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Developmental Biology

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

Published: November 30, 2015 doi: 10.3791/53183
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2,4
1Program in Genetics & Genome Biology, The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Protocol

आगर इंजेक्शन प्लेट्स 1. तैयारी (समय: 45 मिनट)

  1. E3 के मीडिया में 2% से 3% agarose उबाल लें और समाधान बेंच पर थोड़ा शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। नोट: तैयार किया जा रहा इंजेक्शन प्लेटों की संख्या अपेक्षित agarose की राशि तय कर। प्रत्येक इंजेक्शन थाली agarose समाधान के लगभग 35 मिलीलीटर की जरूरत है।
  2. उबालने के बाद वांछित तापमान इंजेक्शन मोल्ड निर्माता के निर्देशों के अनुसार (उदाहरण के लिए।, 45 डिग्री सेल्सियस) तक पहुँच जाता है agarose शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. एक 100 मिमी पकवान में agarose ठंडा के लगभग 35 मिलीलीटर डालो।
  4. समाधान में प्राथमिकता दी इंजेक्शन मोल्ड के एक छोर रखें, तो (इस हवा के बुलबुले की घटना को कम करने में मदद करेगा) agarose समाधान पर मोल्ड के शेष रखना।
  5. Agarose समाधान लगभग 30 मिनट के लिए या तो आरटी पर या 4 डिग्री सेल्सियस जमना करने की अनुमति दें।
  6. ठोस agarose से मोल्ड के एक छोर अलग करने के लिए एक रंग का प्रयोग करें। धीरे धीरे मीटर के शेष को दूर पुरानी।

इवांस ब्लू डाई (ईबीडी) इंजेक्शन मिक्स 2. तैयारी (समय: 30 मिनट)

  1. 1X घंटी समाधान में ईबीडी के एक 1% शेयर करें (5 मिमी KCl; 155 मिमी NaCl 2 मिमी CaCl 2; 1 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी ना 2 HPO 4; 10 मिमी HEPES, 10 मिमी ग्लूकोज, 7.2 पीएच), जो आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. 25 मिलीग्राम पर मेगावाट 10,000 केडीए -dextran fluorescein आइसोथियोसाइनेट के एक शेयर समाधान (FITC) बनाओ / एमएल डिग्री सेल्सियस -20 पर 1X घंटी समाधान और दुकान में
  3. (। यानी, 100 μl के अंतिम काम की मात्रा के लिए: FITC dextran के शेयर के 90 μl में 1% ईबीडी के 10 μl मिक्स) FITC-dextran के शेयर का जायजा समाधान में सीधे 0.1% करने के लिए ईबीडी गिराए द्वारा इंजेक्शन मिश्रण तैयार करें।
  4. अच्छी तरह से भंवर इंजेक्शन मिश्रण (यह हरे रंग की बारी चाहिए) और एल्यूमीनियम पन्नी में इंजेक्शन मिश्रण ट्यूब लपेटकर द्वारा प्रत्यक्ष प्रकाश से बाहर रहते हैं।

3. ईबीडी इंजेक्शन तैयारी (समय: लगभग 30 मिनट)

ईएनटी "> नोट: प्रोटोकॉल 3-7 दिनों के बाद निषेचन (DPF) से लार्वा के साथ सबसे अच्छा काम करता है।

  1. आरटी के लिए पूर्व गर्म इंजेक्शन थाली।
  2. धातु की थाली पर micromanipulator व्यवस्था से इंजेक्शन तंत्र की स्थापना की और माइक्रोस्कोप के बगल में इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा खड़े हो जाओ। हवा चालित microinjection के नियंत्रक चालू करें। नोट: वरीय इंजेक्शन प्रणाली प्रयोगशाला द्वारा अलग अलग होंगे और विश्लेषण के परिणाम को बदल नहीं करना चाहिए।
  3. वापस ईबीडी मिश्रण के लगभग 2-4 μl के साथ इंजेक्शन सुई भरें।
  4. ईबीडी मिश्रण के लगभग 5 nl करने के लिए इंजेक्शन की मात्रा जांचना। नोट: इंजेक्शन मात्रा अंशांकन अंशांकन विधि पर निर्भर करेगा। गैस के दबाव इंजेक्टर एक माइक्रोमीटर के उपयोग के साथ मात्रा सांस के माध्यम से calibrated इंजेक्शन की मात्रा की आवश्यकता होगी, जबकि एक पिस्टन संचालित इंजेक्शन सीधे किसी दिए गए इंजेक्शन की मात्रा के लिए सेट किया जा सकता है।
  5. 1X घंटी समाधान के साथ गीले इंजेक्शन प्लेट और कुओं से अतिरिक्त हटा दें।
  6. 0.04% एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonate साल के साथ पूर्व इलाज लार्वाइंजेक्शन की शुरुआत करने से पहले लार्वा को स्थिर करने के लिए 1X घंटी समाधान में पतला टी (tricaine)। नोट: उचित इंजेक्शन किसी भी अवशिष्ट आंदोलन के साथ मुश्किल है के रूप में लार्वा को सुनिश्चित करना पूरी तरह से immotile हैं महत्वपूर्ण है।
  7. एक गिलास पिपेट का उपयोग अगर इंजेक्शन प्लेटों के कुओं में anaesthetized लार्वा रखें। लार्वा पूरी तरह से अच्छी तरह से भीतर और उनके पक्ष में झूठ बोल रहे हैं कि सुनिश्चित करें। नोट: अच्छी तरह से प्रति लार्वा की संख्या प्रयोगकर्ता पर निर्भर है।
  8. लार्वा कुओं में डाल रहे हैं के बाद, अच्छी तरह से भीतर लार्वा आंदोलन को कम करने के लिए अतिरिक्त घंटी समाधान निकाल दें। लार्वा कि निर्जलीकरण नहीं है तो समाधान का एक अवशिष्ट राशि छोड़ दें।

ईबीडी के साथ zebrafish लार्वा 4. पेरिकार्डियल इंजेक्शन (समय: लार्वा इंजेक्शन की संख्या पर निर्भर करता है, अनुमान लगाया 1-3 घंटा)

  1. इंजेक्शन प्रदर्शन किया जाएगा, जहां एक विदारक गुंजाइश पर लार्वा युक्त इंजेक्शन थाली रखें।
  2. युक्त इंजेक्शन पिपेट सुई की स्थितिईबीडी एक zebrafish लार्वा खत्म मिश्रण।
  3. फिर से स्थिति यह घूर्णन द्वारा इंजेक्शन थाली इतनी इंजेक्शन सुई लार्वा के दिल के पास है और लगभग 45 डिग्री पेट के बल पूर्वकाल पीछे धुरी से।
  4. नस शुरू में पृष्ठीय दिशा में तब्दील हो रही है जहां की जर्दी (चित्रा 1) के अग्र भाग पर नस के क्षेत्र में आम कार्डिनल नस (CCV) में इंजेक्शन सुई डालें। नोट: ऊपर 40x के बढ़ाई स्पष्ट रूप से CCV देखने के लिए उपयोगी हो सकता है।
  5. ईबीडी मिश्रण के 5 nl इंजेक्षन और ईबीडी मिश्रण के तत्काल रिसाव को कम करने के लिए 5-8 सेकंड के लिए स्थिति में इंजेक्शन की सुई रहते हैं। नोट: एक अच्छा इंजेक्शन दिल कक्षों में देखा डाई रंगाई (चित्रा 1) होगा। ईबीडी मिश्रण दिल में नहीं मनाया जाता है, तो ईबीडी मिश्रण का एक अतिरिक्त 5 nl डाई तेज प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हो सकता इंजेक्शन। वैकल्पिक रूप से, भ्रूण खारिज किया जा सकता है।
    नोट: कुछ स्थितियों में, दिल की धड़कन बंद हो सकता है। इस ओ हैंccurs, 20-40 सेकंड के लिए लार्वा निगरानी जारी है। डाई संचार प्रणाली के माध्यम से कदम के रूप में आमतौर पर, दिल की धड़कन शुरू।
  6. अगले लार्वा और दोहराने पर चलते हैं।
  7. तुरंत इंजेक्शन (चित्रा 2) के बाद वाहिका में FITC-dextran की उपस्थिति देख द्वारा सफलतापूर्वक इंजेक्शन भ्रूण को पहचानें।

5. ऊष्मायन और ईबीडी तेज (समय: 4-6 घंटा)

  1. लार्वा की वांछित संख्या इंजेक्ट कर रहे हैं, के बाद वापसी 100 मिमी बर्तन में tricaine बिना 1X घंटी समाधान करने के लिए लार्वा इंजेक्शन।
  2. एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा बर्तन रखें। नोट: अंधेरे में इंजेक्ट लार्वा रखते हुए काफी जीवित रहने की दर बढ़ जाती है और सिग्नल की शक्ति में सबसे बड़ी स्थिरता सुनिश्चित करता है। एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर लार्वा इनक्यूबेटर के बाहर हैं, उस समय की अवधि के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
  3. पर्याप्त ईबीडी तेज सुनिश्चित करने के लिए लार्वा 4-6 घंटे के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते दें।
    4. मांसपेशियों में ईबीडी 6. विज़ुअलाइज़ेशन (टाइम: लार्वा इंजेक्शन और माइक्रोस्कोपी के प्रकार की संख्या पर निर्भर करता है, अनुमान 0.5-3 घंटा)

    1. इमेजिंग के लिए पहले, आंदोलन को रोकने के लिए 0.04% tricaine के साथ लार्वा anesthetize।
    2. ईबीडी तेज कंकाल की मांसपेशी (चित्रा 3) में हो रहा है, तो लाल प्रतिदीप्ति के तहत देखें लार्वा निर्धारित करने के लिए।

Representative Results

ईबीडी इंजेक्शन मिश्रण 3 DPF पर sapje समयुग्मक म्यूटेंट और जंगली प्रकार भाई बहन की CCV में इंजेक्ट किया गया था। दिल कक्षों (चित्रा 1 बी) भरा है कि इंजेक्शन तो FITC-dextran हरी प्रतिदीप्ति के तहत वाहिका में (चित्रा 2) visualizing द्वारा सफल इंजेक्शन के लिए विश्लेषण किया गया।

एक 4 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, ईबीडी तेज प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग विखंड स्तर पर जांच की गई थी। Sapje ​​समयुग्मक म्यूटेंट मांसपेशी झिल्ली 15 (चित्रा 3 बी) के लिए नुकसान का संकेत है, ईबीडी तेज दिखाया जबकि जंगली प्रकार भाई बहन, किसी भी दृश्य मांसपेशी फाइबर (चित्रा 3) के भीतर कोई ईबीडी प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया।

चित्र 1
एक zebrafish Embry के आम कार्डिनल नस (CCV) में चित्रा 1. इंजेक्शन ईबीडी इंजेक्शन मिश्रणओ। (ए) uninjected भ्रूण। तीर CCV इंजेक्शन के लिए आदर्श स्थान को दर्शाता है। (बी) CCV में सफल इंजेक्शन। डाई दिल कक्षों (तीर) में प्रवेश करती है और वाहिका के माध्यम से पंप किया जा करने के लिए शुरू होता है। (सी) एक असफल CCV इंजेक्शन कुछ या भ्रूण (तीर) की जर्दी थैली में प्रवेश डाई के सभी में परिणाम होगा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. भ्रूण तुरंत इंजेक्शन और पूर्व ईबीडी तेज करने के लिए निम्न वाहिका भर में हरी प्रतिदीप्ति के तहत FITC-dextran के वितरण को देख कर सफल इंजेक्शन के लिए हल किया जा सकता है।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: ईबीडी क्षतिग्रस्त झिल्ली के साथ फाइबर से ऊपर ले जाया जाएगा मांसपेशी फाइबर में कोई ईबीडी प्रतिदीप्ति दिखा (ए) wildtype भाई बहन।। (बी) के कई मांसपेशी फाइबर (तीर) के भीतर ईबीडी प्रतिदीप्ति साथ Sapje ​​समयुग्मक उत्परिवर्ती। सभी लार्वा ईबीडी इंजेक्शन मिश्रण के साथ इंजेक्शन और 3 DPF पर एक 4 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद विश्लेषण किया गया। भाई बहन और म्यूटेंट CCV इंजेक्शन के लिए पहले मांसपेशी फाइबर टुकड़ी द्वारा हल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

Zebrafish neuromuscular रोग 2,29 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभर रहे हैं। तिथि करने के लिए, zebrafish प्रणाली, नया पेशी रोग के कारण म्यूटेशन 16,17,30 मान्य उपन्यास pathomechanisms 18 स्पष्ट है, और संभावित नए चिकित्सीय औषधियों 12,24 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ये सामूहिक प्रयासों मानव neuromuscular रोगों मॉडल करने के लिए zebrafish की उपयोगिता की स्थापना की है। हालांकि, zebrafish और स्तनधारी मॉडल के साथ की गई प्रगति के बावजूद, neuromuscular की स्थिति की व्यापक स्पेक्ट्रम के भीतर रोगियों के लिए सीमित उपचार विकल्प हैं। इसलिए, एक उच्च मांग विनाशकारी रोगों के इस समूह के लिए चिकित्सा के विकास के लिए मौजूद है। चिकित्सा विज्ञान के लिए इस मांग को समानांतर नया पशु मॉडल और ख्यात चिकित्सकीय रणनीति को सत्यापित करने के लिए चल रहे प्रयोगात्मक नवाचार, साथ ही कठोर विश्लेषण के लिए इसी की जरूरत है।

ईबीडी विश्लेषण सामान्यतः करने के लिए माउस मॉडल में इस्तेमाल किया जाता हैअध्ययन के ऊतकों और मस्तिष्क, हृदय में सेलुलर क्षति, और कंकाल की मांसपेशी 27,31। सबसे विशेष रूप से, ईबीडी मांसपेशी झिल्ली अस्थिरता की गंभीरता दिखाने के लिए और 8 को नुकसान करने के लिए विभिन्न पेशी dystrophy उपप्रकार के माउस मॉडल में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है। मांसपेशी झिल्ली क्षति प्रकट करने के लिए ईबीडी का उपयोग मानव रोग राज्य से 9 पशु मॉडल की समानता की स्थापना के एक सहायक पैरामीटर है। माउस में ईबीडी की शक्ति को विकसित करने और neuromuscular रोग की zebrafish मॉडल के लिए ईबीडी लागू करने के लिए, हमारे अपने सहित कई प्रयोगशालाओं, प्रेरित किया है। कारण ईबीडी विश्लेषण के लागू करने के लिए, इस तकनीक को सक्रिय रूप से मानव रोग राज्य 11,15,22,24,32 करने के लिए zebrafish मॉडल की पुष्टि करने के लिए लागू किया जा रहा है। क्षतिग्रस्त मांसपेशियों की झिल्ली के साथ लार्वा मांसपेशी फाइबर के भीतर ईबीडी तेज और इसलिए लाल प्रतिदीप्ति होगा। अलग-अलग मांसपेशी फाइबर के भीतर अंतर-फाइबर अंतरिक्ष में मनाया प्रतिदीप्ति, लेकिन नहीं भी टी में तहखाने झिल्ली से detaching फाइबर की जानकारीपूर्ण हो सकता हैउपयोगी नैदानिक ​​विस्तार प्रदान झिल्ली क्षति का वह अनुपस्थिति। ईबीडी विश्लेषण पशु मॉडल सत्यापन के परे संभावित आवेदन किया है। हमारी प्रयोगशाला से प्रयासों हाल ही में ईबीडी विश्लेषण संभावित उपन्यास चिकित्सीय औषधियों 24 को मान्य करने में लाभकारी है कि प्रदर्शन किया है। संभावित चिकित्सीय उपचार को कम करने या प्रासंगिक उपचारात्मक कार्रवाई 8 सूचित कर सकते neuromuscular रोग मॉडल में ईबीडी तेज समाप्त यदि निर्धारण। विश्लेषण के इस प्रकार के चिकित्सा विज्ञान के तंत्र (एस) की स्थापना में मदद मिलेगी और ईबीडी विश्लेषण के आवेदन फैलता जा सकता है।

कई तकनीकों के साथ के रूप में, ईबीडी विश्लेषण प्रयोगात्मक डिजाइन और अभ्यास के दौरान मनाया जा कई निरंतर करता है। उदाहरण के लिए, यह कारण उम्र के साथ ऊतक का उमड़ना को CCV की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रायोगिक मायने रखता कम करने और लार्वा की बड़ी संख्या को तैयार करने की जरूरत बढ़ रही है, और इससे पहले कि पेरिकार्डियल इंजेक्शन के दौरान तैयारी में लार्वा क्षति के लिए आसान है।क्षतिग्रस्त मांसपेशियों ईबीडी का समय लग सकता है इसके अलावा, हैंडलिंग और इंजेक्शन के दौरान लार्वा के लिए किया शारीरिक क्षति झूठी सकारात्मक हो सकता है। इन बाधाओं से कुछ दूर करने के लिए, हम इंजेक्शन और पूर्व बाद के विश्लेषण के लिए निम्न तुरंत सफल डाई अर्क के साथ लार्वा के आसान और विश्वसनीय पहचान की अनुमति देता है कि इस वीडियो लेख में एक सह इंजेक्शन रणनीति का वर्णन किया है। प्रायर मांसपेशी फाइबर द्वारा अपने तेज करने के लिए वाहिका में ईबीडी की पुष्टि की अनुमति देकर सफल इंजेक्शन के लिए सह इंजेक्शन नियंत्रण FITC-dextran। ईबीडी प्रतिदीप्ति मांसपेशी फाइबर में एकत्र नहीं करता है, तो कई घंटे के बाद लार्वा में अत्यधिक फैलाना हो जाता है के रूप में यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है; जैसे, यह पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, CCV लापता और जर्दी या शरीर गुहा में ईबीडी इंजेक्शन लगाने, ऊष्मायन के बाद, क्षतिग्रस्त मांसपेशी फाइबर से तेज की कम संभावना के साथ अभी तक, भ्रूण को नियंत्रित करने के लिए इसी तरह फैलाना लाल प्रतिदीप्ति में परिणाम कर सकते हैं। सामूहिक रूप से, इन गुफाएटीएस ईबीडी इंजेक्शन सुसंगत और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता है सुझाव देते हैं।

सभी में, हम zebrafish लार्वा पर ईबीडी विश्लेषण करने के लिए एक व्यावहारिक और सरल विधि का वर्णन है। तिथि करने के लिए, एक मॉडल प्रणाली के रूप में zebrafish के उपयोग, विशेष रूप से एक मानव रोग मॉडल के रूप में तेजी से विस्तार किया गया है। इस विस्तार के लिए zebrafish प्रणाली की वर्तमान फायदे पर सुधार कि प्रयोगात्मक तकनीक के निरंतर विकास और संशोधन करने के लिए आंशिक रूप से की वजह से है। ईबीडी इंजेक्शन तकनीक का सत्यापन और zebrafish पेशी रोग मॉडल के अध्ययन के लिए एक शोधकर्ता के शस्त्रागार के लिए एक अतिरिक्त और शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। इस तकनीक के चल रहे कार्यान्वयन और संशोधन के उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के साथ ही बीमारी के कारण तंत्र को उजागर करने में मदद करने की क्षमता है।

Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अन्य संघर्ष किया है।

Acknowledgments

हम अपने तकनीकी सहायता के लिए ट्रेंट वॉ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम यह भी बीमार बच्चों और इस परियोजना के लिए उनकी उदार आर्थिक सहायता के लिए इलाज जन्मजात पेशी अपविकास (सीएमडी) के लिए अस्पताल में बाल रोग विभाग को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 Sigma FD10S
Evan's Blue Dye Sigma E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040
100 mm Petri dish Fischerbrand FB0875712 Injection mold base
Thin wall glass capillaries World Precision Instruments TW100F-4 For Injection needle
Agarose Bioshop AGA001 Injection mold
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 Injection mold
Sodium chloride Bioshop SOD001 Ringer's solution
Potassium chloride Bioshop POC888 Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate Sigma M2670 Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Ringer's solution
HEPES Sigma H4034 Ringer's solution
Glucose BioBasic GB0219 Ringer's solution
Calcium chloride Sigma C1061 Ringer's solution

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References

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