Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

Published: November 30, 2015 doi: 10.3791/53183
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2,4
1Program in Genetics & Genome Biology, The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Protocol

1. Подготовка агара Инъекции Плиты (Время: 45 мин)

  1. Варить 2% до 3% агарозы в Е3 массовой информации и позволяют решение немного остыть на скамейке. Примечание: готовится Количество инъекций пластин диктует количество агарозы требуется. Каждая инъекция пластины необходимо около 35 мл раствора агарозы.
  2. После кипячения, позволяют агарозы, чтобы охладить до желаемой температуры не будет достигнут (например., 45 ° C) в соответствии с инструкциями для литья под давлением производителя.
  3. Налейте примерно 35 мл охлажденного агарозы в 100 мм блюдо.
  4. Поместите один конец предпочтительного литьевой формы в раствор, а затем лежал остаток плесени на агарозном решения (это поможет уменьшить возникновение воздушных пузырьков).
  5. Разрешить агарозном решение укрепить либо по РТ или 4 ° С в течение примерно 30 мин.
  6. Использование шпателя, чтобы отделить один конец пресс-формы из твердого агарозы. Медленно удалить остаток м старый.

2. Подготовка синий краситель Эванса (EBD) инъекций смеси (Время: 30 мин)

  1. Сделайте 1% запас EBD в растворе 1X Рингера (155 мм NaCl; 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2; 1 мМ MgCl 2, 2 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы; рН 7,2), которые могут быть сохранены при комнатной температуре.
  2. Сделать исходного раствора флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -dextran МВт 10000 кДа при 25 мг / мл в растворе и магазина 1X Рингера при -20 ° С
  3. Готовят смесь впрыска путем разбавления EBD до 0,1% в непосредственно маточного раствора ФИТЦ-декстрана наличии (т.е. для окончательного рабочего объема 100 мкл:. Смешайте 10 мкл 1% EBD в 90 мкл FITC декстрана наличии).
  4. Тщательно вихрь смесь инъекции (должно получиться зеленый) и держаться подальше от прямого света, обернув впрыска трубку смеси в алюминиевую фольгу.

3. EBD введения препарата (время: примерно 30 мин)

ЛОР "> Примечание: Протокол работает лучше всего с личинками из 3-7 дней после оплодотворения (DPF).

  1. Предварительно теплой инъекции пластины до комнатной температуры.
  2. Настройка впрыска аппарат путем организации микроманипулятор на металлической пластине и стоять рядом с микроскопом используются для инъекций. Включите воздушным приводом управления микроинъекции. Примечание: Выбранный система впрыска будет варьироваться в зависимости от лаборатории и не должны изменять результаты анализа.
  3. Вернуться заполнить иглу с примерно 2-4 мкл EBD смеси.
  4. Калибровка объем впрыска приблизительно 5 нл EBD смеси. Примечание: калибровка Объем впрыска будет зависеть от метода калибровки. Поршневым приводом инъекции А может быть непосредственно установлен на заданном объеме впрыска форсунки тогда давление газа потребуется объем впрыска калиброванный с помощью объемного болюса с использованием микрометра.
  5. Влажные инъекции пластина с раствором Рингера 1X и удаления избытка из скважин.
  6. Предварительная обработка личинок с 0,04% этил-3-аминобензойной метансульфонатной продажT (Tricaine) разводили в растворе Рингера 1X иммобилизации личинки до начала инжекции. Примечание: Обеспечение личинки полностью неподвижны важно, так как собственно впрыска трудно с любой остаточной движения.
  7. Поместите анестезированной личинок в лунки агара впрыска с использованием стеклянной пипетки. Убедитесь, что личинки полностью внутри скважины и, лежа на их стороне. Примечание: количество личинок на лунку до экспериментатора.
  8. После личинки помещаются в лунки, удалить избыток раствора Рингера, чтобы минимизировать движение личинок в скважине. Оставить остаточное количество раствора таким образом, что личинки не обезвоживают.

4. перикарда Инъекция данио рерио Личинки с EBD (Время: Зависит от количества личинок инъекций, по оценкам 1-3 ч)

  1. Поместите впрыска пластину, содержащую личинки на вскрытии рамки, где будет выполняться инъекции.
  2. Расположите инъекции пипетки, содержащий иглуEBD смешать по данио личинок.
  3. Re-положении впрыска пластины, повернув его так, инъекционная игла находится рядом сердце личинок и примерно 45 ° вентрально от передне-задней оси.
  4. Вставьте иглу в общей кардинальной вены (CCV) в области вены на передней части желтка, где жила сначала превращается в дорсальном направлении (рис 1). Примечание: увеличение до 40x, может быть полезно четко видеть CCV.
  5. Внедрить 5 нл EBD смеси и держать иглу в положении в течение 5-8 сек, чтобы минимизировать непосредственный утечки EBD смеси. Примечание: Хороший инъекции придется красителя окрашивание видел в камерах сердца (рис 1). Если EBD смесь не наблюдается в центре, то инъекционных дополнительный 5 нл EBD смеси может быть достаточным, чтобы вызвать поглощение красителя. В качестве альтернативы, эмбрион может быть отброшен.
    Примечание: В некоторых ситуациях, сердце может остановиться избиение. Если это оccurs, продолжать следить за личинки 20-40 сек. Как правило, сердце бьется, как возобновляется краситель проходит через кровеносную систему.
  6. Переход на следующий личинок и повторите.
  7. Определить успешно инъекционные эмбрионов, наблюдая присутствие FITC-декстрана в сосудистой сразу после инъекции (Рис.2).

5. Инкубационный и EBD Поглощение (Время: 4-6 ч)

  1. После того, как желаемое количество личинок вводят, возвращение вводили личинок раствора Рингера 1X без Tricaine в 100 мм чашках.
  2. Держите блюда, завернутые в алюминиевую фольгу. Примечание: Ведение вводят личинки в темноте значительно увеличивает выживаемость и обеспечивает наибольшую последовательность в силе сигнала. Упаковка в алюминиевую фольгу особенно важно в период времени, что личинки находятся вне инкубатора.
  3. Разрешить личинки инкубировали при 28,5 ° С в течение 4-6 ч, чтобы обеспечить достаточную поглощение EBD.
    4. 6. Визуализация EBD в мышцах (Время: Зависит от количества личинок инъекций и типа микроскопии, по оценкам, 0,5-3 ч)

    1. До изображений, обезболить личинки с 0,04% Tricaine, чтобы предотвратить движение.
    2. Посмотреть личинки под красной флуоресценции, чтобы определить, поглощение EBD происходит в скелетных мышцах (рисунок 3).

Representative Results

Смесь инъекции EBD вводили в CCV из sapje гомозиготных мутантов и братьев дикого типа в 3 денье. Инъекции, что заполненные камер сердца (Фигура 1В) затем анализировали для успешного инъекции по визуализации FITC-декстрана в сосудистой под зеленой флуоресценции (рисунок 2).

После инкубационного периода 4 ч, поглощение EBD был рассмотрен на уровне сомитов с помощью флуоресцентной микроскопии. Дикие братья типа не обнаруживали EBD флуоресценции в течение каких-либо видимых мышечных волокон (фиг.3А), в то время как sapje гомозиготные мутанты показали поглощение EBD, указывающий повреждение мышечной оболочки 15 (фиг.3В).

фигура 1
Рисунок 1. инъекционных EBD инъекции смеси в общей кардинальной вены (CCV) от рыбок данио Эмбривывода. (А) неинъецированных эмбриона. Стрелка обозначает идеальное место для инъекции CCV. (Б) Успешное инъекций в ССГ. Краситель проникает в камеры сердца (стрелка) и начинает закачивать через сосудистую. (С) Неудачная инъекции ККТ приведет все или некоторые из красителя, входящего в желточный мешок эмбриона (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Эмбрионы могут быть отсортированы для успешного введения, наблюдая FITC-декстран распределение по зеленой флуоресценции на протяжении сосудистой сразу после инъекции и до поглощения EBD.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: EBD будет рассмотрен волокон с поврежденными мембранами (А) дикого типа братьев и сестер, не оказывающем EBD флуоресценции в мышечных волокон.. (Б) Sapje ​​гомозиготных мутант с EBD флуоресценции в несколько мышечных волокон (стрелками). Все личинки вводили в смесь впрыска EBD и проанализированы после инкубационного периода 4 ч при 3 денье. Братья, сестры и мутанты были отсортированы по мышечного волокна отряда перед инъекцией CCV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Данио рерио появляются в качестве мощного инструмента для изучения нервно-мышечной 2,29 заболевания. На сегодняшний день, данио система была использована для проверки новой мышечной болезнетворные мутации 16,17,30, выяснить новые pathomechanisms 18, и выявления потенциально новых терапевтических препаратов 12,24. Эти коллективные усилия установили полезность данио для моделирования заболеваний человека нервно. Тем не менее, несмотря на успехи, достигнутые с данио и млекопитающих моделей, есть ограниченные варианты лечения для пациентов в течение широкого спектра нервно-мышечных условиях. Таким образом, высокий спрос существует для развития терапии для этой группы разрушительных заболеваний. Параллельно это требование терапии является соответствующий необходимость постоянной экспериментальной инноваций, а также тщательного анализа, чтобы убедиться, новые модели животных и предполагаемые терапевтические стратегии.

Анализ EBD обычно используется в моделях мыши, чтобыИсследование тканей и клеточного повреждения в головном мозге, сердце и скелетных мышц 27,31. В частности, EBD широко используется в моделях мыши различных подтипов мышечная дистрофия, чтобы показать серьезность мышечной мембраны нестабильности и повредить 8. Использование EBD выявить повреждения мышц мембраны является благоприятной параметр установления сходства модели животных в болезненном состоянии человека 9. Сила EBD в мыши привело несколько лабораторий, в том числе наши собственные, чтобы разработать и применить EBD, чтобы данио моделей нервно-мышечных заболеваний. Из-за применения анализа EBD, этот метод активно внедряется подтвердить модели данио в состоянии 11,15,22,24,32 болезни человека. Личинки с поврежденными мембранами мышечных придется поглощение EBD и, следовательно, красную флуоресценцию в течение мышечных волокон. Флуоресценции наблюдалась в том, расслоения, но не в отдельных мышечных волокон также может быть информативным волокон отсоединение от базальной мембраны в тон Отсутствие повреждения мембран, обеспечивая полезную диагностическую деталь. Анализ EBD имеет потенциальное применение за пределами проверки модели животных. Усилия от нашей лаборатории недавно продемонстрировали, что анализ EBD выгодно при проверке потенциально новых терапевтических препаратов 24. Определение, если потенциальные терапевтические процедуры сокращения или отмены поглощение EBD в моделях нервно-мышечных заболеваний может означать соответствующую терапевтическое действие 8. Этот тип анализа может помочь установить механизм (ы) терапии и расширяет применение анализа EBD.

Как и во многих методов, анализ EBD действительно есть несколько предостережений, которые должны соблюдаться во время эксперимента и практики. Например, он может быть сложным для идентификации CCV из-за утолщения ткани с возрастом. Кроме того, его легко повредить личинок в подготовке до и во время перикарда инъекции, обработки экспериментальных отсчетов и увеличение необходимость Prep большое число личинок.Кроме того, физический урон на личинок во время обработки и введения может привести к ложным срабатываниям, как поврежденные мышцы может занять до EBD. Для того чтобы преодолеть некоторые из этих препятствий, мы описали стратегию совместным впрыском в этом видео статьи, что позволяет легко и надежно идентифицировать личинок с успешной инфузии красителя сразу же после инъекции и до последующего анализа. ФИТЦ-декстрана управления со впрыском для успешного введения, позволяя подтверждение EBD в сосудистой перед его поглощение мышечными волокнами. Это может быть особенно полезным в качестве флуоресцентного EBD становится сильно размытой, в личинок после нескольких часов, если не собранных в мышечных волокнах; Как таковой, он может быть трудно обнаружить. Кроме того, отсутствует CCV и инъекционных EBD в желтка или полости тела может после инкубации, в результате диффузного красной флуоресценции, подобной контролировать эмбрионов, но с уменьшенной вероятности поглощения поврежденными мышечных волокон. В совокупности, эти пещерыАТС предложить EBD впрыска требует терпения и практики в целях достижения согласованных и надежных результатов.

В целом, мы описываем практичный и простой метод для выполнения анализа EBD на данио личинок. На сегодняшний день, использование рыбок данио в качестве модельной системы, особенно в качестве модели заболеваний человека, быстро расширяется. Это расширение частично из-за дальнейшего развития и модификации экспериментальных методик, которые улучшают от текущих преимуществ данио системы. Техника инъекции EBD обеспечивает дополнительный и мощный инструмент для арсенале исследователя для проверки и изучения моделей данио заболевания мышц. Продолжающийся реализация и модификация этого метода есть потенциал, чтобы помочь раскрыть новые терапевтические стратегии, а также механизмы болезнетворные.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы или другие конфликты интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Трента Ваугх за техническую помощь. Мы также признаем, Департамент педиатрии в больнице для больных детей и вылечить Врожденная мышечная дистрофия (CMD) для их щедрое финансирование для этого проекта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 Sigma FD10S
Evan's Blue Dye Sigma E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040
100 mm Petri dish Fischerbrand FB0875712 Injection mold base
Thin wall glass capillaries World Precision Instruments TW100F-4 For Injection needle
Agarose Bioshop AGA001 Injection mold
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 Injection mold
Sodium chloride Bioshop SOD001 Ringer's solution
Potassium chloride Bioshop POC888 Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate Sigma M2670 Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Ringer's solution
HEPES Sigma H4034 Ringer's solution
Glucose BioBasic GB0219 Ringer's solution
Calcium chloride Sigma C1061 Ringer's solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
  2. Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
  3. Lancet, , 381-845 (2013).
  4. Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
  5. Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
  6. Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
  7. Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
  8. Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
  9. Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
  10. Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
  11. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
  12. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
  13. Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
  14. Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
  15. Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  16. Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
  17. Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
  18. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
  19. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  20. Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
  21. Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
  22. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
  23. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
  24. Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
  25. Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
  26. Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
  27. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
  28. Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
  29. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  30. Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
  31. Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
  32. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).

Tags

Биология развития выпуск 105 врожденные мышечные дистрофии синий краситель Эванса данио целостность сарколеммы миопатия мышечная дистрофия Дюшенна dystroglycanopathies
Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, S. J., Horstick, E. J.,… More

Smith, S. J., Horstick, E. J., Davidson, A. E., Dowling, J. Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye. J. Vis. Exp. (105), e53183, doi:10.3791/53183 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter