Protocol
Ethiek verklaring: De menselijke placenta studie werd prospectief uitgevoerd, met goedkeuring van de Institutional Review Board voor menselijke onderzoek van de Korea University (AN09085-001). Alle experimenten werden uitgevoerd in een Clean Germ-allergene kamers faciliteit in de Korea University Medical Center. De experimenteel ontwerp en procedures met behulp hPSCs werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten
- Smeer alle cultuur gerechten met 0,1% gelatine het. Autoclaaf met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en forceps. Steriliseer chirurgische schaar, microcentrifuge buizen en gaas bij 121 ° C onder £ 15 psi gedurende meer dan 15 minuten.
- Bereide voorverwarmde 0,25% trypsine-ethyleen tetra-amine azijnzuur (trypsine-EDTA) en voorverwarmde gefiltreerd kweekmedia (DMEM) dat 20% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 g / ml streptomycin voordat u begint met de procedures.
2. Cell Isolatie van menselijke placenta
- Verkrijgen placentaweefsel, na keizersnede levering, van gezonde zwangere vrouwen die een normale of therapeutische abortus bij 7-32 weken van de zwangerschap na verkregen schriftelijke toestemming.
- Hebben de verloskundige specialist operatief aparte menselijke placenta chorionic platen (HPC) van de placenta; incubeer deze in 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 20 min, en daarna wassen met 5 ml PBS.
- Isoleer chorionvlokken van HPC met een schaar; gehakt de villi en was ze drie keer met 1 ml PBS. Na hakken, plaats de vlokken in een microfugebuis met een pipet tip; Was de monsters met 500 pi PBS en neer te pipetteren, en centrifugeer de buizen van 120 g gedurende 3 min. Wassen weefsel tweemaal met 500 ul voorverwarmde kweekmedium.
- Kweekcellen in medium op met gelatine beklede platen bij 37 ° C in 5% CO 2
- Uitwisselen van het medium om de 2-3 dagen tot de derde passage. Tijdens kweek verwijderen celresten drijvend in het kweekmedium; fibroblasten groeiende placenta zal hechten aan de plaat. Culture de fibroblast-achtige cellen afkomstig van de HPC tot de 10 ste passage en oogsten hen hESC kweken na behandeling met trypsine en mitomycine C (10 ug / ml) behandeld.
- Voor het invriezen HPC als voorraadmonsters Gebruik reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR) om te bevestigen dat HPC niet besmet met pathogenen die gewoonlijk infecteren de placenta, zoals mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,en M. capricolum) en de bacteriële soorten, Ureaplasma urealyticum, door een mycoplasma detectie kit.
- De instructies van de fabrikant om RT-PCR uit te voeren, van alle primers en mengsels in de kit. Gebruik de supernatanten van cellen die zijn gekweekt 36 dagen mycoplasma detectie. Voeg 3 ul van deze monsters aan het PCR mengsel en voer de 1 ste PCR procedure gedurende 35 cycli, elk bestaande uit 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 2 min en 72 ° C gedurende 1 min.
- Voeg voorzichtig 0,5 ul van de 1 ste PCR product aan het PCR mengsel en uitvoeren van de 2 e PCR procedure gedurende 30 cycli onder dezelfde omstandigheden als hiervoor. Analyseer de geamplificeerde producten van 1% agarosegelelektroforese; 10 pi van elk van de 1 ste en 2de PCR-producten van toepassing op de gels.
- Als HPC's blijken te zijn besmet met ziekteverwekkers, te elimineren dezeeen combinatie van antibiotica (BM-cycline), volgens de instructies van de fabrikant. Toevoegen medium dat 10 ug / ml BM-cycline 1 gedurende 3 dagen, en vervolgens behandelen van de cellen met 5 ug / ml BM-cycline 2 nog eens 4 dagen. Herhaal deze cyclus twee keer en controleer dan opnieuw voor mycoplasma besmetting.
3. Oogst menselijke placenta-afgeleide cellen geconditioneerd medium (hPCCM)
- Na uitsluiting verontreiniging behandelen gehechte cellen (85-90% confluentie, (1,5 x 10 7 cellen / fles) met mitomycine C (10 ug / ml) gedurende 2 uur en 30 minuten en waste de cellen driemaal met 10 ml PBS. Incubeer de cellen met voorverwarmd medium zonder mitomycine-C gedurende 24 uur.
- Één dag na behandeling Incubeer cellen in 10 ml medium (DMEM-F12 gesupplementeerd met 20% Knock-Out Serum Vervangende [KOSR], 0,1 mM β-mercaptoethanol, 1% NEAA, en 1% penicilline-streptomycine). Na 24 uur incubatie, oogst CM in een 15 ml conische buis enfilter het GH met een 0,22 urn spuitfilter.
- Voeg nog 10 ml nieuw medium en incubatie. Verzamel supernatanten van de kweken elke dag gedurende 1 week en vries geoogste medium bij -80 ° C. Vermijd herhaalde vries-dooi cycli.
4. Cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en de inductie van pluripotente stamcellen (iPSCs)
- Verkrijgen Menselijke embryonale stamcellijnen, H1 en H9 cellen (respectievelijk in de NIH hESC-register onder de naam WA01 en WA09 vermeld,) en geïnduceerde pluripotente stamcellen-iPSC-1: iPS (voorhuid) -1 en iPSC-2 (IISH1i- BM) vanaf het WiCell Research Institute (Madison, WI, USA). De cellen worden ontdooid en gekweekt volgens de instructies van de fabrikant.
- Voor de controlegroep, kweekcellen op Basement Membrane Matrix-beklede schalen in gebruikte voedingsvrije en serum-vrij gedefinieerde cultuurmedium bij 37 ° C en 5% CO 2. Aanvankelijk zaad 80-100 bosjes van hPSCs in 35-mm gerechten. Groeien cellen in deze gerechten tot 70-80% samenvloeiing en routinematig passage cellen voor sub-kweken eens 5-6 dagen, met behulp van mechanische of enzymatische methoden (Dispase). Was de cellen tweemaal met medium en plaat ze in een verhouding van 1: 4. Vervang het medium door vers medium elke dag.
- Voor de experimentele groepen kweekcellen in hPCCM op de vaat vooraf bekleed met 0,1% gelatine en routinematige passage eens 5 dagen, mechanisch of enzymatisch. Plate cellen bij verhoudingen in het traject van 1: 6-1: 10. hPSCs hechten aan de gelatine binnen 2 dagen na de overdracht. Vervang het medium door vers medium per dag.
5. karakterisering van menselijke pluripotente stamcellen
OPMERKING: Karakteriseren hPSCs behulp van verschillende werkwijzen, zoals alkalische fosfatase kleuring, immunocytochemie, kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR), en western blotting.
- Immunofluorescentiekleuring
- Voor immunofluorescence kleuring cultuur hPSCs en vast de cellen in 8-well slide kamers met 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 10 min; Vervolgens, de cellen permeabel gemaakt met 0,1% (v / v) Triton-X100 gedurende 15 min, en blokkeren de cellen gedurende 1 uur met 3% (v / v) normaal paardenserum in PBS met 0,1% (v / v) Tween- 20. Was PBS twee keer gedurende 5 minuten tussen elke stap.
- Incubeer de cellen met het primaire antilichaam (oktober-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, verdunning 1: 1000) O / N bij 4 ° C en met het secundaire antilichaam.
- Vóór het opzetten incubeer cellen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 5 min in het donker. Was cellen stringent driemaal gedurende 5 minuten elk droge cellen volledig in het donker. Behoud cellen in fluorescentie montage medium en observeren ze onder een fluorescentiemicroscoop.
- qRT-PCR
- Isoleer totaal RNA uit cellen met behulp van een RNeasy mini kit volgens specificaties van de fabrikant en kwantificeren van het geëxtraheerde RNA met een Nano Drop spectrofotometer. CDNA synthetiseren door toevoeging 2 ug van het totale RNA een 20-ul reactiemengsel dat oligo (dT) primers en Superscript II reverse transcriptase; volg de instructies van de fabrikant in deze procedure.
- Amplify het gesynthetiseerde cDNA met een Bio-Rad iCycler iQ-systeem, met behulp van iQ SYBR Green qPCR Master Mix en de primer sequenties in Aanvullende tabel S1 beschreven. Normaliseren van de cyclus drempelwaarden van de genen van belang die van glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH).
- Alkalische fosfatase (AP) vlekken
- Detecteren AP activiteit met de ES Cell Karakterisering Kit, volgens het protocol van de fabrikant.
- Op dag 5, zuigen de media en bevestig de hPSCs met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 12 min. Niet overfix; vaststelling cellen langer dan 2 minuten resulteert in de inactivering van alkalische fosfatase. Zuig het fixatief en spoel met 1x Rinse Buffer. Niet doenlaten putten drogen tussen de stappen.
- Voeg genoeg kleurstofoplossing aan elk putje (1 ml per putje van een 35 mm schaal) omvatten. Incubeer de platen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
- Na incubatie, wassen gerechten met 1x Rinse Buffer. Cover cellen met 1x PBS om uitdroging te voorkomen en te onderzoeken en het beeld van de gekleurde cellen met behulp van een Olympus microscoop.
- Western Blot
- Voer western blot analyse zoals eerder beschreven in 9. In het kort bepalen eiwitconcentraties in cellysaten. Los gelijke hoeveelheden eiwit op een natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gel en breng de eiwitten op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan.
- Blokkeer de blot en probe is O / N met verschillende primaire antilichamen bij 4 ° C; vervolgens de blot geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur. Was het membraan drie maal gedurende 10 min elke keer tussen incubaties. Detecteren signalen met behulp van een ECL-reagens.
- Short tandem repeat (STR) analyse
- hPSCs werden geoogst van de controle- en experimentele groepen hetzelfde punt. Genomisch DNA werd geëxtraheerd onder toepassing van een DNA Micro kit, volgens de instructies van de fabrikant.
- Amplify het genomische DNA van 16 verschillende genetische loci met de AmpF / STR PCR Amplification Kit, volgens de specificaties van de fabrikant en capillaire elektroforese werd uitgevoerd met een Genetic Analyzer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voordeel van deze HPSC vermeerderingsmethode is dat daarbij bestanddelen uitgescheiden door humane cellen. Een zeer ciritical stap in het protocol is de isolatie en de cultuur van de menselijke placenta-afgeleide cellen. Dit vereist nauwkeurige en dissectie van een precieze gedeelte van HPC plaat villi. Figuur 1 toont de procedure voor placenta afgeleide celisolatie mens. Deze werkwijze is eenvoudig en geschikt voor de isolatie van cellen, en kan gemakkelijk op 1 uur worden uitgevoerd. Zoals beschreven in figuur 2, weefsels gehecht aan de met gelatine beklede schaal en fibroblast-achtige cellen robuust gekiemde. Verwijdering van puin en vervallen weefsels tijdens de passages door trypsinisatie maakt de selectie van cellen en zorgt voor een homogene cultuur. Deze cellen kunnen worden gebruikt om geconditioneerd medium voor HPSC proliferatie van produceren na het bevestigen weinig verontreiniging. De optimale omstandigheden werden gedefinieerd als degenen die liet cellen groeien tot 80-85% confluentie, waarna the growth kunstmatig gestopt (data niet getoond).
hPSCs gekweekt op voedingscellen of synthetische matrices kunnen worden overgebracht naar gelatine beklede schalen in hPCCM. Figuur 3 laat zien dat HPSC lijnen kunnen worden gehandhaafd hPCCM op een niveau vergelijkbaar met dat van Matrigel beklede platen (figuur 3A en B). 0,1% gelatine is niet uesd voor HPSC cultuur tot nu toe. In onze omstandigheden hPSCs uitgebreid en onderhouden pluripotentie, vergelijkbaar hPSCs in de controlegroep. Om te bevestigen dat de hPCCM benaderd andere matrices voor de HPSC cultuur, hPSCs werden sub-gekweekt op laminine, vitronectine en niet-gecoate gerechten. HPSC bevestigd en groeide in hPCCM op laminin- en vitronectine gecoate gerechten. Ondanks diverse passages veel kolonies werden gedifferentieerd en niet handhaven, in tegenstelling tot de gelatine beklede group. Na overdracht naar de niet beklede schalen, werd geen hechting waargenomen voor hPSCs (figuur 3C). Om confirm dat hPSCs waren genetisch identiek aan de controlegroep na langdurige kweek in hPCCM, hPSCs gekweekt in parallel uit beide groepen werden geanalyseerd met een short tandem repeat (STR) techniek 16 genomische loci (Figuur 3D en E).
Een algemeen aanvaarde opvatting ten aanzien van de ex vivo cultuur van hPSCs is dat bFGF is nodig om zelf-vernieuwing te bevorderen. Bij afwezigheid van bFGF, hPSCs verliezen hun vermogen zelfvernieuwing en differentiatie 12,13. In de hPCCM staat, heeft hPSCs hun zelf-vernieuwing vermogen verliezen en stabiel tot expressie pluripotentie markers tijdens langdurige cultuur (Figuur 4A - C).
Het vermogen om differentiatie in de cellen van 3 kiembladen een uniek intrinsieke eigenschap van hPSCs. Iedere HPSC moet worden getest aan het behoud van dit vermogen te controleren. Zoals getoond in figuur 5, hPSCs spontaan gedifferentieerde in cels van de 3 kiembladen na 2 weken inductie bij hPCCM (figuur 5A en B). Deze gegevens geven aan dat hPCCM optimaal is voor klinische gebruik.
De bevestiging time gelatine beklede schalen in HPSC overdracht langer dan op schotels bekleed met commercieel synthetische matrices HPSC vermeerdering. Gewoonlijk cellen na bekleden met kunststof substraten bevestigd binnen een dag. Figuur 6 toont bevestiging aan 0,1% gelatine en de controleplaten. Na 24 uur sub-gekweekte hPSCs iets meer gehecht aan gelatine dan bij de controlegroep (figuur 6A). hPSCs moeten met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. Na 48 uur werden hPSCs volledig aangebracht en begon expansie op met gelatine beklede schalen (figuur 6B). Bovendien hPSCs bleek effectief en vormden verpakt kolonies groeien op dag 5 na de sub-cultuur op de gelatine (figuur 6C). Gedurende de periode bevestiging voor hPSCs, zorgvuldige treatment is belangrijk en kan overleven en zelfvernieuwing beïnvloeden. In hPCCM omstandigheden, is een 48 hr periode sterk aanbevolen voor de bevestiging van hPSCs.
Figuur 1: Cell isolatie uit humane placenta chorion villi (A) Vers placenta chorion weefsel werd gewassen in PBS na behandeling met trypsine.. (B) De vlokken werden in stukken gesneden met behulp gesteriliseerde chirurgische schaar. (C) Villi werden verschillende malen gewassen in PBS om vuil en vaten te verwijderen. (D - E) Villi werden overgebracht naar een micro-centrifugebuis, gehakt (maximum) en gewassen. (F) Weefsels werden gecentrifugeerd onder toepassing van een tafelblad centrifuge. (G) Deze werkwijze werd drie keer in PBS en tweemaal in voorverwarmde kweekmedium herhaald. (H) Cellen en weefsels werden tezamen geënt op vooraf beklede gelatine kolf en gedurende 5-7 dagen. De gehechte cellen en gekiemde.
Figuur 2: Kweken van humane placenta-afgeleide cellen (A) Ongeveer 1 week na de isolatie, menselijke placenta weefsels en cellen gehecht aan met gelatine beklede kolven en fibroblast-achtige cellen gekiemde.. (B) Na de eerste subcultuur passage, werden weefsels verwijderd. Het medium werd vervangen door vers medium elke andere dag. (C) Na de derde passage cellen zich homogener. Schaal bars. 200 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
es / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
Figuur 3:. Menselijke pluripotente stamcellen in hPCCM op gelatine gecoate gerechten Na 13 passages, hPSCs, gekweekt in hPCCM on-gelatine gecoate gerechten, tentoongesteld hoge alkalische fosfatase (AP). (A) H1 en iPSCs werden gekweekt in controle omstandigheden (mTeSR1 op Matrigel-gecoate gerechten). (B) H1 en iPSCs werden gekweekt in hPCCM on gelatine beklede schalen. Links paneel: helder veld; Rechter paneel: alkalische fosfatase vlekken. (C) H1 en iPSC werden overgebracht en gekweekt bij verschillende matrix beklede schalen ter vergelijking. Zoals getoond Na 5 doorgangen hPSCs werden gekweekt. Laminine beklede schalen, vitronectine beklede schalen, niet-beklede schalen. (D - E) STR-analyse voor hPSCs gekweekt in hPCCM vergeleken met de controle hPSCs. Schaal bars:. 10 pm Gelieve clikken hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Menselijke pluripotente stamcellen voortplanting niet nodig bFGF (A) H1 cel immunofluorescentiekleuring met antilichamen tegen SSEA-4, oktober-4, SOX2, NANOG, TRA-1-60, en TRA-1-81 na 14 passages op gelatine-gecoate gerechten in hPCCM. Schaal bar: 10 micrometer. (B) RT-PCR-analyse werd gebruikt om in de verschillende cellijnen en controlegroep condities de expressie van de stemness markers, OCT4, NANOG en REX1 meten. (C) Het eiwit expressie niveaus van pluripotentie markers, OCT4, SOX2 en FGF2, in hPSCs werden bepaald door western blots. Klik hier om een grotere versie van deze figur bekijkene.
Figuur 5: Analyse van pluripotentie in vitro. (A) qRT-PCR-analyse werd gebruikt om de expressie van de merkers stemness, OCT4 en NANOG en de expressie van drie kiemlaag markers in cellen gedifferentieerde en ongedifferentieerde cellen die in hPCCM omstandigheden te meten. Zoals getoond in de grafiek metingen werden genormaliseerd aan de expressieniveaus waargenomen in de controlegroep kweekcondities (OCT4) T, HNF3 β. Mesoderm, nestine, SOX1: ectoderm, AFP, GATA3: endoderm. De fout balken geven ± SD. (B) H1 en iPSC lijnen die gekweekt waren 10 passages onder experimentele omstandigheden gevormd embryoid lichamen na 2 weken dat mesoderm bevatten (desmine), ectoderm (TUJ1),en endoderm (AFP, GATA4), zoals gemeten door immunofluorescentie kleuring. Schaal bars. 100 pm, 200 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Vergelijking van HPSC bevestiging tussen twee-matrix gecoate platen H1 en iPSC-1 werden aan verschillende omstandigheden, 0,1% gelatine in hPCCM en controlegroep. (A) 1 dag na HPSC subcultuur. (B) 2 dagen na HPSC subcultuur. (C) 5 dagen na HPSC subcultuur. Schaal bars:. 10 um Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit model werd ontwikkeld om succesvol propageren hPSCs, met behoud van hun kenmerken, gehumaniseerde voedingsvrije kweekomstandigheden zonder de toevoeging van exogene recombinante groeifactoren zoals bFGF of insuline, waardoor het manipuleren van hPSCs in een gehumaniseerd micromilieu. Exogene bFGF suppletie is gebruikelijk en de toepassing van onderlagen zoals Matrigel of laminine essentieel voor voedingsvrije kweken van hPSCs 14.
Dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk te implementeren. Echter, een aantal stappen zijn cruciaal voor het succes ervan. De belangrijkste stap is de aseptische isolatie van chorion cellen van de placenta. Door het verzamelen werkwijzen voor de placenta, het besmettingsrisico van pathogenen zoals mycoplasma is hoog. Daarom pathogeen onderzoek en beheer van het isoleren van cellen zijn zeer belangrijk. Bovendien alle procedures moeten aseptisch worden uitgevoerd. De collectie van conditioned media van de cultuur van de menselijke placenta cellen is over het algemeen gemakkelijk. Echter, de ervaring in HPSC culturen is nodig omdat hun behandeling is enigszins moeilijk. Als een ander belangrijk punt, moet de onderzoeker met behulp van dit protocol in gedachten te houden dat het feit dat de tijd die nodig is voor de bevestiging van hPSCs in dit protocol is langer (36-48 uur) dan de populaire cultuur methoden (ongeveer 24 uur). Dit verschil heeft geen invloed op de levensvatbaarheid of de proliferatie van hPSCs. Integendeel, de groei van hPSCs cultuur gebracht dit protocol is robuuster dan cellen gekweekt onder toepassing van gebruikelijke protocollen.
Bovendien is dit protocol heeft toepassingen voor de inductie van lineage differentiatie. Bijvoorbeeld, menselijke embryonale kiem-achtige cellen of voorlopercellen kan worden omgezet in bruikbare cellen of weefsels door de toepassing of wijziging van dit protocol. Het biedt een meer toegankelijk platform om specifieke exogene supplementen in uiteenlopende omstandigheden te identificeren.Een beperking van dit protocol is de afhankelijkheid van de hPCCM productie op placenta overname. Daarom is een continue menselijke placenta voedingsinrichting.
Dit protocol is belangrijk omdat het een ex vivo voedingsvrije gehumaniseerd omgeving voor HPSC vermeerdering zonder additionele exogene synthetische substraten. Toekomstige richtingen na beheersen deze techniek kan worden toegepast op dieren en klinische studies van producten van hPSCs gekweekt in hPCCM, en de mechanismen die de proliferatie en bevestiging van hPSCs bepalen. Dit is de eerste gedetailleerde protocol voor de succesvolle voortplanting van hPSCs in hPCCM. Met name kan dit protocol nieuwe horizonten in stamcelonderzoek en verdere studies met betrekking tot de toepassingen en bijbehorende bevindingen openen zijn gerechtvaardigd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs geven geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Associate Professor, Afdeling Obstetrie en Gynaecologie, Medical College Korea University) bedanken voor het verstrekken van placenta weefsel. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies (R1211902) van de National Research Foundation Korea (NRF), de Republiek Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
