Protocol
Declaração de ética: O estudo da placenta humana foi realizado de forma prospectiva, com a aprovação do Comitê de Ética em pesquisa com seres humanos da Universidade da Coreia (AN09085-001). Todos os experimentos foram realizados em um livre de germes facilidade Clean Room no Centro Médico da Universidade da Coreia. O design e os procedimentos que utilizam hPSCs experimental foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos
- Brasão todos os pratos de cultura com 0,1% de gelatina. Autoclave salina tamponada com fosfato (PBS) e fórceps. Esterilizar tesouras cirúrgicas, tubos de microcentrífuga, e gaze a 121 ° C sob £ 15 psi durante mais de 15 min.
- 0,25% de tripsina-etileno amina tetra-acético, ácido preparado pré-aquecido (tripsina-EDTA) e meios de pré-aquecido cultura filtrada (DMEM) contendo 20% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina e 100 g / ml streptomycantes de iniciar os procedimentos.
2. isolamento de células de placenta humana
- Obter tecido placentário, após o parto cesariana, de mulheres grávidas saudáveis passando por aborto normal ou terapêutico em 7-32 semanas de gestação após a obtenção do consentimento informado por escrito.
- Já o especialista obstétrica placas corial placenta humana cirurgicamente separados (HPCs) a partir da placenta; incubar estes em 0,25% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 20 minutos, e, em seguida, lava-se com 5 ml de PBS.
- Isolar vilo corial de HPCs usando uma tesoura; mediu as vilosidades e lavá-los três vezes com 1 ml de PBS. Depois de picar a carne, coloque os vilo corial em um tubo de microcentrífuga utilizando uma ponteira; lavar as amostras com 500 � de PBS por pipetagem cima e para baixo, e centrifugar tubos de 120 g durante 3 min. Lavar tecidos duas vezes com 500 ul de meio de cultura de pré-aquecido.
- Células em meio de cultura em placas revestidas com gelatina a 37 ° C, em 5% de CO 2
- Trocar o meio cada 2-3 dias até a terceira passagem. Durante a cultura, a remoção de detritos de células flutuando no meio de cultura; crescimento de fibroblastos placentários irá anexar à placa. Cultura das células semelhantes a fibroblastos derivadas do HPC-se a 10 de passagem e, em seguida colhem-los para culturas de células estaminais embrionárias humanas após tripsinização e mitomicina-C (10 ug / ml) de tratamento.
- Antes da congelação HPCs como amostras de banco, usar de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) para confirmar que HPCs não estão contaminados com agentes patogénicos que infestam a placenta, incluindo Mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,e M. capricolum) e as espécies bacterianas, Ureaplasma urealyticum, utilizando um kit de detecção de micoplasma.
- Seguir as instruções do fabricante para realizar RT-PCR, utilizar todos os iniciadores e as misturas fornecidas no kit. Use os sobrenadantes das células que foram cultivadas por 36 dias para a detecção de micoplasma. Adicionar 3 mL destas amostras para as misturas de PCR e executar o procedimento 1 r PCR durante 35 ciclos, cada um consistindo em 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 2 min, e 72 ° C durante 1 min.
- Adiciona-se cuidadosamente 0,5 mL do produto de PCR 1 r-se à mistura de PCR e executar o procedimento 2 nd PCR durante 30 ciclos utilizando as mesmas condições que anteriormente. Analisar os produtos amplificados por electroforese em gel de 1% de agarose; aplicam-se 10 ul de cada um dos 1 e 2 de produtos de PCR para os géis.
- Se HPCs são encontrados para ser contaminados com agentes patogénicos, eliminar estesusando uma combinação de antibióticos (BM-Ciclina), seguindo as instruções do fabricante. Adicionar um novo meio que contém 10 ug / ml de BM-ciclina 1 durante 3 dias, e, em seguida, tratar as células com 5 ug / ml de BM-Ciclina 2 durante mais 4 dias. Repita este ciclo duas vezes e, em seguida, verificar se há contaminação por micoplasma novamente.
3. Células de colheita Placenta Humana derivados de meio condicionado (hPCCM)
- Após a exclusão de contaminação, tratamento das células ligadas (85-90% de confluência; (1,5 x 10 7 células / frasco) com mitomicina C (10 ug / ml) durante 2 horas e 30 minutos, e lavaram-se as células três vezes com 10 ml PBS. Incubam-se as células com meio de pré-aquecido, sem a mitomicina-C durante 24 h.
- Um dia após o tratamento, incubar as células em 10 ml de meio (DMEM-F12 suplementado com 20% de Knock-Out substituição Serum [KOSR], 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 1% de NEAA, e 1% de penicilina-estreptomicina). Após 24 h de incubação, a colheita CM num tubo cónico de 15 ml efiltrar o CM através de um filtro de seringa de 0,22? m.
- Adicionar 10 mililitros de novo meio e incubação. Recolhe todos os sobrenadantes a partir das culturas a cada dia durante 1 semana e congelar a forma colhidos a -80 ° C. Evitar congelar-descongelar repetidamente.
4. Cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e indução de células-tronco pluripotentes (iPSCs)
- Obter linhas de células estaminais embrionárias humanas, as células H1 e H9 (listados no registro do NIH hESC sob o nome WA01 e WA09, respectivamente) e induzida por células-tronco pluripotentes iPSC-1: iPS (prepúcio) -1 e iPSC-2 (IISH1i- BM), do Instituto de Investigação WiCell (Madison, WI, EUA). As células devem ser descongeladas e cultivadas seguindo as instruções do fabricante.
- Para o grupo de controlo, as células em pratos de cultura de Basement Membrane Matrix-revestidas em meio de cultura definido isento de soro, isento de alimentador e amplamente usado, a 37 ° C e em 5% de CO 2. Inicialmente, sementes 80-100 aglomerados de hPSCs in pratos de 35 mm. Cultivar células em esses pratos até 70-80% de confluência e rotineiramente células de passagem para a sub-cultura de uma vez a cada 5-6 dias, utilizando métodos mecânicos ou enzimáticos (Dispase). Lavar as células duas vezes com meio e placa-los em uma proporção de 1: 4. Substitua o meio com meio fresco todos os dias.
- Para os grupos experimentais, as células de cultura em hPCCM sobre pratos pré-revestidas com gelatina a 0,1% e executar passagens em rotina uma vez a cada 5 dias, quer mecanicamente ou enzimaticamente. As células em placas a proporções na gama de 1: 6-1: 10. hPSCs anexar a gelatina dentro de 2 dias após a transferência. Substitua o meio com meio fresco diariamente.
5. Caracterização de células estaminais pluripotentes humanas
NOTA: Caracterizar hPSCs usando vários métodos, tais como a coloração da fosfatase alcalina, imunocitoquímica,-PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), e transferência de western.
- Imunofluorescência
- Para immunofluorescence de coloração, hPSCs cultura e fixar as células em câmaras de 8 poços de deslizamento com 4% (w / v) de paraformaldeído durante 10 min; em seguida, as células permeabilizadas com 0,1% (v / v) de Triton-X100 durante 15 min, e bloquear as células durante 1 h com 3% (v / v) de soro de cavalo normal em PBS contendo 0,1% (v / v) de Tween- 20. Lave PBS duas vezes durante 5 minutos entre cada passo.
- Incubar as células com o anticorpo primário (Oct-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, diluição de 1: 1000) O / N a 4 ° C e com o anticorpo secundário.
- Antes da montagem, incubar as células com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 5 min no escuro. Lavar as células rigorosamente três vezes durante 5 min cada e secos completamente, as células no escuro. Preservar as células na fluorescência meio de montagem e observá-los sob um microscópio de fluorescência.
- qRT-PCR
- Isolar o ARN total a partir de células utilizando um kit RNeasy Mini acordo com as especificações do fabricante e quantificar o ARN extraído utilizando um Espectrofotómetro Nano gota. Sintetizar ADNc por adição de 2 ug de ARN total para a 20 ul de mistura de reacção contendo o oligo (dT) e iniciadores de transcriptase reversa Superscript II; siga as instruções do fabricante no presente processo.
- Amplificar o cDNA sintetizado com um sistema iQ Bio-Rad iCycler, usando iQ SYBR Green qPCR Master Mix e as sequências de primers descritos na Tabela Suplementar S1. Normalizar os valores de limiar de ciclo dos genes de interesse para os da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH).
- A fosfatase alcalina (AP) coloração
- Detectar a atividade AP usando o celular ES Caracterização Kit, de acordo com o protocolo do fabricante.
- No dia 5, aspirar a mídia e corrigir os hPSCs com paraformaldeído a 4% em PBS durante 12 min. Não overfix; que fixa as células durante mais de 2 minutos resultará na inactivação de fosfatase alcalina. Aspirar o fixador e lavar com 1x Rinse Buffer. Nãopermitir que os poços sequem entre etapas.
- Adicionar solução de coloração suficiente para cobrir cada poço (1 ml por poço de um prato de 35 mm). Incubar as placas no escuro à temperatura ambiente durante 15 min.
- Após a incubação, lavar pratos com 1x lavagem com tampão. Células de cobertura com 1x PBS para evitar a secagem e examinar e imagem das células marcadas utilizando um microscópio Olympus.
- Western Blot
- Realizar a análise Western blot, conforme descrito anteriormente em 9. Resumidamente, a determinação das concentrações de proteína em lisados celulares. Resolver quantidades iguais de proteína sobre uma electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato (SDS-PAGE) em gel de dodecilsulfato de sódio e transferir as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF).
- Bloquear a blot e sonda que O / N com anticorpos primários diferentes a 4 ° C; subsequentemente incubar a mancha com anticorpos secundários conjugados com HRP durante 1 hora. Lava-se a membrana três vezes durante 10 min de cada vez entre incubações. Detectar sinais usando um reagente ECL.
- Curto Repita Tandem (STR) Análise
- hPSCs foram colhidas a partir do controle e os grupos experimentais na mesma passagem. O ADN genómico foi extraído usando um kit de ADN Micro, de acordo com as instruções do fabricante.
- Amplificar o ADN genómico de 16 loci genéticos diferentes usando o Kit AMPF / STR Amplificação por PCR, de acordo com as especificações do fabricante e electroforese capilar foi realizada utilizando um analisador genético.
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Representative Results
Uma vantagem deste método de propagação HPSC é que ele utiliza componentes segregadas a partir de células humanas. Um passo mais ciritical no protocolo é o isolamento e cultura de células derivadas da placenta humana. Isto requer a dissecção precisa e de uma parte exacta da placa HPC vilosidades. A Figura 1 mostra o procedimento para o isolamento de células derivadas da placenta humana. Este processo é simples e conveniente para o isolamento de células, e pode ser facilmente realizada dentro de 1 hora. Tal como descrito na Figura 2, os tecidos ligados ao prato e semelhantes a fibroblastos células revestidas com gelatina germinados robusta. A remoção de detritos e tecidos deterioradas durante passagens por tripsinização permite a selecção de células e assegura uma cultura homogénea. Estas células podem ser utilizadas para produzir meio condicionado para HPSC proliferação de depois de confirmar a ausência de contaminação. As condições óptimas foram definidas como, aqueles que permitiu que as células cresçam a 80-85% de confluência, após o que the o crescimento foi interrompido artificialmente (dados não mostrados).
hPSCs cultivadas em células alimentadoras ou matrizes sintéticas podem ser transferidos para placas revestidas com gelatina em hPCCM. A Figura 3 mostra que as linhas HPSC pode ser mantida em hPCCM a um nível semelhante ao observado para as placas revestidas com Matrigel (Figura 3A e B). 0,1% de gelatina não foi uesd para cultura HPSC até agora. Nas condições estudadas, hPSCs expandida e mantida pluripotência, semelhante ao hPSCs no grupo de controlo. Para confirmar que o hPCCM acessada outras matrizes para a cultura HPSC, hPSCs foram sub-cultivadas em laminina, vitronectina e pratos não-revestidos. HPSC ligado e cresceu em hPCCM em laminin- e pratos revestidos com vitronectina. No entanto, depois de várias passagens, muitas colônias foram diferenciadas e não manteve, ao contrário daqueles no grupo revestido por gelatina. Após transferência para os pratos não revestidos, nenhuma ligação foi observado para hPSCs (Figura 3C). Para confirm hPSCs que foram geneticamente idêntico ao do grupo de controlo após a cultura a longo prazo em hPCCM, hPSCs cultivadas em paralelo a partir de ambos os grupos foram analisadas usando um short tandem repeats (STR) técnica de 16 loci genómico (Figura 3D e E).
A noção amplamente aceita sobre a cultura ex vivo de hPSCs é que bFGF é necessário para promover a auto-renovação. Na ausência de bFGF, hPSCs perdem a sua capacidade de auto-renovação e diferenciação 12,13. Na condição hPCCM, hPSCs não perdem a sua capacidade de auto-renovação e estavelmente expressa marcadores de pluripotência durante a cultura de longo prazo (Figura 4A - C).
A capacidade de diferenciação em células de três camadas germinais é uma característica intrínseca única de hPSCs. Cada HPSC devem ser testadas para verificar a preservação dessa capacidade. Como mostrado na Figura 5, hPSCs diferenciadas espontaneamente na células das três camadas germinativas após 2 semanas de indução em hPCCM (Figura 5A e B). Estes dados indicam que hPCCM é ideal para o uso clínico.
O tempo de ligação em placas revestidas com gelatina durante a transferência HPSC é mais longo do que é em pratos revestidos com matrizes comercialmente sintéticos para propagação HPSC. Normalmente, as células ligada dentro de um dia após o revestimento com substratos sintéticos. A Figura 6 mostra anexo em 0,1% de gelatina e nas placas de controlo. Após 24 h hPSCs sub-cultivadas em anexo ligeiramente mais do que em gelatina no controlo (Figura 6A). hPSCs devem ser manuseados com cuidado. Após 48 horas, hPSCs foram completamente ligado e começou a expansão em placas revestidas com gelatina (Figura 6B). Além disso, hPSCs apareceram colónias a crescer de forma eficaz e formado embalados no dia 5 após a sub-cultura em gelatina (Figura 6C). Durante o período de fixação para hPSCs, treatmen cuidadosast é importante e pode influenciar a sobrevivência e de auto-renovação. Em condições hPCCM, um período de 48 horas é fortemente recomendado para fixação de hPSCs.
Figura 1: isolamento de células a partir de placenta humana vilosidades coriónicas (A) coriónica tecido placentário fresco foi lavada em PBS após tripsinização.. (B) As vilosidades foram cortados em pedaços usando tesouras cirúrgicas esterilizadas. (C) vilosidades foram lavadas várias vezes em PBS para remover os restos e navios. (D - E) vilosidades foram transferidos para um tubo de micro-centrífuga, picada (máximo) e lavou-se. (F) Os tecidos foram centrifugadas utilizando uma centrífuga de mesa. (L) Este processo foi repetido três vezes em PBS e duas vezes em meio de cultura de pré-aquecido. (H) As células e tecidos foram semeadas em conjunto num balão de gelatina pré-revestidas e incubaram-se durante 5-7 dias. As células fixadas e germinados.
Figura 2: O cultivo de células derivadas da placenta humana (A) Aproximadamente uma semana após o isolamento, os tecidos placentários e células humanos ligados a frascos revestidos de gelatina e células semelhantes a fibroblastos germinados.. (B) Depois da primeira passagem subcultura, os tecidos foram removidos. O meio foi substituído por meio fresco a cada dois dias. (C) Após a terceira passagem, as células apareceram mais homogênea. Barras de escala:. 200 um favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3:. Humana células estaminais pluripotentes em hPCCM em pratos revestidos com gelatina Após 13 passagens, hPSCs, cultivadas em hPCCM em pratos revestidos com gelatina, exibiu fosfatase alcalina elevada (PA) actividade. (A) H1 e iPSCs foram cultivadas em condições de controlo (mTeSR1 em pratos revestidos com Matrigel). (B) H1 e iPSCs foram cultivadas em hPCCM em pratos revestidos com gelatina. Painel esquerdo: Campo brilhante; Painel direito: coloração fosfatase alcalina. (C) H1 e iPSC foram transferidos e cultivados em vários pratos revestidos de matriz de comparação. Como se mostra, após 5 passagens hPSCs foram cultivadas. Pratos revestidos com laminina, pratos revestidos com vitronectina, pratos não-revestidos. (D - E) STR análise para hPSCs cultivadas em hPCCM comparação com hPSCs controle. Barras de escala:. 10 m Por favor clamber aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Pluripotentes humanas propagação de células-tronco não requer bFGF (A) H1 célula imunofluorescência com anticorpos contra SSEA-4, OCT-4, SOX2, NANOG, TRA-1-60, e TRA-1-81 após 14 passagens em pratos revestidos de gelatina-em hPCCM. Barra de escala: 10 um. Análise (B) RT-PCR foi utilizada para medir a expressão dos marcadores stemness, OCT4, NANOG, e Rex1 nas diferentes linhas de células, em condições experimentais e de controlo. Os níveis de marcadores de pluripotência expressão da proteína (C), OCT4, SOX2, e FGF2, em hPSCs foram determinados por Western blot. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figure.
Figura 5: Análise de pluripotência in vitro. Análise (A) qRT-PCR foi utilizada para medir a expressão dos marcadores stemness, OCT4 e NANOG e a expressão dos marcadores de três camadas germinais em células diferenciadas e células indiferenciadas cultivadas em condições hPCCM. Como se mostra no gráfico, as medições foram normalizadas para os níveis de expressão observados nas condições de cultura de controlo (Oct4) t, β HNF3:. Mesoderme, nestina, SOX1: ectoderme, AFP, GATA3: endoderme. As barras de erro indicam a média ± SD. (B) H1 e linhas de IPSC que foram cultivadas durante 10 passagens sob condições experimentais formados corpos embrióides após 2 semanas que continham mesoderme (desmina), ectoderme (TUJ1),e endoderme (AFP, GATA4), tal como medida por coloração por imunofluorescência. Barras de escala:. 100 mm, 200 mm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:. Comparação de HPSC ligação entre duas placas revestidas com matriz H1 e iPSC-1 foram transferidas para condições diferentes, de 0,1% de gelatina em hPCCM e grupo de controlo. (A) 1 dia após a HPSC sub-cultura. (B) 2 dias depois HPSC sub-cultura. (C) 5 dias após HPSC sub-cultura. Barras de escala:. 10 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este modelo foi desenvolvido para propagar com sucesso hPSCs, mantendo ao mesmo tempo as suas características, em condições humanizadas de cultura isento de alimentação, sem a adição de factores de crescimento exógenos, tais como recombinantes de bFGF ou insulina, permitindo a manipulação de hPSCs num microambiente humanizado. Suplementação exógena bFGF é comum e a aplicação de substratos, tais como Matrigel ou laminina é essencial para a cultura livre de alimentador de hPSCs 14.
Este protocolo é simples e fácil de implementar. No entanto, alguns passos são fundamentais para o seu sucesso. O passo mais importante é o isolamento asséptico do córion células da placenta. Devido aos métodos de recolha para a placenta, o risco de contaminação de agentes patogénicos, tais como o micoplasma é alta. Assim, o exame patógeno e gestão durante o isolamento de células são muito importantes. Além disso, todos os procedimentos devem ser realizados em condições assépticas. A coleção de conditioned mídia a partir da cultura de células de placenta humana é geralmente fácil. Contudo, a experiência em culturas HPSC é necessária porque a sua manipulação é um pouco difícil. Como um outro ponto importante, o investigador que usa este protocolo deve ter em mente que o fato de que o tempo necessário para a fixação de hPSCs neste protocolo é mais longo (36-48 horas) do que os métodos de cultura popular (cerca de 24 h). Esta diferença não afeta a viabilidade ou a proliferação de hPSCs. Pelo contrário, o crescimento de hPSCs cultivadas de acordo com este protocolo é mais robusta do que a de células cultivadas por meio de protocolos convencionais.
Além disso, este protocolo tem aplicações para a indução de diferenciação de linhagem. Por exemplo, as células germinativas-like embrionárias ou células progenitoras humano pode ser transformado em células úteis ou tecidos por aplicação ou modificação do presente protocolo. Ele fornece uma plataforma mais acessível para identificar suplementos exógenos específicos em diversas condições.Uma limitação deste protocolo é a dependência da produção hPCCM na aquisição placenta. Portanto, é necessário um fornecimento contínuo de placenta humana.
Este protocolo é importante porque proporciona um ambiente humanizado ex vivo sem alimentador para a propagação HPSC sem substratos sintéticos exógenos adicionais. Direções futuras Depois de dominar esta técnica pode ser aplicada a estudos clínicos de produtos derivados de hPSCs cultivadas em hPCCM e animal, e para determinar os mecanismos que afetam a proliferação e fixação dos hPSCs. Este é o primeiro protocolo detalhado para a propagação bem sucedida de hPSCs em hPCCM. Notavelmente, este protocolo pode abrir novos horizontes na investigação sobre células estaminais e mais estudos sobre seus aplicativos e achados associados são garantidos.
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Disclosures
Os autores indicam que não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Professor Associado do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade da Coréia) para a prestação de tecido placentário. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas (R1211902) da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), República da Coreia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
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