Protocol
Déclaration éthique: L'étude de placenta humain a été réalisée de manière prospective, avec l'approbation de l'Institutional Review Board pour la recherche humaine de l'Université de Corée (AN09085-001). Toutes les expériences ont été réalisées dans une salle blanche Germ-gratuit au Centre médical de l'Université de Corée. La conception et les procédures utilisant hPSCs expérimentale ont été approuvés par l'Institutional Review Board de l'University Medical Center Corée (AN12277-003).
1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats
- Manteau de toutes les boîtes de culture avec 0,1% de gélatine. Autoclave une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une pince. Stériliser ciseaux chirurgicaux, des microtubes, et de la gaze à 121 ° C sous £ 15 psi pendant plus de 15 min.
- 0,25% de trypsine-éthylène amine tétra-acétique, préparé préchauffé (trypsine-EDTA) et support préchauffé culture filtré (DMEM) contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml streptomycavant de commencer les procédures.
2. Isolement cellulaire à partir de placenta humain
- Obtenir le tissu placentaire, après la livraison de césarienne, de femmes enceintes en bonne santé qui subissent un avortement thérapeutique normal ou au 7-32 semaines de gestation après l'obtention du consentement éclairé écrit.
- Avoir le spécialiste obstétriques placenta humain plaques choriales chirurgicalement séparées (CAH) du placenta; incuber dans ces 0,25% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 20 min, puis laver avec 5 ml de PBS.
- Isoler villosités choriales du CAH l'aide de ciseaux; émincer les villosités et les laver trois fois avec 1 ml de PBS. Après hachage, placer les villosités choriales dans un tube de centrifugeuse en utilisant une pointe de pipette; laver les échantillons avec 500 pi de PBS par pipetage de haut en bas, et centrifuger les tubes pour 120 g pendant 3 min. Laver deux fois les tissus avec 500 ul de milieu de culture préchauffé.
- les cellules dans du milieu de culture sur des plaques revêtues de gélatine à 37 ° C, dans 5% de CO 2
- Remplacez le milieu tous les 2-3 jours jusqu'à ce que le troisième passage. Au cours de la culture, l'enlèvement des débris de cellules flottant dans le milieu de culture; fibroblastes placentaires croissance vont attacher à la plaque. Culture des cellules de fibroblastes provenant de l'HPC à la 10 ème passage, puis les récolter pour les cultures de CSEh après trypsinisation et la mitomycine-C (10 pg / ml) de traitement.
- Avant la congélation CAH que des échantillons d'achat d'actions, utiliser transcription inverse-réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) pour confirmer que BHP ne sont pas contaminés par des agents pathogènes qui infectent couramment le placenta, y compris les mycoplasmes (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,et M. capricolum) et les espèces bactériennes, Ureaplasma urealyticum, en utilisant un kit de détection de mycoplasme.
- Suivez les instructions du fabricant pour effectuer RT-PCR, utiliser toutes les amorces et des mélanges fournis dans le kit. Utilisez les surnageants des cellules qui ont été cultivées pendant 36 jours pour la détection des mycoplasmes. Ajouter 3 ul de ces échantillons pour les mélanges de PCR et effectuer la procédure 1 er PCR pendant 35 cycles, chacun consistant en 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 2 min, et 72 ° C pendant 1 min.
- Ajouter avec précaution 0,5 ul du produit de PCR 1 er au mélange PCR et effectuer la procédure 2 ème PCR pendant 30 cycles en utilisant les mêmes conditions que précédemment. Analyser les produits amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%; appliquer 10 pi de chacun des 1 er et 2 ème produits PCR pour les gels.
- Si CAH sont trouvés d'être contaminés par des agents pathogènes, les élimineren utilisant une combinaison d'antibiotiques (BM-cycline), en suivant les instructions du fabricant. Ajouter un nouveau milieu contenant 10 pg / ml de BM-cycline 1 pendant 3 jours, puis traiter les cellules avec 5 ug / ml BM-cycline 2 pendant 4 jours. Répétez ce cycle deux fois, puis vérifier la contamination par des mycoplasmes nouveau.
3. Les cellules de placenta humain récolte dérivés milieu conditionné (hPCCM)
- Après l'exclusion de la contamination, de traiter les cellules attachées (85-90% de confluence; (1,5 × 10 7 cellules / fiole) avec de la mitomycine-C (10 ug / ml) pendant 2 heures et 30 min, et lavé les cellules trois fois avec 10 ml PBS. incuber les cellules avec un milieu préchauffé sans mitomycine-C pendant 24 heures.
- Un jour après le traitement, incuber les cellules dans 10 ml de milieu (DMEM-F12 supplémenté avec 20% de sérum knock-out remplacement [KOSR], 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 1% de NEAA et 1% de pénicilline-streptomycine). Après 24 heures d'incubation, la récolte CM dans un tube conique de 15 ml etfiltrage du CM à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 um.
- Ajouter encore 10 ml de nouveau milieu et l'incubation. Collecter toutes les surnageants des cultures chaque jour pendant 1 semaine et geler le milieu récolté à -80 ° C. D'éviter les cycles de gel-dégel.
4. culture des droits de cellules souches embryonnaires (CSEh) et l'induction de cellules souches pluripotentes (CISP)
- Obtenir des lignées de cellules souches embryonnaires humaines, les cellules H1 et H9 (énumérés dans le registre NIH CSEh sous le nom WA01 et WA09, respectivement) et induit-pluripotentes cellules souches iPSC-1: iPS (prépuce) -1 et iPSC-2 (IISH1i- BM) de l'Institut de recherche WiCell (Madison, WI, USA). Les cellules doivent être décongelés et mis en culture selon les instructions du fabricant.
- Pour le groupe de contrôle, des cellules de culture sur la vaisselle membrane basale Matrix-revêtus largement utilisé dans le milieu de culture défini sans sérum sans chargeur et à 37 ° C et à 5% de CO 2. Initialement, semences 80-100 touffes de hPSCs in 35 mm plats. Cultiver les cellules dans ces plats jusqu'à 70-80% de cellules de passage de confluence et de routine sous-culture une fois tous les 5-6 jours, en utilisant des méthodes mécaniques ou enzymatiques (Dispase). Laver les cellules deux fois avec du milieu de pré eux dans un rapport de 1: 4. Remplacez le milieu avec un milieu frais tous les jours.
- Pour les groupes expérimentaux, des cellules en culture dans hPCCM sur des plats pré-revêtues avec 0,1% de gélatine et d'effectuer des passages de routine une fois tous les 5 jours, soit mécaniquement, soit par voie enzymatique. cellules de la plaque à des rapports dans la plage de 1: 6-1: 10. hPSCs attachent à la gélatine dans les 2 jours après le transfert. Remplacez le support avec un milieu frais tous les jours.
5. Caractérisation des pluripotentes humaines Cellules souches
NOTE: Caractériser hPSCs utilisant plusieurs méthodes, telles que alcaline phosphatase coloration, immunocytochimie, quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) et Western blot.
- Immunofluorescence
- Pour immunofluorescence coloration, hPSCs de culture et fixer les cellules dans 8 puits chambres de diapositives avec 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 10 min; ensuite, les cellules perméabilisées avec 0,1% (v / v) de Triton-X100 pendant 15 min, et de bloquer les cellules pendant 1 heure avec 3% (v / v) de sérum de cheval normal dans du PBS contenant 0,1% (v / v) de Tween 20. Laver PBS deux fois pendant 5 min entre chaque étape.
- Incuber les cellules avec l'anticorps primaire (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, dilution de 1: 1000) O / N à 4 ° C et avec l'anticorps secondaire.
- Avant le montage, incuber les cellules avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes dans l'obscurité. Laver les cellules rigoureusement trois fois pendant 5 min chacun et secs cellules complètement, dans l'obscurité. Préserver les cellules de la fluorescence milieu de montage et de les observer sous un microscope à fluorescence.
- qRT-PCR
- Isoler l'ARN total à partir de cellules en utilisant un kit RNeasy selon les spécifications du fabricant et de quantifier l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre Goutte Nano. La synthèse d'ADNc par addition de 2 pg de l'ARN total à un oligonucléotide contenant 20 ul de mélange réactionnel (dT) et des amorces de transcriptase inverse Superscript II; suivre les instructions du fabricant dans cette procédure.
- Amplifier l'ADNc synthétisé avec un système de iQ iCycler Bio-Rad, en utilisant iQ qPCR SYBR Green Master Mix et les séquences d'amorces décrites dans le tableau supplémentaire S1. Normaliser les valeurs de seuil de cycle des gènes d'intérêt à ceux de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH).
- Phosphatase alcaline (AP) coloration
- Détecter l'activité AP en utilisant la caractérisation de cellules ES Kit, selon le protocole du fabricant.
- Au jour 5, aspirer les médias et fixer les hPSCs avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 12 min. Ne pas overfix; fixation des cellules pendant plus de 2 min donnera lieu à l'inactivation de la phosphatase alcaline. Aspirer le fixateur et rincer à l'1x Rinse Buffer. Ne paslaisser sécher les puits entre les étapes.
- Ajouter une solution de coloration assez pour couvrir chaque puits (1 ml par puits d'une boîte de 35 mm). Incuber les plaques dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
- Après incubation, laver la vaisselle avec 1x Rinse Buffer. cellules de couverture avec 1x PBS pour éviter le dessèchement et examinent et l'image les cellules colorées en utilisant un microscope Olympus.
- Western Blot
- Effectuer une analyse western blot comme décrit précédemment dans 9. En bref, déterminer les concentrations protéiques dans les lysats cellulaires. Résoudre des quantités égales de protéine à une électrophorèse sur gel de sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) de gel de dodécylsulfate de sodium et le transfert des protéines sur un polyfluorure de vinylidène (PVDF).
- Bloquer le transfert et sonder O / N avec des anticorps primaires différentes à 4 ° C; incuber ensuite l'blot avec des anticorps secondaires conjugués à HRP pendant 1 heure. Laver la membrane trois fois pendant 10 min à chaque fois entre les incubations. Détecter des signaux à l'aide d'un réactif ECL.
- Court Répétez Tandem (STR) Analyse
- hPSCs ont été récoltées dans les groupes témoins et expérimentaux dans le même passage. L'ADN génomique a été extrait en utilisant un kit Micro ADN, selon les instructions du fabricant.
- Amplifier l'ADN génomique pour 16 loci génétiques différents en utilisant le kit d'amplification PCR ampf / STR, selon les spécifications du fabricant et électrophorèse capillaire a été réalisée en utilisant un analyseur génétique.
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Representative Results
Un avantage de cette méthode de propagation de HPSC est qu'elle utilise des composants sécrétées à partir de cellules humaines. Une étape la plus ciritical dans le protocole est l'isolement et la culture de cellules placentaires humaines dérivées. Cela exige et la dissection précise d'une partie précise de HPC plaque villosités. La figure 1 montre la procédure pour l'isolement cellulaire dérivée du placenta humain. Ce procédé est simple et commode pour l'isolement de cellules, et peut facilement être réalisée à l'intérieur de 1 heure. Comme décrit dans la figure 2, les tissus attachés à des cellules de vaisselle et de fibroblaste revêtues de gélatine germées robuste. L'élimination des débris et des tissus décomposés lors des passages par traitement à la trypsine permet la sélection des cellules et assure une culture homogène. Ces cellules peuvent être utilisées pour produire un milieu conditionné pour HPSC de prolifération après avoir confirmé l'absence de contamination. Les conditions optimales ont été définies comme celles qui ont permis aux cellules de croître à 80-85% de confluence, après quoi èmee croissance a été arrêtée artificiellement (données non présentées).
hPSCs cultivées sur des cellules nourricières ou des matrices synthétiques peuvent être transférés dans des boîtes revêtues de gélatine dans hPCCM. La figure 3 montre que les lignes HPSC peuvent être maintenus dans hPCCM à un niveau similaire à celui observé pour les plaques Matrigel revêtues (Figure 3A et B). 0,1% de gélatine n'a pas été uesd pour la culture HPSC jusqu'à maintenant. Dans nos conditions, hPSCs développées et maintenues pluripotence, similaire à hPSCs dans le groupe de contrôle. Pour confirmer que le hPCCM accessible autres matrices pour la culture HPSC, hPSCs ont été repiquées sur la laminine, la vitronectine et des plats non revêtus. HPSC attaché et a grandi dans hPCCM sur laminin- et des plats revêtues de vitronectine. Cependant, après plusieurs passages, de nombreuses colonies ont été différenciées et ne maintiennent pas, contrairement à ceux du groupe de la gélatine revêtues. Après le transfert de la vaisselle non revêtues, pas d'attachement a été observée pour hPSCs (figure 3C). À confirm que hPSCs étaient génétiquement identique au groupe de contrôle après la culture à long terme dans hPCCM, hPSCs cultivées en parallèle des deux groupes ont été analysés en utilisant une répétition en tandem court (STR) technique pour 16 loci génomiques (Figure 3D et E).
Une notion largement acceptée au sujet de la culture ex vivo de hPSCs est que bFGF est nécessaire pour promouvoir l'auto-renouvellement. En l'absence de bFGF, hPSCs perdent leur capacité d'auto-renouvellement et se différencient 12,13. Dans l'état de hPCCM, hPSCs ne perdent pas leur capacité d'auto-renouvellement et exprimés de manière stable marqueurs de pluripotence pendant la culture à long terme (figure 4A - C).
L'aptitude à la différenciation dans les cellules de trois couches germinales est une caractéristique unique de hPSCs intrinsèque. Chaque HPSC doit être testé pour vérifier la préservation de cette capacité. Comme le montre la Figure 5, hPSCs spontanément différenciées en celluless des 3 couches germinales après deux semaines d'induction dans hPCCM (figure 5A et B). Ces données indiquent que hPCCM est optimal pour une utilisation clinique.
Le temps de fixation sur des boîtes revêtues de gélatine pendant le transfert HPSC est plus longue que sur des boîtes revêtues de matrices synthétiques dans le commerce pour la propagation HPSC. Habituellement, les cellules fixées dans un jour après le revêtement avec des substrats synthétiques. La figure 6 montre la fixation de 0,1% de gélatine et sur les plaques de commande. Après 24 h hPSCs sous-culture attachés un peu plus sur la gélatine que sur le contrôle (figure 6A). hPSCs doivent être manipulés avec précaution. Après 48 h, hPSCs ont été complètement fixés et ont commencé l'expansion sur des plats revêtus de gélatine (figure 6B). En outre, hPSCs semblaient croître colonies efficace et formé emballés de 5 jours après la sous-culture de gélatine (Figure 6C). Au cours de la période de fixation pour hPSCs traitemen soigneux,t est important et peut influencer la survie et l'auto-renouvellement. Dans des conditions hPCCM, une période de 48 heures est fortement recommandé pour la fixation de hPSCs.
Figure 1: Isolement cellulaire à partir de placenta humain villosités choriales (A) le tissu chorionique placentaire frais a été lavé dans du PBS après traitement à la trypsine.. (B) Les villosités ont été coupés en morceaux avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés. (C) Villi ont été lavées plusieurs fois dans du PBS pour éliminer les débris et les vaisseaux. (D - E) Villi été transféré dans un tube de micro-centrifugeuse, hachée (maximum) et on le lave. (F) Les tissus ont été centrifugés aide d'une centrifugeuse de table. (G) Ce procédé a été répété trois fois dans du PBS et deux fois dans un milieu de culture préchauffé. (H) des cellules et les tissus ont été ensemencées en même temps sur un flacon pré-revêtues de gélatine et on incube pendant 5-7 jours. Les cellules attachées et germées.
Figure 2: Culture de cellules placentaires humaines dérivées (A) Environ 1 semaine après l'isolement, les tissus et les cellules placentaires humaines attachées à des flacons revêtues de gélatine et des cellules de type fibroblaste germées.. (B) Après le premier passage de la sous-culture, les tissus ont été éliminés. Le milieu a été remplacé par du milieu frais tous les deux jours. (C) Après le troisième passage, les cellules sont apparues plus homogène. Les barres d'échelle:. 200 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3:. Humain cellules souches pluripotentes dans hPCCM sur plats revêtus de gélatine Après 13 passages, hPSCs, cultivées en hPCCM sur plats revêtus de gélatine, exposées haute phosphatase alcaline (AP) activité. (A) H1 et CSPi ont été cultivées dans des conditions de contrôle (mTeSR1 sur Matrigel plats revêtus). (B) H1 et ont été cultivées dans iPSCs hPCCM sur des boîtes revêtues de gélatine. Le panneau de gauche: champ clair; Panneau de droite: alcaline phosphatase coloration. (C) H1 et iPSC ont été transférés et cultivé sur plusieurs assiettes de matrice revêtu pour la comparaison. Comme le montre, après 5 passages hPSCs ont été cultivées. plats revêtus de laminine, de la vaisselle revêtues de vitronectine, de la vaisselle non-revêtues. (D - E) pour l'analyse STR hPSCs cultivé dans hPCCM rapport à hPSCs de contrôle. Les barres d'échelle:. 10 pm S'il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Propagation de cellules souches pluripotentes humaines ne nécessite pas bFGF (A) H1 cellule immunofluorescence avec des anticorps contre SSEA-4, Oct-4, SOX2, NANOG, TRA-1-60, et TRA-1-81 après 14 passages plats de gélatine à revêtement en hPCCM. Barre d'échelle: 10 um. Analyse (B) RT-PCR a été utilisée pour mesurer l'expression des marqueurs de caractère souche, OCT4, NANOG, et Rex1 dans les différentes lignées cellulaires dans des conditions expérimentales et de contrôle. Les niveaux de marqueurs de pluripotence d'expression de protéines (C), OCT4, SOX2, et FGF2, dans hPSCs ont été déterminées par des transferts Western. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Analyse de la pluripotence in vitro. Analyse (A) qRT-PCR a été utilisée pour mesurer l'expression des marqueurs de stemness, OCT4 et NANOG et l'expression des marqueurs de la couche de trois germinales dans des cellules différenciées et des cellules indifférenciées cultivées dans des conditions hPCCM. Comme le montre le graphique, les mesures ont été normalisés aux niveaux d'expression observés dans les conditions de culture témoin (Oct4) T, β de HNF3:. Mésoderme, la nestine, SOX1: ectoderme, AFP, GATA3: endoderme. Les barres d'erreur indiquent la moyenne ± SD. (B) H1 et lignes iPSC qui ont été cultivées pendant 10 passages dans des conditions expérimentales corps embryoïdes formés après deux semaines qui contenaient mésoderme (desmine), ectoderme (TUJ1),et l'endoderme (AFP, GATA4), telle que mesurée par immunofluorescence. Les barres d'échelle:. 100 um, 200 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Comparaison de fixation HPSC entre deux plaques de matrice revêtu H1 et iPSC-1 ont été transférés dans des conditions différentes, 0,1% de gélatine dans hPCCM et le groupe témoin. (A) 1 jour après la sous-culture HPSC. (B) deux jours après sous-culture HPSC. (C) 5 jours après sous-culture HPSC. Les barres d'échelle:. 10 pm S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce modèle a été mis au point pour se propager avec succès hPSCs, tout en conservant leurs caractéristiques, dans des conditions de culture sans cellules nourricières humanisés sans l'addition de facteurs de croissance recombinants exogènes tels que bFGF ou de l'insuline, ce qui permet la manipulation de hPSCs dans un micro-environnement humanisé. Exogène supplémentation bFGF est commun et l'application de substrats tels que Matrigel ou laminine est essentiel pour la culture libre-chargeur de hPSCs 14.
Ce protocole est simple et facile à mettre en œuvre. Cependant, certaines étapes sont essentielles à son succès. L'étape la plus importante est l'isolation aseptique de cellules de chorion du placenta. En raison des méthodes de collecte pour le placenta, le risque de contamination d'agents pathogènes tels que les mycoplasmes est élevée. Par conséquent, l'examen et la gestion pathogène pendant l'isolement de cellules sont très importants. En outre, toutes les procédures doivent être effectuées de façon aseptique. La collection de conditioned médias de la culture de cellules de placenta humain est généralement facile. Cependant, l'expérience dans les cultures HPSC est nécessaire car leur manipulation est un peu difficile. Comme un autre point important, le chercheur en utilisant ce protocole doit garder à l'esprit que le fait que le temps nécessaire pour la fixation de hPSCs dans ce protocole est plus longue (36-48 h) que les méthodes de culture populaire (environ 24 h). Cette différence n'a aucune incidence sur la viabilité ou la prolifération de hPSCs. Au contraire, la croissance de hPSCs cultivés selon ce protocole est plus robuste que celle des cellules cultivées en utilisant des protocoles classiques.
En outre, ce protocole a des applications pour l'induction de la différenciation de la lignée. Par exemple, les cellules germinales embryonnaires-like ou des cellules souches humaines peuvent être transformées en cellules ou tissus utiles par l'application ou la modification de ce protocole. Il fournit une plate-forme plus accessible pour identifier les suppléments exogènes spécifiques dans diverses conditions.Une limitation de ce protocole est la dépendance de la production hPCCM sur l'acquisition de placenta. Par conséquent, un apport continu de placenta humain est nécessaire.
Ce protocole est important car il fournit un environnement humanisé ex vivo libre-chargeur pour la propagation HPSC sans substrats synthétiques exogènes supplémentaires. Orientations futures après la maîtrise de cette technique pourraient être appliquées aux études cliniques de produits dérivés de hPSCs cultivées dans hPCCM animale et, et de déterminer les mécanismes qui affectent la prolifération et l'attachement de hPSCs. Ceci est le premier protocole détaillé pour la propagation réussie de hPSCs dans hPCCM. Notamment, ce protocole pourrait ouvrir de nouveaux horizons dans la recherche sur les cellules souches et d'autres études concernant les applications et les recommandations qui en découlent sont garantis.
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Disclosures
Les auteurs indiquent aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., professeur agrégé, Département d'obstétrique et de gynécologie, Collège médical de l'Université de Corée) pour fournir le tissu placentaire. Ce travail a été financé en partie par des subventions (R1211902) de la National Research Foundation de Corée (NRF), République de Corée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
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