Protocol
1. Préparation de plaques de gélose d'injection (Durée: 45 min)
- Faire bouillir 2% à 3% d'agarose dans les médias E3 et laisser la solution refroidir légèrement sur le banc. Note: Le nombre de plaques d'injection en cours de préparation dicte la quantité d'agarose requis. Chaque plaque d'injection a besoin d'environ 35 ml de la solution d'agarose.
- Après l'ébullition, laisser refroidir l'agarose jusqu'à ce que la température désirée est atteinte (par ex., 45 ° C) selon les instructions du fabricant de moule d'injection.
- Verser environ 35 ml de la refroidies agarose dans un plat de 100 mm.
- Placez une extrémité du moule d'injection préférée dans la solution, puis posez reste de moule sur une solution d'agarose (cela va aider à réduire l'apparition de bulles d'air).
- Laisser la solution d'agarose se solidifie soit à la température ambiante ou 4 ° C pendant environ 30 min.
- Utiliser une spatule pour séparer une extrémité du moule à partir de l'agarose solide. Retirez lentement le reste de la m Agé de.
2. Préparation du colorant bleu Evans (EBD) Injection Mix (Durée: 30 min)
- Faire un 1% stock d'EBD dans une solution de 1X Ringer (NaCl mM 155; KCl 5 mM, CaCl2 2 mM; 1 mM MgCl 2; 2 mM Na 2 HPO 4; HEPES 10 mM, 10 mM de glucose; pH à 7,2), qui peuvent être stockées à température ambiante.
- Faire une solution de réserve de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -dextrane MW 10.000 kDa à 25 mg / ml dans la solution et magasin de 1X Ringer à -20 ° C
- Préparer mélange d'injection en diluant EBD à 0,1% directement dans la solution mère de stock FITC-dextran (ie, pour un volume de travail final de 100 pi. Mélanger 10 pi de 1% EBD dans 90 ul d'actions dextran FITC).
- Bien agiter au vortex mélange d'injection (il doit devenir vert) et de garder hors de la lumière directe en enroulant tube de mélange d'injection dans une feuille d'aluminium.
3. Injection Préparation EBD (Durée: Environ 30 min)
ent "> Remarque: Protocole fonctionne mieux avec des larves de 3-7 jours après la fécondation (DPF).- Préchauffer plaque d'injection à la température ambiante.
- Mettre en place des appareils d'injection en organisant micromanipulateur sur la plaque de métal et se tenir à côté du microscope étant utilisé pour l'injection. Tournez sur le contrôleur de micro-injection d'air entraîné. Remarque: Le système d'injection préférée varie en laboratoire et ne devrait pas changer résultats de l'analyse.
- Retour combler aiguille d'injection à environ 2-4 pi de EBD mix.
- Calibrer volume d'injection à environ 5 nl de EBD mix. Remarque: le calibrage de volume d'injection dépendra de la méthode d'étalonnage. Une injection à pistons entraînés peut être directement fixé à un volume d'injection étant donné que les injecteurs à pression de gaz devront le volume d'injection calibrée par le volume de bolus à l'aide d'un micromètre.
- Plaque d'injection humide avec une solution de Ringer 1X et enlever l'excès de puits.
- Larves pré-traitement avec 0,04% éthyl-3 benzoate méthanesulfonate salt (tricaïne) dilué dans une solution de Ringer pour immobiliser 1X larves avant le début de l'injection. Remarque: Assurer larves sont complètement immobiles est important que l'injection correcte est difficile avec un mouvement résiduel.
- Placer les larves anesthésié dans des puits des plaques de gélose d'injection à l'aide d'une pipette en verre. Assurez-vous que les larves sont complètement à l'intérieur du puits et couché sur le côté. Remarque: Le nombre de larves par puits est à l'expérimentateur.
- Après larves sont mis dans les puits, enlever la solution de Ringer excès pour minimiser le mouvement de larves dans le puits. Laissez une quantité résiduelle de solution pour que les larves ne déshydrate pas.
4. injection péricardique de poisson zèbre larves avec EBD (Durée: en fonction du nombre de larves injection, environ 1-3 h)
- Placer la plaque d'injection contenant les larves sur un microscope à dissection où les injections seront réalisées.
- Placez l'aiguille de pipette d'injection contenantl'EBD mélanger sur une larves de poisson zèbre.
- Repositionner la plaque d'injection en le faisant tourner de sorte que l'aiguille d'injection se trouve à proximité du coeur du larves et environ 45 ° ventralement à partir de l'axe antéro-postérieur.
- Insérez l'aiguille d'injection dans la veine cardinale commune (CCV) dans la région de la veine à la partie antérieure du jaune où la veine est initialement tourne dans le sens de la dorsale (Figure 1). Remarque: Un grossissement de 40x jusqu'à peut être utile de voir clairement la CCV.
- Injecter 5 nl de EBD mélange et de garder aiguille d'injection en position de 5-8 sec pour minimiser les fuites immédiate de EBD mix. Remarque: Une bonne injection aura coloration colorant vu dans les cavités cardiaques (figure 1). Si EBD mélange est pas observé dans le cœur, puis l'injection d'un 5 nl de EBD mélange supplémentaire peut être suffisante pour induire l'absorption de colorant. En variante, l'embryon peut être mis au rebut.
Remarque: Dans certaines situations, le cœur peut s'arrêter de battre. Si ce occurs, continuera à surveiller les larves pour les 20-40 sec. Typiquement, le cœur battant reprend le colorant se déplace à travers le système circulatoire. - Passer à la prochaine larves et répétez.
- Identifier les embryons injectés avec succès par l'observation de la présence de FITC-dextran dans le système vasculaire immédiatement après l'injection (figure 2).
5. Incubation et EBD absorption (Durée: 4-6 h)
- Après le nombre désiré de larves sont injectés, retour injecté larves à la solution de Ringer 1X sans tricaïne en boîtes de 100 mm.
- Gardez plats enveloppés dans une feuille d'aluminium. Remarque: Garder larves injecté dans l'obscurité augmente considérablement les taux de survie et assure la plus grande cohérence dans la force du signal. Emballage en feuille d'aluminium est particulièrement important pour la période de temps que les larves sont à l'extérieur de l'incubateur.
- Laisser larves à incuber à 28,5 ° C pendant 4-6 heures pour assurer l'absorption d'EBD suffisante. 6. Visualisation de EBD dans le muscle (Durée: en fonction du nombre de larves injection et le type de microscopie, estimé 0,5-3 h)
- Avant imagerie, anesthésier les larves avec 0,04% tricaïne pour empêcher le mouvement.
- Voir larves en fluorescence rouge pour déterminer si EBD absorption se produit dans le muscle squelettique (Figure 3).
Representative Results
Le mélange d'injection EBD a été injecté dans la CCV de mutants homozygotes sapje frères et sœurs de type sauvage à 3 DPF. Les injections qui ont rempli les cavités cardiaques (figure 1B) ont ensuite été analysées pour l'injection avec succès par la visualisation de FITC-dextran dans le système vasculaire sous fluorescence verte (figure 2).
Après une période d'incubation de 4 heures, EBD absorption a été examinée au niveau des somites utilisant la microscopie à fluorescence. Frères et sœurs de type sauvage ne présentaient pas de fluorescence à l'intérieur de EBD des fibres musculaires visibles (Figure 3A), tandis que les mutants homozygotes sapje EBD ont montré l'absorption, ce qui indique des dommages à la membrane musculaire 15 (figure 3B).
Figure 1. Injecter EBD mélange d'injection dans la veine cardinale commune (CCV) d'un poisson zèbre Embryo. Embryon (A) non injectée. La flèche indique l'emplacement idéal pour l'injection de CCV. (B) d'injection réussie dans la CCV. Le colorant pénètre dans les cavités cardiaques (flèche) et commence à être pompé à travers le système vasculaire. (C) Une injection de CCV échec se traduira par une partie ou tout le colorant entrant dans le sac vitellin de l'embryon (flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les embryons peuvent être triés pour injection réussie en observant la distribution de FITC-dextran sous fluorescence verte à travers le système vasculaire immédiatement après l'injection et avant EBD absorption.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: EBD sera repris par fibres avec des membranes endommagées fratrie (A) de type sauvage ne présentant pas de fluorescence EBD dans les fibres musculaires.. (B) Sapje mutant homozygote avec EBD fluorescence à l'intérieur des fibres musculaires multiples (flèches). Toutes les larves ont été injectés avec le mélange d'injection EBD et analysée après une période d'incubation de 4 heures à 3 dpf. Frères et sœurs et mutants ont été classés par le détachement de la fibre musculaire avant l'injection de CCV. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Poisson zèbre sont en train de devenir un outil puissant pour l'étude de 2,29 de maladie neuromusculaire. À ce jour, le système poisson-zèbre a été utilisé pour valider le nouveau muscle mutations pathogènes 16,17,30, d'élucider de nouveaux mécanismes pathologiques 18, et d'identifier de nouveaux médicaments potentiellement thérapeutiques 12,24. Ces efforts collectifs ont établi l'utilité du poisson zèbre pour modéliser les maladies neuromusculaires humaines. Cependant, malgré les progrès réalisés avec des modèles de poisson zèbre et de mammifères, il ya des options de traitement limitées pour les patients dans le large spectre de maladies neuromusculaires. Par conséquent, une forte demande existe pour le développement de la thérapie pour ce groupe de maladies dévastatrices. Parallèlement à cette demande de la thérapeutique est la nécessité correspondante de l'innovation expérimentale en cours, ainsi que l'analyse rigoureuse afin de vérifier de nouveaux modèles animaux et des stratégies thérapeutiques putatifs.
Analyse EBD est couramment utilisé dans les modèles de souris dele tissu de l'étude et des dommages cellulaires dans le cerveau, le cœur, et squelettique 27,31 musculaire. Plus particulièrement, EBD est largement utilisé dans des modèles murins de divers sous-types de dystrophie musculaire pour montrer la gravité de la membrane musculaire instabilité et endommager 8. L'utilisation d'EBD pour révéler dommages à la membrane musculaire est un paramètre de soutien à établir des similitudes du modèle animal à l'état de la maladie humaine 9. La puissance de EBD chez la souris a dirigé plusieurs laboratoires, y compris notre propre, de développer et d'appliquer EBD aux modèles de poisson zèbre de maladie neuromusculaire. En raison de l'applicabilité de l'analyse EBD, cette technique est activement mis en œuvre pour corroborer les modèles de poisson zèbre à l'état de la maladie humaine 11,15,22,24,32. Les larves avec des membranes musculaires endommagées aura EBD l'absorption et la fluorescence rouge par conséquent à l'intérieur des fibres musculaires. Fluorescence observée dans l'espace entre les fibres, mais pas à l'intérieur des fibres musculaires individuelles peuvent également être informatif de fibres de détachement de la membrane basale en til absence de dommages de la membrane, fournissant des détails de diagnostic utile. Analyse EBD possède application potentielle au-delà de la validation de modèle animal. Les efforts de notre laboratoire ont récemment démontré que l'analyse EBD est bénéfique dans la validation de nouveaux médicaments potentiellement thérapeutiques 24. Déterminer si les traitements thérapeutiques potentiels réduire ou supprimer EBD absorption dans les modèles de maladies neuromusculaires peut signifier action thérapeutique pertinente 8. Ce type d'analyse peut aider à établir le mécanisme (s) de la thérapeutique et élargit l'application de l'analyse EBD.
Comme avec de nombreuses techniques, l'analyse n'a EBD plusieurs mises en garde doivent être observées lors de la conception et de la pratique expérimentale. Par exemple, il peut être difficile d'identifier la raison de la CCV épaississement du tissu avec l'âge. En outre, il est facile d'endommager les larves dans la préparation avant et pendant l'injection péricardique, réduisant chiffres expérimentaux et l'augmentation du besoin pour préparer un grand nombre de larves.En outre, les dégâts physiques que les larves lors de la manipulation et de l'injection peut entraîner des faux positifs comme le muscle endommagé peut prendre jusqu'à EBD. Afin de surmonter certains de ces obstacles, nous avons décrit une stratégie de co-injection dans cet article vidéo qui permet l'identification fiable et facile des larves avec succès infusion de colorant immédiatement après injection et avant l'analyse ultérieure. Le FITC-dextran contrôles de co-injection pour l'injection de succès, en permettant de EBD confirmation dans le système vasculaire avant son absorption par les fibres musculaires. Cela peut être particulièrement utile comme EBD fluorescence devient très diffus dans les larves après plusieurs heures sinon recueillis dans les fibres musculaires; en tant que tel, il peut être difficile à détecter. En outre, à côté de la CCV et EBD injection dans la cavité du corps jaune ou peut, après incubation, la fluorescence rouge entraîner diffus semblable à contrôler embryons, mais avec le risque réduit d'absorption par les fibres musculaires endommagées. Collectivement, ces grotteats suggèrent injection EBD exige de la patience et de la pratique afin de parvenir à des résultats cohérents et fiables.
En tout, nous décrivons une méthode pratique et simple d'effectuer des analyses sur EBD larves de poisson zèbre. À ce jour, l'utilisation du poisson zèbre comme un système modèle, en particulier comme un modèle de la maladie humaine, a connu une expansion rapide. Cette expansion est due en partie à la poursuite du développement et la modification des techniques expérimentales qui améliorent les avantages sur le système actuel de poisson zèbre. La technique d'injection EBD fournit un outil supplémentaire et puissant à l'arsenal d'un chercheur pour la validation et l'étude des modèles de maladies du muscle de poisson zèbre. La mise en œuvre continue et la modification de cette technique a le potentiel d'aider à découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques ainsi que les mécanismes de la maladie causant.
Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrentes ou d'autres conflits d'intérêts.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Trent Waugh pour son aide technique. Nous reconnaissons également le département de pédiatrie de l'Hôpital pour enfants malades et Cure dystrophie musculaire congénitale (CMD) pour leur généreux financement de ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
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