Protocol
1. Fremstilling af Agar Injection plader (Tid: 45 min)
- Kog 2% til 3% agarose i E3 medier og lade opløsningen køle lidt på bænken. Bemærk: Antallet af injektion plader forberedes dikterer mængden af agarose påkrævet. Hver injektion plade behov ca. 35 ml af agaroseopløsningen.
- Efter kogning, tillade agarose afkøle, indtil den ønskede temperatur er nået (f.eks., 45 ° C) som pr sprøjtestøbe producentens anvisninger.
- Hæld ca. 35 ml af den afkølede agarose i en 100 mm skål.
- Placer den ene ende af foretrukne sprøjtestøbe i opløsning, derefter lægge resten af mug på agaroseopløsning (dette vil bidrage til at mindske forekomsten af luftbobler).
- Tillad agaroseopløsningen at størkne enten ved stuetemperatur eller 4 ° C i ca. 30 min.
- Brug en spatel til at adskille den ene ende af formen fra den faste agarose. Langsomt fjerne resten af m gammel.
2. Fremstilling af Evans blåt farvestof (EBD) Injektion Mix (Tid: 30 min)
- Lav en bestand 1% af EBD i 1X Ringers opløsning (155 mM NaCl; 5 mM KCI; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCI2, 2 mM Na 2 HPO 4; 10 mM HEPES; 10 mM glucose; pH til 7,2), som kan opbevares ved stuetemperatur.
- Lav en stamopløsning af fluoresceinisothiocyanat (FITC) -dextran MW 10.000 kDa ved 25 mg / ml i 1X Ringers opløsning og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered injektion blanding ved at fortynde EBD til 0,1% direkte i stamopløsning af FITC-dextran lager (dvs. til en sidste arbejdsvolumen på 100 pi:. Bland 10 pi 1% EBD i 90 pi FITC dextran lager).
- Grundigt vortex injektion mix (det skal blive grøn), og holde sig ude af direkte lys ved at pakke injektion blandingsglasset i alufolie.
3. EBD Injection Forberedelse (Tid: Ca. 30 min)
ent "> Bemærk: Protokol fungerer bedst med larver fra 3-7 dage efter befrugtning (DPF).- Pre-varme injektionspladen til stuetemperatur.
- Opsæt injektion ved at arrangere mikromanipulator på metalpladen og stå ved siden mikroskopet anvendes til injektion. Tænd luftdrevet mikroinjektion controller. Bemærk: Den foretrukne indsprøjtningssystemet vil variere fra laboratoriet og må ikke ændre resultatet af analysen.
- Tilbage fylde kanyle med ca. 2-4 pi EBD mix.
- Kalibrer injektion volumen til ca. 5 nl af EBD mix. Bemærk: Injektionsvolumen kalibrering vil afhænge af kalibreringsmetode. Et stempel drevet injektion direkte kan indstilles til en given injektionsvolumen henviser gastryk injektorer skal bruge injektionsvolumen kalibreret via volumen bolus med anvendelse af et mikrometer.
- Våd sprøjtning plade med 1X Ringers opløsning og fjerne overskydende fra brønde.
- Pre-treat larver med 0,04% ethyl-3-aminobenzoat methanesulfonate salt (tricaine) fortyndet i 1X Ringers opløsning til immobilisering larver før starten af injektionen. Bemærk: Sikring af larver er helt immotile er vigtigt, da korrekt injektion er vanskeligt med enhver resterende bevægelse.
- Placer bedøvet larver i brønde på agar injektion plader under anvendelse af et glas pipette. Sørg for, at larverne er helt inden for godt og liggende på deres side. Bemærk: Antallet af larver per brønd er op til forsøgslederen.
- Efter larver er sat i brøndene, fjerne overskydende Ringers opløsning for at minimere larver bevægelse inden i brønden. Efterlad en resterende mængde opløsning, således at larverne ikke dehydrerer.
4. Perikardial Injektion af zebrafisk Larver med EBD (Tid: Afhængig af antal larver intravenøs, anslået 1-3 timer)
- Placer injektionen plade indeholdende larver på et dissektionsmikroskop hvor injektionerne vil blive udført.
- Placer injektionspipetten nålen indeholderden EBD mix over en zebrafisk larver.
- Re-stillingen injektionspladen ved at dreje det så injektionsnålen er nær larver hjerte og ca. 45 ° ventralt fra anterior-posterior akse.
- Stik injektionskanylen i den fælles cardinal vene (CCV) i området af venen ved den forreste del af blommen, hvor venen indledningsvis drejning i den dorsale retning (figur 1). Bemærk: En forstørrelse på op til 40x kan være nyttige til klart at se CCV.
- Injicer 5 nl af EBD mix og holde kanylen i position til 5-8 sek for at minimere øjeblikkelig lækage af EBD mix. Bemærk: En god injektion får farvestof farvning ses i hjertekamrene (figur 1). Hvis EBD blanding ikke er observeret i hjertet, derefter injicere yderligere 5 nl af EBD blanding kan være tilstrækkelig til at fremkalde farvestofoptagelse. Alternativt kan embryoet kasseres.
Bemærk: I visse situationer kan hjertet op med at slå. Hvis dette occurs, fortsat overvåge larverne til 20-40 sek. Typisk hjertet genoptager slå som farvestoffet bevæger sig gennem kredsløbssystemet. - Gå videre til den næste larver og gentag.
- Identificer succes injicerede embryoner ved at observere tilstedeværelsen af FITC-dextran i vaskulaturen umiddelbart efter injektion (figur 2).
5. Inkubation og EBD Optagelse (Tid: 4-6 timer)
- Efter det ønskede antal larver injiceres, injiceres tilbagevenden larver til 1X Ringers opløsning uden tricaine i 100 mm skåle.
- Hold retter indpakket i aluminiumsfolie. Bemærk: Hold injiceret larver i mørke øger overlevelsesrater og sikrer størst sammenhæng i signalstyrke. Indpakning i aluminiumfolie er særligt vigtigt for den tidsperiode, som larverne er uden for inkubatoren.
- Tillad larver at inkubere ved 28,5 ° C i 4-6 timer for at sikre tilstrækkelig EBD-optagelse. 6. Visualisering af EBD i muskel (Tid: Afhængig af antal larver intravenøs og typen af mikroskopi, anslået 0,5-3 timer)
- Forud for billedbehandling, bedøver larverne med 0,04% tricaine at forhindre bevægelse.
- Vis larver under rød fluorescens at afgøre, om der sker EBD optagelse i skeletmuskel (figur 3).
Representative Results
EBD injektion mix blev injiceret i CCV af sapje homozygote mutanter og vildtype-søskende 3 dpf. Injektioner, der fyldte hjertekamrene (figur 1B) blev derefter analyseret for vellykket injektion ved at visualisere FITC-dextran i vaskulaturen under grøn fluorescens (figur 2).
Efter en 4 timers inkubationstid blev EBD optagelse undersøgt på somit niveau ved hjælp af fluorescens mikroskopi. Vildtype søskende udviste ingen EBD fluorescens inden nogen synlige muskelfibre (figur 3A), mens de sapje homozygote mutanter viste EBD optagelse, hvilket indikerer skade på musklen membranen 15 (figur 3B).
Figur 1. Injektion EBD injektion mix i den fælles kardinal vene (CCV) af en zebrafisk Embryo. (A) injiceret embryo. Pil betegner ideel beliggenhed for CCV injektion. (B) Vellykket injektion i CCV. Farvestoffet indtræder i hjertekamrene (pil) og begynder at blive pumpet gennem vaskulaturen. (C) En mislykket CCV injektion vil resultere i nogle eller alle af farvestoffet ind i blommesækken af embryo (pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Embryoner kan sorteres for vellykket injektion ved at observere FITC-dextran distribution under grøn fluorescens hele vaskulaturen umiddelbart efter injektion og før EBD-optagelse.Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: EBD vil blive taget op af fibre med beskadigede membraner (A) vildtype søskende viser ingen EBD fluorescens i muskelfibre.. (B) Sapje homozygot mutant med EBD fluorescens inden flere muskelfibre (pile). Alle larver blev injiceret med EBD injektion mix og analyseret efter en 4 timers inkubationsperiode ved 3 dpf. Søskende og mutanter blev sorteret efter muskelfiber løsrivelse før CCV injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Zebrafisk dukker op som et effektivt redskab til studiet af neuromuskulære sygdomme 2,29. Til dato har zebrafisk system, blevet brugt til at validere nye muskel sygdomsfremkaldende mutationer 16,17,30, belyse nye patomekanismer 18, og identificere potentielle nye terapeutiske lægemidler 12,24. Disse kollektive indsats har etableret nytten af zebrafisk til at modellere menneskelige neuromuskulære sygdomme. Men på trods af de fremskridt med zebrafisk og pattedyr modeller, der er begrænsede behandlingsmuligheder for patienter inden for det brede spektrum af neuromuskulære forhold. Der eksisterer derfor for terapiudvikling for denne gruppe af ødelæggende sygdomme en stor efterspørgsel. Parallelt denne efterspørgsel efter lægemidler er den tilsvarende behov for løbende eksperimenterende innovation, samt grundig analyse for at kontrollere nye dyremodeller og formodede terapeutiske strategier.
EBD-analyse er almindeligt anvendt i musemodeller tilundersøgelse væv og cellulære skader i hjerne, hjerte og skeletmuskulatur 27,31. Mest bemærkelsesværdigt er EBD udbredt i musemodeller af forskellige muskeldystrofi undertyper at vise sværhedsgraden af muskelmembranernes ustabilitet og beskadige 8. Anvendelsen af EBD at afsløre skader muskelmembranernes er en støttende parameter oprettelse ligheder i dyremodel for det menneskelige sygdomstilstand 9. Effekten af EBD i mus har fået flere laboratorier, herunder vores egen, at udvikle og anvende EBD til zebrafisk modeller af neuromuskulære sygdomme. På grund af anvendeligheden af EBD-analyse, er denne teknik aktivt at blive gennemført for at underbygge zebrafisk modeller til den menneskelige sygdomstilstand 11,15,22,24,32. Larver med beskadigede muskel membraner vil have EBD optagelse og derfor rød fluorescens inden muskelfibre. Fluorescens observeret i den inter-fiber plads, men ikke inden for de enkelte muskelfibre kan også være informativ af fibre aftagning fra basalmembranen i tHan fravær af skader membran, giver nyttige diagnostisk detaljer. EBD-analyse har potentiel anvendelse ud over validering dyremodel. Indsats fra vores laboratorium har for nylig vist, at EBD analyse er gavnlige i at validere potentielt nye terapeutiske lægemidler 24. Bestemmelse om potentielle terapeutiske behandlinger reducere eller afskaffe EBD optagelse i neuromuskulære sygdomsmodeller kan betyde relevant terapeutisk virkning 8. Denne type analyse kan hjælpe med at etablere mekanismen (e) af lægemidler og udvider anvendelsen af EBD-analyse.
Som med mange teknikker, er EBD-analyse har flere forbehold, der skal overholdes under eksperimentelle design og praksis. For eksempel kan det være en udfordring at identificere CCV grund af fortykkelse af vævet med alderen. Desuden er det let at beskadige larver som forberedelse før og under perikardial injektion reducere eksperimentelle tæller og øger behovet for at prep store antal larver.Endvidere kunne fysisk skade gjort for at larverne under håndtering og injektion resultere i falske positiver, som beskadigede muskel kan tage op EBD. For at overvinde nogle af disse hindringer, har vi beskrevet en co-injektion strategi i denne video artikel, der gør det nemt og pålidelig identifikation af larver med succes farvestof infusion umiddelbart efter injektion og før efterfølgende analyse. FITC-dextran Saminjektion kontrol for vellykket injektion ved at tillade bekræftelse af EBD i vaskulaturen før dens optagelse af muskelfibrene. Dette kan især være nyttigt som EBD fluorescens bliver meget diffus i larver efter flere timer, hvis ikke indsamlet i muskelfibrene; som sådan, kan det være vanskeligt at opdage. Desuden mangler CCV og injektion EBD i æggeblomme eller legemshulrum kan, efter inkubation, medføre diffus rød fluorescens ligner kontrollere embryoner, men med reduceret sandsynlighed for optagelse af beskadigede muskelfibre. Kollektivt, disse grotteATS tyder EBD injektion kræver tålmodighed og praksis for at opnå konsistente og pålidelige resultater.
I alt beskriver vi en praktisk og enkel metode til at udføre EBD analyse på zebrafisk larver. Til dato anvendelsen af zebrafisk som et modelsystem, især som en menneskelig sygdom model, er hastigt voksende. Denne ekspansion er delvist på grund af den fortsatte udvikling og ændring af eksperimentelle teknikker, der forbedrer på de nuværende fordele ved zebrafisk system. Den EBD injektionsteknik giver en ekstra og kraftfuldt værktøj til en forsker arsenal for validering og studiet af zebrafisk muskel sygdomsmodeller. Den igangværende gennemførelse og ændring af denne teknik har potentiale til at bidrage til at belyse nye terapeutiske strategier samt sygdom forårsager mekanismer.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Trent Waugh for hans teknisk bistand. Vi anerkender også Department of Pediatrics på Hospital for Sick Children og Cure medfødt muskeldystrofi (CMD) for deres generøse støtte til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
References
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P.
- Yoshida, M., Ozawa, E.
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
