一种新的文化模式的人多能干明胶胎盘条件培养基细胞增殖

Protocol

伦理声明：人类胎盘的研究进行前瞻性，与机构审查委员会对人类的高丽大学（AN09085-001）研究批准。所有的实验都是在无尘无菌室设施，在韩国大学医学中心进行。实验设计，并使用hPSCs程序批准了韩国大学医学中心的机构审查委员会（AN12277-003）。

1.准备仪器，文化传媒，和菜名

1. 涂层的所有培养皿用0.1％明胶。高压釜的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和钳子。下15磅psi的消毒手术剪，微量离心管，并纱布在121℃下为15分钟以上。
2. 制备的预热0.25％胰蛋白酶 - 乙烯胺四乙酸（胰蛋白酶-EDTA），并含有20％胎牛血清（FBS），100U / ml青霉素预热过滤培养培养基（DMEM），和100微克/毫升streptomyc在开始操作前。

从人胎盘2.细胞分离

1. 获得胎盘组织，后剖腹产分娩，从健康的孕妇获得书面知情同意后进行正常或治疗性流产在7-32孕周。
2. 有从胎盘产科专科手术分离人胎盘绒毛膜板（高性能计算机）;在37℃下在0.25％胰蛋白酶-EDTA孵育这些20分钟，然后冲洗，用5ml PBS中。
3. 隔离用剪刀高性能计算机绒毛;剁碎的绒毛和用1ml PBS冲洗三次。切碎后，将绒毛成用枪头一个离心管中;洗用500μl的PBS将样品通过上下抽吸，并离心管120×g离心3分钟。用500μl预热的培养基洗两次组织。
4. 培养的细胞在明胶包被的平板培养基在37℃下，在5％CO ₂
5. 交换介质每2-3天，直到第三通道。在培养期间，除去细胞碎片漂浮在培养基中;不断增长的胎盘成纤维细胞会附着到板上。培养物从HPC到^第 10位的通道，然后在成纤维细胞样细胞后胰蛋白酶消化和丝裂霉素-C（10微克/毫升）处理收获它们用于人类胚胎干细胞培养物。
6. 之前冻结高性能计算机作为股票样本，使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），以确认高性能计算机不沾染病原体通常感染胎盘，包括支原体（M. fermentans，M猪鼻，M精氨酸，男。ORALE，M. salivarium，人型支原体，M pulmonis，M. arthritidis，M. neurolyticum，猪肺炎支原体，和M.山羊 ）和细菌种类， 解脲脲原体 ，通过使用支原体检测试剂盒。
   1. 按照制造商的说明来进行RT-PCR，请使用套件中提供的所有引物和混合物。使用已培养了36天的支原体检测细胞的上清。加入3微升这些样品在PCR混合物并执行第¹次的PCR程序为35个循环，每个包括94℃，30秒，55℃2分钟，72℃1分钟。
   2. 小心加入0.5微升第¹次PCR产物的PCR反应混合物，并执行第2 ^次的PCR程序，使用相同的条件前30个周期。分析扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳;申请10微升每个第1 ^和第 2 ^次 PCR产物向凝胶。
7. 如果发现高性能计算机与病原体污染，消除这些使用抗生素的组合（BM-细胞周期蛋白），按照制造商的说明进行操作。添加含BM-周期蛋白1的10微克/毫升新培养基3天，然后处理细胞用5微克/毫升的BM-周期蛋白2另外4天。重复这个循环两次，然后检查是否有支原体污染了。

3.收获来自人胎盘的细胞条件培养基（hPCCM）

1. 不含污染后，处理的贴壁细胞（85-90％汇合;（1.5×10 ⁷个细胞/瓶）用丝裂霉素C（10微克/毫升）处理2小时和30分钟，并洗涤所述细胞三次，用10ml的PBS孵育细胞用预热的介质而不丝裂霉素-C 24小时。
2. 处理后一天，孵育细胞在10ml培养基（DMEM-F12补充20％敲除血清替代品[KOSR]，0.1毫β巯基乙醇，1％NEAA，和1％青霉素 - 链霉素）。经过24小时培养的，收获的CM在一个15毫升锥形管中，并使用0.22微米的注射器过滤器过滤的CM。
3. 添加另一个10毫升新媒体和孵化。每天收集所有上清液从培养1周和冻结所收获的培养基中于-80℃。避免反复冻融。

4.文化人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）和多能干细胞诱导（iPS细胞）

1. 获得人胚胎干细胞系，H1和H9细胞（分别在名义WA01和WA09美国国立卫生研究院的hESC注册表中列出），并诱导多能干细胞iPSC的1：的iPS（包皮）-1和iPSC的2（IISH1i- BM）从WiCell研究所（麦迪逊，威斯康星州，美国）。细胞应解冻和培养按照制造商的说明进行操作。
2. 为对照组，在广泛使用的无饲养和无血清定义培养基，在37℃基底膜基质被覆菜肴和在5％CO ₂培养细胞。最初，种子80-100团块hPSCs的我ñ35毫米的菜肴。生长细胞的这些菜，直到70-80％汇合，并定期通过细胞传代培养每5-6天一次，使用机械或酶方法（中性蛋白酶）。与介质洗涤细胞两次和板其中以1：4的比例。每天更换新鲜培养基介质。
3. 对于实验组，培养细胞中hPCCM上碗碟预涂覆有0.1％明胶和执行例行传代，每5天一次，通过机械或酶。板的细胞在1的范围内的比率：6-1：10。 hPSCs转移后附着到明胶内2天。每天更换新鲜培养基介质。

人多能干细胞的5.表征

注意：表征使用几种方法，诸如碱性磷酸酶染色，免疫细胞化学，定量实时PCR（QRT-PCR）和免疫印迹hPSCs。

1. 免疫荧光染色
   1. 对于immunofluorescencE染色，培养hPSCs和固定细胞在8孔载玻片室用4％（重量/体积）低聚甲醛10分钟;然后，透化的细胞用0.1％（体积/体积）的Triton-X100 15分钟，并阻断含有0.1％1小时的细胞用3％（体积/体积）正常马血清的PBS（体积/体积）吐温20。两次每一步之间的5分钟洗涤PBS。
   2. 孵育细胞与第一抗体（OCT-4，SSEA4，TRA-1-81，TRA-1-60，稀释1：1000）O / N在4℃下，并与二级抗体。
   3. 在安装前，孵育细胞4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）中5分钟，在黑暗中。洗涤细胞严格三次，每次5分钟，并干细胞完全，在黑暗中。保存细胞荧光封固剂，观察他们在荧光显微镜下。
2. 定量RT-PCR
   1. 分离总RNA，从使用根据制造商的规格的RNeasy小型试剂盒的细胞和量化使用纳米掉落分光光度计提取的RNA。 合成cDNA通过添加2微克的总RNA，以含寡20微升的反应混合物（dT）的引物和标II逆转录酶;按照此过程中的制造商的说明。
   2. 扩增合成的cDNA用Bio-Rad公司的iCycler iQ的系统中，采用的iQ SYBR绿定量PCR主混合物和补充表S1中所描述的引物序列。正常化的目的基因的循环阈值的那些的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。
3. 碱性磷酸酶（AP）染色
   1. 检测使用的ES细胞表征试剂盒AP活性，根据制造商的协议。
   2. 在第5天，吸出介质并固定在PBS中的4％多聚甲醛的hPSCs 12分钟。不要overfix;定影单元的时间超过2分钟，将导致在碱性磷酸酶的失活。吸出固定液，并用清水冲洗冲洗1X缓冲。别让井步骤之间干燥。
   3. 加入足够的染色溶液来覆盖每个孔（每35毫米培养皿的孔1ml）。孵育板在黑暗中在RT下15分钟。
   4. 孵育后，清洗餐具用1X冲洗缓冲。盖细胞用1×PBS，以防止干燥和使用Olympus显微镜检查和图像的染色细胞。
4. Western印迹
   1. 执行如先前在⁹中所述免疫印迹分析。简单地说，确定蛋白质浓度在细胞裂解物。解决蛋白上的十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶等量的蛋白质转印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。
   2. 块印迹和不同的初级抗体探查，O / N在4℃;随后孵育用HRP缀合的二级抗体的印迹1小时。对于保温之间，每次10分钟洗膜三次。检测用ECL试剂的信号。
   3. 短串联重复序列（STR）分析
      1. hPSCs从对照组和实验组在同一通道收获。使用DNA微试剂盒提取基因组DNA，根据生产商的说明。
      2. 放大用于使用AmpF / STR PCR扩增试剂盒16不同基因位点的基因组DNA，根据制造商说明和毛细管电泳是使用遗传分析仪进行的。

Representative Results

此HPSC传播方法的一个优点是，它使用了由人细胞分泌的成分。在协议A最ciritical步骤是人胎盘来源的细胞的分离和培养。这需要从HPC板绒毛的精确部分准确清扫。 图1示出了用于来自人胎盘的细胞分离的步骤。这个过程是简单的和方便的细胞的分离，并且可以很容易地在1小时内进行。如在图2中描述的，组织附着到发芽鲁棒明胶涂层盘和成纤维细胞样细胞。在传代通过胰蛋白酶消化除去碎片和腐烂组织的允许细胞的选择，并确保均匀的培养。这些细胞可以用来确认一个缺乏污染后，以产生的条件培养基用于HPSC增殖。最佳条件被定义为，那些允许细胞生长至80-85％汇合，之后，第Ë生长被人为停止（数据未显示）。

hPSCs在饲养细胞上的或合成的基质培养的可转移到明胶包被的培养皿中hPCCM。 图3示出了HPSC行可以保持在hPCCM在类似于所观察到的基质胶包被的平板（ 图3A和B）的水平。 0.1％的明胶一直没有uesd的HPSC文化直到现在。在我们的情况下，hPSCs扩大和维持多能性，类似于对照组hPSCs。以确认该hPCCM访问的其他基质的HPSC培养，hPSCs分别对层粘连蛋白，玻连蛋白和非包被的培养皿亚培养。 HPSC连接并在增长上hPCCM和层粘连蛋白玻连涂菜肴。但是，有几个传代后，许多菌落分化和未保持，不同于那些在明胶包被的组。转移到非包被的培养皿后，没有附着观察到hPSCs（ 图3C）。到confirm该hPSCs在遗传上等同于对照组中hPCCM长期培养后，hPSCs平行培养从两组使用短串联重复（STR）的技术为16个基因组座位（ 图3D和E）进行了分析。

一项关于hPSCs的体外培养广泛接受的观点是，bFGF的需要，以促进自我更新。在没有的bFGF，hPSCs失去了自我更新能力和分化^12,13。在hPCCM条件，hPSCs没有失去它们的自我更新能力和稳定表达的长期培养物（ 图4A - C）的过程中多能标记。

的能力，以分化成3胚层细胞是hPSCs的一个独特的固有特性。每个HPSC应进行测试，以验证这种能力的保存。 如图5，hPSCs自发分化为细胞s2周诱导在hPCCM（ 图5A和B）之后的3个胚层。这些数据表明，hPCCM是最佳的临床使用。

附着时间在明胶包被的培养皿HPSC传送期间长于它的菜涂有商购的合成矩阵HPSC传播。通常，将细胞与合成基材涂布后附在一天之内。 图6示出了附接于0.1％明胶和在控制板上。 24小时后亚培养hPSCs稍微附着在明胶比控制（ 图6A）。 hPSCs应谨慎处理。 48小时后，hPSCs被完全连接并开始膨胀在明胶包被的培养皿（ 图6B）。此外，hPSCs似乎在明胶亚培养（ 图6C）后第5天生长有效并形成包装的菌落。在实习期间的hPSCs，小心treatment是重要的，会影响生存和自我更新。在hPCCM条件下，48小时内强烈建议附件hPSCs的。

图1：从人胎盘绒毛膜细胞分离 （A） 的新鲜的胎盘绒毛膜组织在PBS中洗涤胰蛋白酶处理后。 （B）中的绒毛切割成使用无菌手术剪片。 （C）的绒毛洗涤几次在PBS以除去碎片和血管。 （D - E）的绒毛物转移到微量离心管中，切碎（最大）和洗涤。 （F）将组织用台式离心机离心。 （G），重复该过程在PBS洗三次，并两次在预热的培养基。 （H）的细胞和组织接种一起在一个预涂布明胶烧瓶中，并温育5-7天。细胞附着和发芽。

图2：培养人胎盘来源的细胞（A）中的分离后大约1周，附着于发芽明胶涂层烧瓶和成纤维细胞样细胞的人类胎盘的组织和细胞。 （B）中的第一个继代培养传代后，除去组织。将培养基替换为新鲜培养基每隔一天。 （C）的第三通道后，将细胞出现更均匀。比例尺：200微米请点击此处查看该图的放大版本。

ES / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg“/>
图3：人多能干细胞在hPCCM在明胶包被的培养皿经过13代，hPSCs，在hPCCM培养在明胶包被的培养皿，表现出高的碱性磷酸酶（AP）活性。 （A）H1和iPS细胞分别为（基质胶涂菜mTeSR1）在控制条件下培养。 （B）的 H1和iPS细胞培养于hPCCM在明胶包被的培养皿。左图：明场;右面板：碱性磷酸酶染色。 （C）H1和iPSC的被转移并进行比较几个矩阵涂菜培养。如图所示，后5代hPSCs中培养。层粘连蛋白包被的培养皿，玻连蛋白包被的培养皿，非涂覆的菜肴。 （D - E）STR分析hPSCs在培养与hPCCM控制hPSCs相比。比例尺：10微米请Ç舔此处查看该图的放大版本。

图4：人多能干细胞传播不需要的bFGF（A）中的H1细胞免疫荧光染色用抗SSEA-4，OCT-4，SOX2，NANOG，TRA-1-60，和TRA-1-81后14通道在hPCCM明胶涂层的菜肴。比例尺：10μm以下。 （B）的 RT-PCR分析被用于测量在实验和对照条件的不同细胞系的干性标记，OCT4，NANOG和REX1的表达。 （ 三）多能标记的蛋白表达水平，OCT4，SOX2，和FGF2，在hPSCs由西方印迹确定。 请点击此处查看该FIGUR的放大版本即

图5：多能性的体外分析。 （A） 的定量RT-PCR分析被用于测量的干性标记，OCT4和NANOG和和未分化的细胞在hPCCM条件下生长的表达的三胚层标志物在分化细胞中的表达。如该曲线图所示，测量值归一化至对照培养条件（OCT4）T，HNF3β中观察到的表达水平：胚层， 巢蛋白，SOX1：外胚层，AFP，GATA3：内胚层。误差棒表示平均值±SD。 （B）的 H1和iPSC系那中培养的实验条件下10次传代形成2周含有胚层（结蛋白），外胚层（TUJ1）后的胚状体，和内胚层（AFP，GATA4），通过免疫荧光染色检测。比例尺：100微米，200微米请点击此处查看该图的放大版本。

图6：HPSC两个连接基质包被的板的比较 H1和iPSC的1被转移到不同的条件下，在hPCCM和对照组的0.1％明胶。 （A）1天HPSC亚文化后。 （ 二）HPSC亚文化后2天。 （C）HPSC亚文化后5天。比例尺：10微米请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

该模型的开发是为了成功传播hPSCs，同时保持它们的特性，在人源化无饲养培养条件不加入外源重组生长因子，例如bFGF的或胰岛素，使hPSCs的操纵在人源化的微环境。外源性bFGF补充是常见和基质如基质胶或层粘连蛋白的应用是用于无饲养培养hPSCs ¹⁴是必不可少的。

此协议是简单，易于实现。然而，有些步骤是其成功的关键。最重要的步骤是从胎盘绒毛膜细胞的无菌分离。由于对胎盘的收集方法，病原体的污染风险，如支原体高。因此，细胞的分离过程中病原体检查和管理是很重要的。此外，所有的程序都必须无菌条件下进行。 conditione的集合从人胎盘细胞的培养D介质通常是很容易。然而，在HPSC文化经验是必要的，因为他们的操作有些困难。作为另一个重要的一点，使用该协议的研究者必须牢记一个事实，即需要hPSCs在此协议附件中的时间较长（36-48小时），比流行的培养方法（约24小时）。这种差异不影响hPSCs的生存能力或增殖。与此相反，hPSCs根据本协议培养生长比细胞使用常规协议培养的更稳健。

此外，该协议具有用于谱系分化的诱导应用。例如，人胚胎生殖样细胞或祖细胞可以变成这个协议的应用程序或修改有用的细胞或组织。它提供了一个更方便的平台，以确定在不同的条件下的特定外源补充。此协议的一个限制是hPCCM生产对胎盘采集的依赖性。因此，连续的人胎盘供给是必要的。

这个协议是显著，因为它提供了用于HPSC传播离体无饲养人源化环境而无需额外的外源合成的底物。掌握该技术后的未来方向可能适用于动物和来自hPSCs在hPCCM培养衍生产品的临床研究，并确定影响hPSCs的增殖和附件的机制。这是hPSCs在hPCCM成功繁殖的第一个详细的协议。值得注意的是，该协议可能会打开在干细胞研究和有关其应用和相关的研究结果进一步研究新的视野是必要的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.