקת נפח ואילו מזרקי לחץ הגז יצטרכו ההזרקה מכוילת באמצעות בולוס נפח עם השימוש של מיקרומטר הנפח.
- צלחת הזרקה רטובה עם הפתרון של 1X רינגר ולהסיר עודפים מבארות.
- זחלים טרום לטפל עם סאל methanesulfonate אתיל 0.04% 3-aminobenzoatet (tricaine) בדילול מלא בפתרון של 1X רינגר כדי לשתק זחלים לפני תחילת ההזרקה. הערה: הבטחת הזחלים immotile לחלוטין חשובה כמו הזרקה נכונה היא קשה עם כל תנועה שיורית.
- הנח זחלים מורדמים לבארות של צלחות ההזרקה אגר באמצעות פיפטה זכוכית. ודא שהזחלים נמצאים בלגמרי טוב ושוכב על הצד שלהם. הערה: מספר הזחלים לכל גם הוא עד לנסיין.
- לאחר הזחלים לשים בבארות, להסיר הפתרון של רינגר העודף כדי למזער את תנועת זחלים בתוך הבאר. השאר סכום שייר של פתרון כל כך זחלים שלא ליבש.
4. הזרקת קרום הלב של דג הזברה זחלים עם EBD (זמן: תלוי במספר הזרקת זחלים, מוערכת 1-3 שעות)
- מניחים את צלחת ההזרקה המכילה את הזחלים בהיקף לנתח בי הזריקות תבוצענה.
- מקם את מחט פיפטה ההזרקה המכילהEBD לערבב על זחלי דג הזברה.
- מחדש את עמדת צלחת ההזרקה ידי סיבוב זה כל כך את מחט הזריקה היא ליד הלב של הזחלים וכ 45 ° ventrally מהציר הקדמי-אחורית.
- הכנס את מחט הזריקה לתוך וריד הקרדינל הנפוץ (CCV) באזור של הווריד בחלק הקדמי של החלמון בי הווריד תחילה פונה לכיוון הגב (איור 1). הערה: הגדלה של עד 40x עשויה להיות שימושית כדי לראות את CCV ברור.
- הזרק 5 NL של תערובת EBD ולשמור מחט זריקה בעמדה במשך 5-8 שניות למזעור זליגה מיידית של תערובת EBD. הערה: הזרקה טובה תהיה צבע לצבוע ראה בחדרי הלב (איור 1). אם תערובת EBD לא נצפתה בלב, אז הזרקת 5 NL נוסף של תערובת EBD עשוי להיות מספיק כדי לגרום ספיגת צבע. לחלופין, יכול להיות מושלך העובר.
הערה: במצבים מסוימים, הלב עלול להפסיק לפעום. אם o זהccurs, תמשיך לעקוב אחר הזחלים ל20-40 שניות. בדרך כלל, הלב פועם קורות חיים כצבע עובר דרך מערכת הדם. - לעבור על הזחלים וחזור הבאים.
- לזהות עוברים הוחדרו בהצלחה על ידי התבוננות נוכחות FITC-הפולימרים בכלי הדם מייד לאחר ההזרקה (איור 2).
5. דגירה וEBD ספיגה (זמן: 4-6 שעות)
- לאחר המספר הרצוי של זחלים מוזרקים, תמורה הזריקו זחלים לפתרון של 1X רינגר ללא tricaine ב100 מנות מ"מ.
- שמור מנות עטופות ברדיד אלומיניום. הערה: שמירה על זחלים מוזרקים בחושך מגדילה באופן משמעותי את שיעורי הישרדות ומבטיחה את העקביות הגדולה ביותר בעוצמת אות. עטיפה בנייר אלומיניום חשובה במיוחד עבור פרק זמן שהזחלים הם מחוץ לחממה.
- לאפשר זחלים כדי לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס במשך 4-6 שעות על מנת להבטיח ספיגת EBD מספיק. 6. ויזואליזציה של EBD בשריר (הזמן: תלוי במספר הזרקת זחלים והסוג של מיקרוסקופ, שעה 0.5-3 משוערת)
- לפני ההדמיה, להרדים את הזחלים עם tricaine 0.04% כדי למנוע תנועה.
- צפה בזחלים תחת הקרינה אדומה כדי לקבוע אם ספיגת EBD מתרחשת בשרירי השלד (איור 3).
Representative Results
תמהיל הזרקת EBD הוזרק לCCV של מוטציות הומוזיגוטים sapje ואחים בר-סוג 3 DPF. זריקות שמלאו את חדרי לב (איור 1) ולאחר מכן נותחו לזריקה מוצלחת על ידי לדמיין FITC-פולימרים בכלי הדם תחת הקרינה ירוקה (איור 2).
לאחר תקופת דגירה 4 שעות, ספיגת EBD נבדקה ברמת somite באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אחים סוג בר הציגו שום הקרינה EBD בתוך כל סיבי שריר גלויים (איור 3 א), ואילו מוטציות הומוזיגוטים sapje הראו ספיגת EBD, המצביע על נזק לשריר הקרום 15 (איור 3).
איור 1. לערבב הזרקת ההזרקה EBD לוריד הקרדינל הנפוץ (CCV) של אמברי דג הזברהo. עובר () uninjected. חץ מציין מיקום אידיאלי להזרקת CCV. זריקה מוצלחת לCCV (B). הצבע נכנס לחדרי הלב (החץ) ומתחיל להישאב דרך כלי הדם. (ג) הזרקת CCV לא מוצלחת תגרום חלק או את כל הצבע שנכנס לצק החלמון של העובר (חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עוברים 2. איור ניתן למיין לזריקה מוצלחת על ידי התבוננות הפצת FITC-dextran תחת הקרינה ירוקה לאורך כלי הדם לאחר הזרקה ולפני ספיגת EBD מייד.אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: EBD יילקח על ידי סיבים עם ממברנות פגומות אחים wildtype () לא מראים הקרינה EBD בסיבי שריר.. (ב) מוטציה הומוזיגוטים Sapje עם הקרינה EBD בתוך סיבי שריר מרובים (חיצים). כל הזחלים הוזרקו תערובת הזרקת EBD ונותחו לאחר תקופת דגירה 4 שעות ב 3 DPF. אחים ומוטציות מוינו על ידי ניתוק סיבי שריר לפני הזרקת CCV. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
דג הזברה הם מתעוררים ככלי רב עוצמה לחקר מחלה עצבית-שרירית 2,29. עד כה, מערכת דג הזברה נעשתה שימוש כדי לאמת את המוטציות הגורמות למחל שריר חדש 16,17,30, להבהיר pathomechanisms רומן 18, ולזהות תרופות טיפוליות פוטנציאלי חדשות 12,24. מאמצים הקולקטיביים אלה הקימו את השירות של דג הזברה מודל מחלות עצבית-שרירית אנושיות. עם זאת, למרות ההתקדמות שנעשתה עם מודלים דג הזברה ויונקים, יש אפשרויות טיפול מוגבלות לחולים בתוך הספקטרום הרחב של מצבים עצבית-שרירית. לכן, דרישה גבוהה קיימת לפיתוח טיפול לקבוצה זו של מחלות הרסניות. במקביל לדרישה זו לתרופות הוא הצורך המקביל לחדשנות מתמשכת ניסיונית, כמו גם ניתוח קפדני כדי לוודא מודלים של בעלי חיים חדשים ואסטרטגיות טיפוליות המשוערות.
ניתוח EBD משמש בדרך כלל במודלים של עכברים לרקמת מחקר ונזק לתאים במוח, לב, ו27,31 שרירי שלד. בעיקר, EBD נעשה שימוש נרחב במודלים של עכברים של תת ניוון שרירים שונים כדי להראות את החומרה של חוסר יציבות קרום שריר וניזק 8. השימוש בEBD לחשוף נזק קרום שריר הוא פרמטר תומך הקמת דמיון של מודל החיה למצב המחלה האנושי 9. כוחו של EBD בעכבר הוביל כמה מעבדות, כוללים שלנו, לפתח וליישם EBD לדגמי דג הזברה של מחלה עצבית-שרירית. בשל תחולתו של ניתוח EBD, טכניקה זו מיושמת באופן פעיל כדי לאשש דגמי דג הזברה למצב המחלה האנושי 11,15,22,24,32. זחלים עם ממברנות שריר פגועות יהיו ספיגת EBD וקרינה לכן אדומה בתוך סיבי שריר. הקרינה שנצפתה בחלל הבין-סיבים, אך לא בתוך סיבי שריר בודדים יכולה להיות גם להיות אינפורמטיבי של סיבי ניתוק מהקרום במרתף בtהוא היעדר נזק קרום, מתן פירוט אבחון שימושי. יש ניתוח EBD יישום פוטנציאל מעבר אימות מודל חיה. מאמצים מהמעבדה שלנו הוכיחו לאחרונה כי ניתוח EBD מועיל באימות תרופות טיפוליות פוטנציאלי רומן 24. קביעה אם טיפולים טיפוליים פוטנציאל להפחית או לבטל ספיגת EBD במודלי מחלה עצבית-שרירית יכולים לסמן פעולה טיפולית רלוונטית 8. סוג זה של ניתוח יכול לעזור להקים את המנגנון (ים) של תרופות ומרחיב את היישום של ניתוח EBD.
כמו בטכניקות רבות, ניתוח EBD יש לי כמה אזהרות שנצפו במהלך עיצוב ובפועל ניסיוניים. לדוגמא, זה יכול להיות מאתגר לזהות CCV בשל העיבוי של הרקמות עם גיל. בנוסף, קל לפגוע זחלים בהכנה לפני ובמהלך הזרקת קרום הלב, הפחתת ספירה ניסיונית והגדלת הצורך מכין מספר גדול של זחלים.יתר על כן, נזק פיזי שנגרם לזחלים במהלך טיפול והזרקה עלול לגרום לתוצאות חיוביות שגויות כמו שריר שנפגע יכול לקחת עד EBD. על מנת להתגבר על חלק מהמכשולים הללו, שתארנו את אסטרטגית שיתוף הזרקה במאמר זה וידאו, המאפשר זיהוי קל ואמין של זחלים עם עירוי צבע מוצלח מייד לאחר הזרקה ולפני ניתוח שלאחר מכן. FITC-dextran בקרות שיתוף הזרקה להזרקה מוצלחת על ידי מתן אישור של EBD בכלי הדם לפני ספיגתו על ידי סיבי השריר. זה יכול להיות שימושי במיוחד כקרינת EBD הופכת מפוזרת מאוד בזחלים לאחר כמה שעות אם לא נאסף בסיבי השריר; ככזה, הוא יכול להיות קשה לזהות. בנוסף, חסר CCV והזרקת EBD לתוך חלל החלמון או גוף יכול, לאחר דגירה, לגרום לקרינה אדומה מפוזרת דומה לשלוט עוברים, עדיין עם הסיכוי המופחת של ספיגה על ידי סיבי שריר פגועים. באופן קולקטיבי, מערה אלהATS מציע הזרקת EBD דורשת סבלנות ותרגול כדי להשיג תוצאות עקביות ואמינות.
בסך הכל, אנו מתארים שיטה מעשית ופשוטה לביצוע ניתוח EBD על זחלי דג הזברה. נכון להיום, השימוש בדג הזברה כמערכת מודל, במיוחד כמודל מחלה אנושי, כבר מתרחב במהירות. הרחבה זו היא באופן חלקי בשל הפיתוח והשינוי המתמשכים של שיטות ניסיוניות שלשפר את היתרונות הנוכחיים של מערכת דג הזברה. טכניקת הזרקת EBD מספקת כלי נוסף ורב עוצמה לארסנל של חוקר לאימות והמחקר של מודלים מחלת שריר דג הזברה. יש יישום והשינוי המתמשך של טכניקה זו יש הפוטנציאל לסייע לחשוף אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, כמו גם מנגנוני מחלה גורמת.
Disclosures
יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.
Acknowledgments
ברצוננו להודות טרנט וו לקבלת הסיוע הטכני שלו. אנחנו גם מכירים מחלקת הילדים בבית החולים לילדים וקיור מולדים ניוון שרירים (CMD) למימון הנדיב שלהם לפרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
References
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P.
- Yoshida, M., Ozawa, E.
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
