Protocol
윤리 문 : 인간의 태반 연구는 고려 대학교 (AN09085-001)의 인간 연구를위한 임상 시험 심사위원회의 승인을 전향 적으로 실시 하였다. 모든 실험은 한국 대학 의료 센터에서 클린 무균 룸 시설에서 수행 하였다. 실험 설계 및 hPSCs를 사용 절차는 고려 대학교 병원의 임상 시험 심사위원회 (AN12277-003)에 의해 승인되었다.
악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비
- 0.1 % 젤라틴과 코트의 모든 문화 요리. 오토 클레이브 인산염 완충 식염수 (PBS)와 집게. 이상 15 분 동안 15파운드의 PSI 하에서 121 ° C에서 수술 가위, 마이크로 원심 튜브, 멸균 거즈.
- 준비된 미리 예열 0.25 % 트립신 에틸렌 아민 테트라 아세트산 (트립신 EDTA) 및 미리 예열 여과 배양 배지 (DMEM) 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린을 함유하는, 100 ㎍ / ㎖ streptomyc절차를 시작하기 전에에서.
인간 태반 2. 세포 격리
- 서면 동의서를 얻은 후 임신 7-32주에서 정상 또는 치료 낙태를 받고 건강한 임신 한 여성에서 제왕 절개 배달 후 태반 조직을 얻습니다.
- 태반에서 산부인과 전문의 수술 별도의 인간 태반 융모 판 (HPC의)가; 20 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신 EDTA에이를 배양 한 다음 5 ml의 PBS로 씻는다.
- 가위를 사용하여 HPC의에서 융모막 융모를 분리; 융모를 말하다 및 1 ㎖의 PBS로 세 번 씻는다. 닦지 후, 피펫 팁을 사용하여 미세 원심 분리 튜브에 융모막 융모를 배치; 아래로 pipetting 및 500 μL PBS로 샘플을 씻어, 3 분 동안 120 XG의 튜브를 원심 분리기. 미리 예열 문화 매체의 500 μL로 두 번 조직을 씻으십시오.
- 37 ° C에서 젤라틴 코팅 접시에 배지에서 배양 세포, 5 % CO 2
- 제 3 통로까지 2-3 일마다 매체를 교환하십시오. 배양 동안에, 배지에 떠있는 세포 파편을 제거하는 단계; 성장하는 태반의 섬유 아세포는 판에 연결됩니다. 문화 후 10 일 통로로 HPC부터 유래 섬유 아세포와 같은 세포는 트립신과 마이 토마 이신 -C (10 μg의 / ㎖) 처리 후 hESC의 배양을 위해 그들을 수확.
- 스톡 시료로서 HPC의 동결 전에, HPC의 일반적 (M.의 fermentans, M.의 hyorhinis, M. 아르기닌, M을 미코 플라스마 포함 태반, 감염 병원체에 오염되지 않은 것을 확인 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용하여 . orale, 엠의 salivarium, M. hominis가, M.의 pulmonis, 엠의 arthritidis, 엠의 neurolyticum, M. hyopneumoniae,그리고 M. capricolum) 및 박테리아 종 Ureaplasma urealyticum의, 마이코 플라스마 검출 키트를 사용하여.
- , RT-PCR을 수행하기 위해 제조업체의 지침에 따라 키트에 제공된 모든 프라이머 및 이들의 혼합물을 사용합니다. 마이코 플라즈마 검출 36 일 동안 배양 된 세포의 상층 액을 사용합니다. PCR 혼합물에이 샘플의 3 μl를 추가하고 30 초, 2 분 동안 55 ℃, 1 분 동안 72 ℃에서 각 94 ° C로 구성된 35주기 위해 1 차 PCR의 절차를 수행합니다.
- 조심스럽게 PCR 혼합물에 1 차 PCR 산물의 0.5 μL를 추가하고 이전과 동일한 조건을 이용하여 30 사이클 동안 2 차 PCR 절차를 수행한다. 1 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의한 증폭 산물을 분석; 젤에 1 차 및 2 차 PCR 산물을 각각 10 μL를 적용합니다.
- HPC의 병원체가 오염 된 것으로 발견되면, 이러한 제거제조업체의 지침에 따라 항생제의 조합 (BM-사이클린)를 사용. 3 일 BM-사이클린 (1) 10 ㎍ / ㎖의를 포함하는 새로운 매체를 추가하고 또 다른 4 일 동안 5 μg의 / ㎖ BM-사이클린 2 세포를 취급합니다. 두 번이 사이클을 반복 한 후 다시 마이코 플라스마 오염 확인합니다.
3. 수확 인간 태반 유래 세포 중간 (hPCCM), 금연실
- 오염을 제외한 후, 부착 세포 (85~90% 합류 치료; (1.5 × 107 세포 / 2 시간 30 분 동안 미토 마이신 C (10 μg의 / ㎖)와 함께 플라스크) 및 10 ml의 세포를 3 회 세척 PBS는. 24 시간 동안 마이 토마 이신 C-없이 사전 예열 매체와 세포를 품어.
- 어느 날 치료 후, 10 ml의 배지에서 세포를 배양 (DMEM-F12 20 % 노크 아웃 혈청 교체 [KOSR] 보충, 0.1 MM의 β - 머 캅토 에탄올, 1 % NEAA, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). 15 ML 원뿔 관에서 24 시간 배양, 수확 후 CM과0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 필터링 CM.
- 새로운 매체 및 배양의 또 다른 10 ML을 추가합니다. 1 주간 매일 문화에서 모든 상층 액을 수집하고 -80 ° C에서 수확 한 매체를 동결. 반복 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
4. 문화 인간의 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포) 및 다 능성 줄기 세포의 유도 (iPSCs)
- 인간 배아 줄기 세포주를 확보, (각각 이름 WA01 및 WA09에서 NIH hESC의 레지스트리에 나열된) (H1)과 H9 세포와 유도 만능 줄기 세포 IPSC-1 : 만능 줄기 (포피) -1 IPSC-2 (IISH1i- WiCell 연구소 (매디슨, 위스콘신, 미국)에서 BM). 전지는 제조업체의 지침에 따라 해동 배양해야한다.
- 대조군, 37 ° C에서 널리 사용되는 피더없고 정의 된 무 혈청 배지에서 기저막 매트릭스 코팅 접시에 5 % CO 2에서 배양 세포. 처음 hPSCs의 80-100 덩어리 씨앗 나는N 35-MM 요리. 70-80 %의 합류와 정기적 통로 세포까지이 요리에 세포를 성장 서브 배양, 모든 5-6일 한 번 기계적 또는 효소 적 방법 (스파 아제 (Dispase))를 사용하여. 매체로 두 번 세포를 씻으 1의 비율을 판 : 4. 매일 신선한 매체와 매체를 교체합니다.
- 실험 그룹의 경우, 요리에 hPCCM에서 배양 세포를 기계적으로 또는 효소, 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅 한 번 5 일마다 계대 루틴을 수행합니다. 6-1 : 10 (1)의 범위의 비율로 플레이트 세포. hPSCs는 전송 후 이일 내 젤라틴에 연결합니다. 매일 신선한 매체와 매체를 교체합니다.
인간 만능 줄기 세포의 특성 (5)
참고 : 알칼리 포스 파타 아제 염색, 면역 세포, 정량 실시간 PCR (QRT-PCR), 서부 블로 팅 등의 여러 가지 방법을 사용 hPSCs을 특성화.
- 면역 형광 염색법
- immunofluorescenc 들어E 염색, 문화 hPSCs 4 % 10 분 동안 (W / V) 파라 포름 알데히드와 8 웰 슬라이드 챔버에서 세포를 수정; 그리고, (v / v)의 트리톤 X100 15 분 동안 0.1 %를 함유하는 PBS에서 3 % (v / v)의 정상 말 혈청과 함께 1 시간 동안 세포를 차단 (v / v)의 0.1 %로 세포 투과성이 Tween- (20). 각 단계 사이에 5 분 동안 두 번 PBS를 씻으십시오.
- 4 ° C에서 이차 항체와 O / N : 차 항체 (1,000 일의 10월-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, 희석)와 세포를 품어.
- 장착 전에, 어두운 곳에서 5 분 동안 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 세포를 배양한다. 세척 세포 엄격에게 어둠 속에서 각각의 건전지 완전히 5 분 3 회. 형광 장착 배지에서 세포를 유지하고, 형광 현미경 하에서이를 관찰한다.
- QRT-PCR
- 제조 회사의 사양에 따라 분리하고, RNeasy 미니 키트를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 분리하고 나노 드롭 분광 광도계를 사용하여 추출한 RNA를 정량화. 20 ㎕의 반응 혼합물을 함유하는 올리고으로 총 2 μg의 RNA를 첨가하여 cDNA를 합성 (DT) 프라이머 및 슈퍼 스크립트 II 역전사 효소는; 이 과정에서 제조업체의 지침을 따르십시오.
- iQ를 SYBR 그린 qPCR의 매스터 믹스와 기업 S1 표에 기재된 프라이머 서열을 이용하여, 바이오 래드 iCycler IQ 시스템으로 합성 된 cDNA를 증폭. 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)들에 관심 유전자의 사이클 임계 값들을 정규화.
- 알카라인 포스파타제 (AP) 염색
- 제조사의 프로토콜에 따라, ES 세포 특성 분석 키트를 사용하여 AP의 활동을 감지.
- 5 일에서 미디어를 대기음 12 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 hPSCs를 해결. overfix하지 마십시오 이상 2 분 동안 세포를 고정하는 알칼리 포스 파타 아제의 비활성화가 발생합니다. 정착액을 기음과 1X 린스 버퍼 씻어. 하지 마라우물 단계 사이에 건조 할 수 있습니다.
- 각 웰 (35mm 접시 잘 당 1 ㎖)에 충분한 염색 액을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트.
- 배양 후, 1X 린스 버퍼과 설거지. 1X PBS와 표지 세포의 건조를 방지하고 올림푸스 현미경을 사용하여 염색 된 세포를 조사하고 이미지.
- 서쪽 오점
- 이전에 9에 설명 된대로 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 간략하게, 세포 용 해물에서의 단백질 농도를 결정한다. 소듐 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 겔상의 단백질의 동량을 해결하고, 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막에 단백질을 옮긴다.
- 오점을 차단하고 4 ° C에서 다른 1 차 항체 / O, N 그것을 조사; 이후 1 시간 동안 HRP - 복합 이차 항체와 얼룩을 품어. 10 분 배양 사이의 때마다 막 세 번 씻으십시오. ECL 시약을 이용하여 신호를 검출.
- 짧은 탠덤 반복 (STR) 분석
- hPSCs는 같은 통로에서 제어 및 실험 그룹에서 수확했다. 게놈 DNA는 제조자의 지시에 따라서, DNA 마이크로 키트를 사용하여 추출 하였다.
- 제조자의 명세 및 모세관 전기 영동에있어서, AmpF / STR PCR 증폭 키트를 사용하여 16 개의 서로 다른 유전자좌에 대한 게놈 DNA를 증폭하는 유전 분석기를 사용하여 수행 하였다.
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Representative Results
이 hPSC 전파 방법의 이점은 인간 세포로부터 분비 된 요소를 사용한다는 것이다. 프로토콜에서 가장 ciritical 단계는 인간 태반 유래 세포의 분리 및 문화입니다. 이 요구 및 HPC 판 융모의 정확한 부분에서 정확한 해부. 한 인간 태반 유래 세포의 분리를위한 절차를 보여줍니다. 이 과정은 간단하고 세포의 분리를위한 편리하고 용이하게 1 시간 내에 수행 될 수있다. 도 2에서 설명한 바와 같이, 조직은 견고 유독 젤라틴 코팅 접시 및 섬유 아세포 - 유사 세포에 부착. 트립신 처리에 의해 통로 중에 파편과 소멸 조직의 제거는 셀의 선택을 허용하고 균질 배양을 보장한다. 이러한 세포 오염의 부족을 확인한 후 hPSC의 증식에 대한 조정 배지를 제조하기 위해 사용될 수있다. 최적의 조건은, 세포 80-85% 합류로 성장시키고 것과 같이 정의 된 일 후E 성장 인위적 (데이터는 도시하지 않음)을 정지시켰다.
피더 세포 또는 합성 매트릭스에서 배양 hPSCs는 hPCCM 젤라틴 코팅 접시에 전송 될 수있다. (3) hPSC 라인 마트 리겔 - 코팅 된 플레이트 (도 3A와 B)에 대해 관찰 된 것과 유사한 수준으로 hPCCM 유지 될 수 있음을 보여준다. 0.1 % 젤라틴 지금까지 hPSC 문화에 대한 위해서 사용할되지 않았습니다. 우리의 조건에서, hPSCs 확장과 대조군에서 hPSCs 유사한 능성을 유지했다. hPCCM가 hPSC 문화에 대한 다른 행렬에 액세스 확인하려면 hPSCs은 라미닌, 비트로 넥틴 및 비 코팅 요리에 계대 배양 하였다. hPSC 부착 및 라미닌 및 비트로 넥틴 코팅 요리에 hPCCM에서 성장했다. 그러나, 몇 구절 후, 많은 식민지 차별화하고, 젤라틴 코팅 그룹의 사람들과는 달리, 유지하지 않았다. 무 코팅 접시에 전사 한 후, 더 첨부 hPSCs (도 3C)에 대해 관찰되지 않았다. C의onfirm hPSCs가 hPCCM 장기 배양 후 대조군에 유 전적으로 동일한라고, 두 그룹 모두에서 병렬로 배양 hPSCs 16 게놈 유전자 좌 (그림 3D 및 E)에 대한 짧은 탠덤 반복 (STR) 기술을 사용하여 분석 하였다.
hPSCs의 체외 배양에 관한 널리 인정 개념의 bFGF는 자기 갱신을 촉진 할 필요가 있다는 것입니다. bFGF에없는 경우, hPSCs는자가 재생 (self-renewal) 능력을 상실하고 12,13 차별화. hPCCM 상태에서, hPSCs는 자기 갱신 능력을 상실하고 안정적으로 장기 문화 (그림 4A - C) 동안 능성 마커를 표시하지 않았다.
세 배엽의 세포로 분화 할 수있는 능력은 hPSCs의 독특한 고유 한 특성이다. 모든 hPSC이 기능의 보존을 확인하기 위해 테스트해야합니다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 자발적 hPSCs 세포로 분화hPCCM 유도의 이주 (도 5A와 B) 후 3 배엽의 S. 이러한 데이터는 hPCCM 임상 사용을위한 최적임을 나타냅니다.
hPSC 전송 중에 젤라틴 코팅 접시에 부착 시간은 hPSC 전파 상업적 합성 매트릭스로 코팅 접시에있는 것보다 더 길다. 일반적으로 세포가. 합성 기판에 코팅 한 후 하루 내에 부착 된 0.1 % 젤라틴에와 제어 접시에 6은 첨부 파일을 그림. 24 시간 후 계대 배양 hPSCs는 제어 (그림 6A)에 비해 젤라틴에 약간 더 붙어 있습니다. hPSCs는 신중하게 처리해야한다. 48 시간 후, hPSCs는 완전히 부착 젤라틴 코팅 요리 (그림 6B)에 확장을 시작했다. 또한, hPSCs는 젤라틴에 하위 문화 (그림 6C) 후 5 일째에 효과적으로 형성 포장 식민지 성장을 보였다. hPSCs,주의 treatmen에 대한 접속 기간 동안t는 중요하고 생존과 자기 갱신에 영향을 미칠 수있다. hPCCM 조건에서 48 시간 동안 강하게 hPSCs의 부착을 권장합니다.
그림 1 : 인간의 태반 융모막 융모에서 세포 분리 (A) 신선한 태반 융모 조직이 트립신 후 PBS로 세척 하였다.. (B) 융모 멸균 수술 가위를 사용하여 조각으로 절단 하였다. (C) 융모 혈관 잔해를 제거하기 위해 PBS로 수회 세척 하였다. (D - E) 융모, 마이크로 원심 분리 튜브에 옮겼다 (최대) 다진 세정. (F) 조직은 탁상 원심 분리기를 사용하여 원심 분리 하였다. (G)이 프로세스는 예열 배지에서 PBS에 세 번을 두 번 반복 하였다. (H) 세포 조직 및 예비 젤라틴 코팅 된 플라스크에서 함께 접종 5-7 일 동안 배양 하였다. 세포 부착 및 유독.
그림 2 : 인간 태반 유래 세포의 배양 (A)를 분리 후 약 일주, 유독 젤라틴 코팅 플라스크와 섬유 아세포와 같은 세포에 부착 된 인간 태반 조직과 세포.. 첫번째 계대 배양 후 통로 (B)는, 조직을 제거 하였다. 매체는 매일 신선한 매체로 대체했습니다. (다) 제 3 통로 후, 세포를보다 균일 나타났다. 스케일 바 :. 200 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 :. 젤라틴 코팅 요리에 hPCCM 인간 만능 줄기 세포는 젤라틴 코팅 요리에 hPCCM에서 배양 13 구절, hPSCs, 후, 높은 알칼리성 포스파타제 (AP) 활성을 나타냈다. (A) (H1)과 iPSCs는 (마트 리겔 코팅 요리에 mTeSR1) 제어 조건에서 배양 하였다. (B) H1 및 iPSCs 젤라틴 코팅 접시에 hPCCM에서 배양 하였다. 왼쪽 패널 : 시야; 오른쪽 패널 : 알칼리 포스 파타 아제 염색. (C) (H1)과 IPSC는 옮겨진 비교에 대한 몇 가지 매트릭스 코팅 접시에 배양 하였다. 5 통로 hPSCs가 배양 한 후 그림과 같이. 라미닌 코팅 요리, 비트로 넥틴 코팅 요리, 비 코팅 요리. (D - E) hPSCs에 대한 STR 분석은 제어 hPSCs에 비해 hPCCM에서 배양 하였다. 스케일 바 :. 10 μm의 하십시오 C이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 핥아.
그림 4 :. 14 구절 후 SSEA-4, 10월-4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 및 TRA-1-81에 대한 항체와 인간 만능 줄기 세포 전파의 bFGF를 필요로하지 않는다 (A) H1 세포 면역 형광 염색법 에 hPCCM에서 요리를 젤라틴 코팅. 스케일 바 : 10 μm의. (B) RT-PCR 분석은 실험 조건의 제어 및 다른 세포주에서 stemness 마커, OCT4, NANOG 및 Rex1의 발현을 측정 하였다. (C) 다 능성 마커 단백질 발현 수준, OCT4, SOX2, 및 FGF2는 서쪽 오 점으로 측정 하였다 hPSCs에. 이 figur의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오전자.
그림 5 : 체외에서 만능의 분석. (A) QRT-PCR 분석 hPCCM 조건에서 재배 stemness 마커, OCT4 및 NANOG의 발현 및 분화 된 세포에서 세 배엽 마커의 발현 및 미분화 세포를 측정 하였다. . 중배엽 스틴, SOX1 : 외배엽, AFP, GATA3 내배엽 그래프에 도시 된 바와 같이, 측정 제어 배양 조건 (OCT4) T, β HNF3의 관찰 발현 수준으로 표준화되었다. 오차 막대는 ± 표준 편차 수단을 나타냅니다. (B) H1과 중배엽 포함 이주 (최근 desmin), 외배엽 (TUJ1) 후 배아 체 형성의 실험 조건에서 10 계대 배양 IPSC 라인내배엽 (AFP, GATA4), 면역 형광 염색법에 의해 측정. 스케일 바 :. 100 ㎛, 200 ㎛ 인 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :.이 매트릭스 코팅 플레이트 사이 hPSC 첨부의 비교 (H1)과 IPSC-1, 다른 조건에 전달 0.1 % 젤라틴 hPCCM과 대조군했다. () hPSC 하위 문화 후 일일. 이일 hPSC 서브 배양 후 (B). 오일 hPSC 서브 배양 후 (C). 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 모델은, 예컨대의 bFGF 또는 인슐린과 같은 외인성 재조합 성장 인자 첨가없이 인간화 피더가없는 배양 조건에서의 특성을 유지 인간화 미세 환경에서 hPSCs의 조작을 가능하게하면서 성공적 hPSCs를 전파하기 위해 개발되었다. 외인성 bFGF를 보충 일반적입니다 및 마트 리겔 또는 라미닌 등 하층의 응용 프로그램은 hPSCs (14)의 공급이없는 배양을 위해 필수적이다.
이 프로토콜은 간단하고 쉽게 구현할 수있다. 그러나 일부 단계는 성공에 매우 중요합니다. 가장 중요한 단계는 태반으로부터 융모막 세포의 무균 단리이다. 태반에 대한 수집 방법에 의해, 예컨대 미코 플라스마와 같은 병원균에 의한 오염의 위험이 높다. 따라서, 세포의 분리시 병원체 검사 및 관리가 매우 중요하다. 또한, 모든 절차 무균 수행되어야한다. conditione의 컬렉션인간 태반 세포의 배양 배지에서 D는 일반적으로 용이하다. 그들의 처리가 다소 어렵 기 때문에 그러나, hPSC 문화의 경험이 필요하다. 또 다른 중요한 점으로,이 프로토콜을 사용하여 연구원은 명심해야이 프로토콜에 hPSCs의 부착에 필요한 시간은 대중 문화 방법 (약 24 시간) 이상 (36-48 시간)이 더 있다는 사실. 이 차이는 hPSCs의 생존 또는 증식에 영향을주지 않습니다. 반대로,이 프로토콜에 따른 배양 hPSCs의 성장은 종래의 프로토콜을 사용하여 배양 된 세포보다 더 강력하다.
또한,이 프로토콜은 혈통 분화 유도 용 응용 프로그램을 가지고있다. 예를 들어 배아 - 유사 세포 또는 전구 세포 인간이 프로토콜의 응용 또는 개조에 의해 유용한 세포 또는 조직으로 전환 될 수있다. 그것은 다양한 조건에서 특정 외생 보충제를 식별 할 수있는 더 접근 플랫폼을 제공합니다.이 프로토콜의 한 제한은 태반 수집에 hPCCM 생산의 의존성이다. 따라서, 인간 태반 연속 공급이 필요하다.
이 추가 외생 합성 기판없이 hPSC 전파에 대한 생체 공급이없는 인간화 된 환경을 제공하기 때문에이 프로토콜은 중요하다. 이 기술을 마스터 한 후 향후 방향은 동물과 hPCCM에서 배양 hPSCs에서 파생 된 제품의 임상 연구에 적용 할 수 있으며 hPSCs의 확산 및 첨부 파일에 영향을 미치는 메커니즘을 결정합니다. 이 hPCCM에 hPSCs의 성공적인 전파에 대한 최초의 상세한 프로토콜입니다. 특히,이 프로토콜은 줄기 세포 연구와 그 응용 및 관련 연구 결과에 대한 자세한 연구에 새로운 지평을 열 수있는 것이 보증됩니다.
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Disclosures
저자는 관심의 충돌을 표시하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 태반 조직을 제공하기 위해 곧-철이 홍콩 (MD, 박사, 부교수, 산부인과학과, 의과 대학 고려 대학교)에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 한국의 국립 연구 재단 (NRF), 대한민국에서 보조금 (R1211902)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
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