Protocol
1. Bereiding van injectie Agar platen (Tijd: 45 min)
- Kook 2% tot 3% agarose in E3 media en laat de oplossing enigszins afkoelen op de bank. Opmerking: Het aantal injectie platen voorbereid bepaalt het aantal agarose vereist. Elke injectie plaat moet ongeveer 35 ml van de agar-oplossing.
- Na het koken kan de agarose afkoelen tot de gewenste temperatuur bereikt (bv., 45 ° C) volgens de instructies van de fabrikant spuitgietmatrijs.
- Giet ongeveer 35 ml van de agarose afgekoeld in een 100 mm schaal.
- Plaats het ene uiteinde van de voorkeur injectie schimmel in de oplossing, dan leg rest van schimmel op agarose oplossing (dit zal bijdragen tot het verminderen van het optreden van luchtbellen).
- Laat de agarose oplossing stollen, hetzij bij kamertemperatuur of 4 ° C gedurende ongeveer 30 min.
- Gebruik een spatel om een uiteinde van de mal te scheiden van de vaste agarose. Verwijder langzaam de rest van de m oud.
2. Voorbereiding van Evans Blue Dye (EBD) Injection Mix (Tijd: 30 min)
- Maak een 1% voorraad EBD in 1X Ringer's oplossing (155 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2 mM Na 2 HPO 4, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, pH 7,2), die kan worden bewaard bij kamertemperatuur.
- Voeg een voorraadoplossing van fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) -dextran MW 10.000 kDa bij 25 mg / ml in 1X Ringer's oplossing en bewaar bij -20 ° C
- Bereid injectie mix door verdunning EBD tot 0,1% direct op voorraad oplossing van FITC-dextran voorraad (dat wil zeggen, voor een laatste werkvolume van 100 pl. Meng 10 ul van 1% EBD in 90 ul van FITC dextran voorraad).
- Grondig vortex injectie mix (het moet groen worden) en uit direct licht te houden door wikkelen injectie mix buis in aluminiumfolie.
3. EBD Injectie Voorbereiding (Tijd: Ongeveer 30 min)
ent "> Opmerking: protocol werkt het beste met de larven 3-7 dagen na de bevruchting (DPF).- Pre-warm injectie plaat RT.
- Opgericht injectie apparaat door het organiseren van micromanipulator op metalen plaat en staan naast de microscoop wordt gebruikt voor injectie. Zet lucht gedreven micro-injectie controller. Opmerking: De geprefereerde injectiesysteem is afhankelijk van lab en niet resultaat van de analyse wijzigen.
- Terug vullen injectienaald met ongeveer 2-4 pi EBD mix.
- Kalibreren injectie volume tot ongeveer 5 nl van EBD mix. Opmerking: Injectievolume kalibratie zal afhangen van de kalibratie methode. Een zuiger aangedreven injectie kan direct worden ingesteld op een bepaald injectievolume dat gasdruk injectors het injectievolume gekalibreerde via volume bolus met behulp van een micrometer nodig.
- Natte injectie plaat met 1X Ringer's oplossing en verwijder overtollige uit putten.
- Pre-treat larven met 0,04% ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat salt (tricaïne) verdund in 1X Ringer's oplossing larven vóór aanvang van de injectie immobiliseren. Opmerking: Zorgen larven zijn volledig immotile is belangrijk als een goede injectie is moeilijk met enige resterende beweging.
- Plaats verdoofde larven in putjes van de injectie agar platen met een glazen pipet. Zorg ervoor dat de larven zijn volledig binnen de put en liggen op hun kant. Opmerking: Het aantal larven per goed is aan de experimentator.
- Na larven worden in de putten, verwijderen overtollige Ringer-oplossing voor larven verkeer binnen de put te minimaliseren. Verlaat een resterende hoeveelheid oplossing, zodat de larven niet uitdrogen.
4. Pericardvocht Injectie van zebravis Larven met EBD (Tijd: Afhankelijk van het aantal larven injecteren, naar schatting 1-3 uur)
- Plaats de injectieplaat met de larven op een dissectie bereik waar de injectie zal worden uitgevoerd.
- Plaats de injectie pipet met naaldhet EBD mix over een zebravis larven.
- Re-positie van de injectie plaat door te draaien, zodat de injectienaald ligt in de buurt van het hart van de larven en ongeveer 45 ° ventraal van de anterior-posterior as.
- Steek de injectienaald in het gemeenschappelijk hoofdader (CCV) in het gebied van de ader in het voorste deel van de dooier, waar de ader aanvankelijk draaien in de dorsaal (figuur 1). Opmerking: Een vergroting tot 40x kan nuttig zijn om duidelijk de CCV zijn.
- Injecteren 5 nl van EBD mix en houden injectienaald in positie voor 5-8 sec onmiddellijk lekkage van EBD mix te minimaliseren. Opmerking: Een goede injectie zal kleurstof kleuring gezien in de hartkamers (Figuur 1) hebben. Als EBD mix niet wordt waargenomen in het hart, dan is het injecteren van een extra 5 nl van EBD mix kan voldoende zijn om kleurstofopname induceren. Alternatief kan het embryo worden weggegooid.
Opmerking: In sommige situaties kan de hartslag stoppen. Indien dit occurs, blijven toezien op de larven van 20-40 sec. Kenmerkend het hart hervat kloppen de kleurstof door het vaatstelsel beweegt. - Gaan naar de volgende larven en herhaal.
- Identificeer succes geïnjecteerde embryo's door het observeren van de aanwezigheid van FITC-dextran in het vaatstelsel onmiddellijk na injectie (Figuur 2).
5. Incubation en EBD Opname (Time: 4-6 uur)
- Nadat het gewenste aantal larven geïnjecteerd, terug geïnjecteerd larven 1X Ringer's oplossing zonder tricaïne in 100 mm schalen.
- Houd gerechten gewikkeld in aluminiumfolie. Opmerking: Het houden geïnjecteerd larven in het donker verhoogt overlevingskansen en zorgt voor de grootste consistentie in de signaalsterkte. Wrapping in aluminiumfolie is vooral belangrijk voor de tijdsperiode dat de larven zich buiten de incubator.
- Sta larven te incuberen bij 28,5 ° C gedurende 4-6 uur voldoende EBD opname te garanderen. 6. Visualisatie van EBD in de spier (Tijd: Afhankelijk van het aantal larven injecteren en het type van microscopie, geschatte 0,5-3 uur)
- Voorafgaand aan beeldvorming verdoven de larven 0,04% tricaïne om verplaatsing te voorkomen.
- Bekijk larven onder rode fluorescentie te bepalen of EBD opname plaatsvindt in de skeletspier (figuur 3).
Representative Results
De EBD injectie mengsel werd geïnjecteerd in het CCV van Sapje homozygote mutanten en wild-type broers en zussen op 3 dpf. Injecties de hartkamers (Figuur 1B) gevuld werden vervolgens geanalyseerd op een succesvolle injectie visualiseren FITC-dextran in het vaatstelsel onder groene fluorescentie (figuur 2).
Na een 4 uur incubatietijd werd EBD opname onderzocht op het somiet niveau met behulp van fluorescentie microscopie. Wild-type broers vertoonden geen EBD fluorescentie binnen zichtbare spiervezels (figuur 3A), terwijl de Sapje homozygote mutanten vertoonden EBD opname, aangeeft schade aan de spier membraan 15 (figuur 3B).
Figuur 1. Injecteren EBD injectie mix in de gemeenschappelijke kardinaal ader (CCV) van een zebravis embryo. (A) geïnjecteerde embryo. Pijl geeft ideale locatie voor CCV injectie. (B) De succesvolle injectie in de CCV. De kleurstof gaat de hartkamers (pijl) en begint door het vaatstelsel te verpompen. (C) Een mislukte CCV injectie zal resulteren in sommige of alle van de kleurstof het invoeren van de dooierzak van het embryo (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Embryo's kunnen worden gesorteerd voor een succesvolle injectie observeren FITC-dextran distributie onder groene fluorescentie gehele vaatstelsel direct na injectie en voorafgaande aan EBD opname.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: EBD zal worden genomen door vezels met beschadigde membranen (A) Wildtype broers toont geen EBD fluorescentie in spiervezels.. (B) Sapje homozygote mutant met EBD fluorescentie binnen meerdere spiervezels (pijlen). Alle larven werden geïnjecteerd met EBD injectie mix en na 4 uur incubatie periode bij 3 dpf geanalyseerd. Broers en zussen en mutanten zijn gesorteerd op spiervezels detachement voorafgaand aan CCV injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Zebravis zijn in opkomst als een krachtig instrument voor de studie van neuromusculaire ziekten 2,29. Tot op heden heeft de zebravis systeem is gebruikt om nieuwe spier ziekte veroorzaken mutaties 16,17,30 valideren, verhelderen roman pathomechanismen 18, en identificeren van potentiële nieuwe therapeutische medicijnen 12,24. Deze gezamenlijke inspanningen hebben het nut van de zebravis te modelleren menselijk neuromusculaire ziekten vastgesteld. Ondanks de vorderingen bij zebravissen en zoogdieren modellen zijn er beperkte behandelingsmogelijkheden voor patiënten binnen het brede spectrum van neuromusculaire aandoeningen. Daarom bestaat er een grote vraag naar de ontwikkeling van therapie voor deze groep verwoestende ziekten. Parallel deze vraag naar therapeutica is de overeenkomstige behoefte aan voortdurende experimentele innovatie en nauwkeurige analyse van nieuwe diermodellen en vermeende therapeutische strategieën te verifiëren.
EBD analyse wordt vaak gebruikt in muismodellenstudie weefsel en cellulaire schade in de hersenen, het hart en de skeletspieren 27,31. Met name wordt EBD uitgebreid gebruikt in muismodellen van spierdystrofie verschillende subtypes van de ernst van spiermembraan instabiliteit tonen beschadigen 8. Het gebruik van EBD spier membraanschade onthullen een ondersteunend parameter vaststelling gelijkenissen van het diermodel voor menselijke ziektetoestand 9. De kracht van EBD in muizen heeft geleid verschillende laboratoria, inclusief onze eigen, te ontwikkelen en toe te passen EBD op zebravis modellen van neuromusculaire ziekten. Door de toepassing van EBD analyse wordt deze techniek actief uitgevoerd om zebravismodellen bevestigen aan de menselijke ziektetoestand 11,15,22,24,32. Larven met beschadigde spier membranen zal EBD opname en dus rode fluorescentie binnen spiervezels hebben. Fluorescentie waargenomen in de ruimte tussen de vezels, maar niet binnen de individuele spiervezels ook informatieve vezels loskomen van de basaalmembraan in t te bedragenhij afwezigheid van membraan schade, het verstrekken van nuttige diagnostische detail. EBD analyse heeft mogelijke toepassing buiten diermodel validatie. Inspanningen van ons lab hebben onlangs aangetoond dat EBD analyse is gunstig in het valideren van potentieel nieuwe therapeutische geneesmiddelen 24. Bepalen of potentiële therapeutische behandelingen te verminderen of af te schaffen EBD opname in neuromusculaire ziekten modellen kunnen relevante therapeutische werking 8 betekenen. Dit type analyse kan helpen bij het vaststellen van de mechanisme (n) van therapeutica en breidt de toepassing van EBD analyse.
Zoals met vele technieken, heeft EBD analyse hebben een aantal kanttekeningen bij experimenteel ontwerp en de praktijk worden nageleefd. Zo kan het een uitdaging om de CCV identificeren vanwege de verdikking van het weefsel met de leeftijd. Bovendien is het gemakkelijk om larven in voorbereiding schade voor en tijdens de pericardiale injectie verminderen experimentele telt en het verhogen van de noodzaak om grote aantallen larven prep.Bovendien kan de fysieke schade aan de larven tijdens de behandeling en de injectie resulteren in valse positieven als beschadigde spieren kunnen opnemen EBD. Om sommige van deze obstakels te overwinnen, hebben we een co-injectie strategie beschreven in deze video artikel dat gemakkelijke en betrouwbare identificatie van larven succesvolle kleurstof infusie direct na injectie en voorafgaande aan verdere analyse. De FITC-dextran co-injectie controles voor een succesvolle injectie mogelijk bevestigd EBD in het vaatstelsel vóór de opname door de spiervezels. Dit kan vooral handig zijn als EBD fluorescentie wordt zeer diffuus in larven na enkele uren, zo niet verzameld in de spiervezels; als zodanig kan het moeilijk te detecteren. Bovendien ontbreekt het CCV en het injecteren EBD in het eigeel of lichaamsholte kan, na incubatie, leiden tot diffuse rode fluorescentie Soortgelijke embryo bedienen, doch met verminderde waarschijnlijkheid van opname door beschadigde spiervezels. Gezamenlijk zijn deze grotats suggereren EBD injectie vergt geduld en oefening om consistente en betrouwbare resultaten te bereiken.
In al beschrijven we een praktische en eenvoudige methode om EBD analyses uitvoeren op zebravis larven. Tot op heden het gebruik van zebravis als modelsysteem, vooral als mens ziektemodel, is snel groeiende. Deze uitbreiding is deels te wijten aan de verdere ontwikkeling en aanpassing van de experimentele technieken die verbetering op de huidige voordelen van de zebravis systeem. De EBD injectietechniek geeft een extra en krachtige tool om het arsenaal van een onderzoeker voor de validatie en de studie van zebravis spierziekte modellen. De lopende uitvoering en aanpassing van deze techniek heeft de potentie om te ontdekken van nieuwe therapeutische strategieën en ziekteverwekkende mechanismen.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
We willen Trent Waugh bedanken voor zijn technische bijstand. We hebben ook erkennen de afdeling Kindergeneeskunde van het Hospital for Sick Children en Cure aangeboren Spierdystrofie (CMD) voor hun genereuze financiering voor dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
References
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P.
- Yoshida, M., Ozawa, E.
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
