Protocol
Etikk uttalelse: The human placenta Studien ble gjennomført prospektivt, med godkjenning av Institutional Review Board for menneskelig forskning av Korea University (AN09085-001). Alle forsøkene ble utført i et rent Germ-Free Room anlegget på Korea University Medical Center. Den eksperimentelle design og prosedyrer ved hjelp hPSCs ble godkjent av Institutional Review Board of Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Utarbeidelse av Instruments, Culture Media og retter
- Coat alle kultur retter med 0,1% gelatin. Autoklaver fosfat-bufret saltvann (PBS) og tang. Sterilisere kirurgiske sakser, mikrosentrifugerør og gasbind ved 121 ° C under £ 15 psi i mer enn 15 min.
- Forberedt forvarmet 0,25% trypsin-etylenamin tetra-eddiksyre (trypsin-EDTA) og forvarmet filtrert kulturmedium (DMEM) inneholdende 20% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, og 100 g / ml streptomyci før du begynner prosedyrer.
2. Cell Isolasjon fra human placenta
- Skaff placental vev, etter keisersnitt levering, fra friske gravide kvinner som gjennomgår normal eller terapeutisk abort på 7-32 uker av svangerskapet etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke.
- Har obstetrisk spesialist kirurgisk separate human placenta chorionic plater (HPCs) fra morkaken; inkuber disse i 0,25% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 20 minutter, og vaskes deretter med 5 ml PBS.
- Isoler chorion villi fra HPCs bruker saks; hakke villi og vaske dem tre ganger med 1 ml PBS. Etter hakking, plasserer chorion villi inn i en mikro rør ved hjelp av en pipette tips; vaske prøven med 500 ul PBS ved å pipettere opp og ned, og sentrifugere rørene for 120 x g i 3 min. Vask vev to ganger med 500 mL av forvarmet kulturmedium.
- Kultur cellene i medium på gelatin-belagte plater ved 37 ° C, i 5% CO 2
- Utveksle mediet hver 2-3 dager før det tredje passering. Under kultur, fjerning av cellerester som flyter i dyrkningsmediet; voksende placenta fibroblaster vil legge til plate. Kultur fibroblast-lignende celler avledet fra HPC opp til 10. passasjen og deretter høste dem for hESC kulturer etter trypsinering og mitomycin-C (10 ug / ml) behandling.
- Før frysing HPCs som lager prøver ved å bruke revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) for å bekrefte at HPCs ikke er kontaminert med patogener som infiserer vanligvis placenta, inkludert Mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginin, M . Orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,og M. capricolum) og bakteriearter, Ureaplasma urealyticum, ved hjelp av en Mycoplasma deteksjon kit.
- Følg produsentens instruksjoner for å utføre RT-PCR, bruke alle primere og blandinger som følger med settet. Bruk supernatantene av de celler som er blitt dyrket i 36 dager for mycoplasma deteksjon. Tilsett 3 mL av disse prøvene for å PCR-blandinger og utføre prosedyren 1. PCR for 35 sykluser, hver bestående av 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 2 min, og 72 ° C i 1 min.
- Tilsett forsiktig 0,5 mL av den 1. PCR-produktet til PCR-blandingen og utføre prosedyren 2. PCR for 30 sykluser ved bruk av samme betingelser som før. Analyser forsterkede produkt til 1% agarosegelelektroforese; bruke 10 mL av hver av 1. og 2. PCR-produkter til de gels.
- Hvis det blir funnet HPCs å være forurenset med patogener, eliminere disseved hjelp av en kombinasjon av antibiotika (BM-Cyclin), etter produsentens anvisninger. Legg nytt medium inneholdende 10 ug / ml BM-Cyclin 1 i 3 dager, og deretter behandle cellene med 5 ug / ml BM-Cyclin 2 i ytterligere 4 dager. Gjenta denne syklusen to ganger og deretter sjekke for mycoplasma forurensning igjen.
3. Høsting human placenta-avledet Cells Betinget Medium (hPCCM)
- Etter unntatt forurensning, behandle festede celler (85-90% konfluens, (1,5 x 10 7 celler / kolbe) med mitomycin-C (10 ug / ml) i 2 timer og 30 min, og cellene vasket tre ganger med 10 ml PBS. Cellene inkuberes med forvarmet medium uten mitomycin-C i 24 timer.
- En dag etter behandling, inkubere cellene i 10 ml medium (DMEM-F12 supplert med 20% knock-out Serum erstatning [KOSR], 0,1 mM β-merkaptoetanol, 1% NEAA, og 1% penicillin-streptomycin). Etter 24 timers inkubasjon, høste CM i 15 ml konisk rør ogfiltrere CM bruker en 0,22 mikrometer sprøyte filter.
- Legge til ytterligere 10 ml nytt medium og inkubasjon. Samle alle supernatantene fra kulturene hver dag i en uke og fryse det høstede medium ved -80 ° C. Unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
4. Kultur av humane embryonale stamceller (hESCs) og Induksjon av Pluripotent stamceller (iPSCs)
- Skaff menneske embryonale stamcellelinjer, H1 og H9 celler (oppført i NIH hESC registeret under navnet WA01 og WA09, henholdsvis) og indusert-pluripotent stamcelle IPSC-1: iPS (forhuden) -1 og IPSC-2 (IISH1i- BM) fra WiCell Research Institute (Madison, WI, USA). Cellene må tines og kultivert følge produsentens instruksjoner.
- For kontrollgruppen, dyrke celler på basalmembranen Matrix-belagte retter i utbredt mater frie og serumfritt definert kulturmedium ved 37 ° C og i 5% CO2. I utgangspunktet frø 80-100 klumper av hPSCs jegn 35 mm-retter. Grow celler i disse rettene inntil 70-80% konfluens og rutinemessig passasje celler for sub-dyrking en gang hver 5-6 dager, ved hjelp av mekaniske eller enzymatiske metoder (dispase). Vask cellene to ganger med medium og plate dem i et forhold på 1: 4. Erstatte mediet med friskt medium hver dag.
- For de eksperimentelle gruppene, kultur celler i hPCCM på retter pre-belagt med 0,1% gelatin og utføre rutinemessig aging gang hvert 5 dager, enten mekanisk eller enzymatisk. Plate celler i forhold i området 1: 6-1: 10. hPSCs feste til gelatin innen 2 dager etter overføring. Erstatte mediet med friskt medium daglig.
5. Karakterisering av menneskelige Pluripotent stamceller
MERK: Karakter hPSCs ved hjelp av flere metoder, slik som alkalisk fosfatase farging, immunocytokjemi, kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), og western blotting.
- Immunfluorescens farging
- For immunofluorescence flekker, kultur hPSCs og fikse cellene i åtte-brønns lysbilde kamre med 4% (w / v) paraformaldehyde i 10 min; deretter, permeabiliserte cellene med 0,1% (v / v) Triton-X100 i 15 min, og blokkere cellene i 1 time med 3% (v / v) normalt hesteserum i PBS inneholdende 0,1% (v / v) Tween- 20. Vask PBS to ganger for 5 min mellom hvert trinn.
- Inkuber cellene med det primære antistoff (OKT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, fortynning på 1: 1000) O / N ved 4 ° C, og med det sekundære antistoff.
- Før påsettingen inkuberes cellene med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 min i mørke. Vask cellene strengt tre ganger for 5 min hver og tørre celler helt, i mørket. Bevar celler i fluorescens monteringsmedium og observere dem under en fluorescens mikroskop.
- QRT-PCR
- Isoler total RNA fra celler ved hjelp av en RNeasy mini kit i henhold til produsentens spesifikasjoner og kvantifisere hentet RNA ved hjelp av en Nano Drop spektrofotometer. Syntetisere cDNA ved å tilsette 2 ug av det totale RNA i en 20 pl reaksjonsblanding inneholdende oligo (dT) primere og Superscript II revers transkriptase; Følg produsentens instruksjoner i denne prosedyren.
- Forsterke syntetisert cDNA med Bio-Rad iCycler iQ system, ved hjelp av iQ SYBR Grønn qPCR Master Mix og primersekvensene beskrevet i brev Tabell S1. Normalisere syklus terskelverdier til gener av interesse for de av glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH).
- Alkalisk fosfatase (AP) farging
- Oppdage AP aktivitet ved hjelp av ES Cell Karakterisering Kit, i henhold til produsentens protokoll.
- På dag 5, aspirer media og fikse hPSCs med 4% paraformaldehyde i PBS i 12 min. Ikke overfix; feste celler i mer enn 2 minutter vil resultere i inaktivering av alkalisk fosfatase. Aspirer fiksativ og skyll med 1x Skyll Buffer. Ikkela brønnene tørke mellom trinnene.
- Legg nok flekker løsning for å dekke hver brønn (1 ml per brønn av en 35 mm rett). Inkuber platene i mørke ved RT i 15 min.
- Etter inkubasjon vaske med 1x Skyll Buffer. Cover celler med 1x PBS for å hindre uttørking og undersøke og bilde de fargede celler ved hjelp av et Olympus mikroskop.
- Western Blot
- Utføre Western blot-analyse som beskrevet tidligere i 9. Kort fortalt, bestemme proteinkonsentrasjonen i cellelysater. Løse like mengder av protein på en natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) gel og overføre proteinene på et polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
- Blokker blot og sonden det O / N med forskjellige primære antistoffer ved 4 ° C; deretter inkubere blot med HRP-konjugert sekundært antistoff i 1 time. Vask membranen tre ganger i 10 min hver gang mellom inkuberingene. Oppdage signaler ved hjelp av en ECL reagens.
- Short Tandem Repeat (STR) Analyse
- hPSCs ble høstet fra kontrollen og eksperimentelle grupper på samme passasje. Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av en DNA Micro kit, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forsterke genomisk DNA for 16 forskjellige genetiske loci bruker AmpF / STR PCR Amplification Kit, i henhold til produsentens spesifikasjoner og kapillær elektroforese ble utført ved hjelp av en genetisk Analyzer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fordel med denne hPSC forplantning metoden er at den benytter komponenter som skilles fra humane celler. En mest ciritical trinn i protokollen er isolering og kulturen av human placenta-avledede celler. Dette krever nøyaktig og disseksjon av en nøyaktig del av HPC plate villi. Figur 1 viser fremgangsmåten for human placenta-avledet celleisolasjon. Denne prosessen er enkel og praktisk for isolering av celler, og kan lett utføres innen 1 time. Som beskrevet i figur 2, vev festet til de gelatinbelagte oppvask og fibroblast-lignende celler spiret robust. Fjerning av rusk og morkne vev under passasjer av trypsinization tillater valg av celler og sikrer en homogen kultur. Disse cellene kan bli anvendt for å produsere kondisjonert medium for hPSC proliferasjon av etter å ha bekreftet en mangel på forurensning. Optimale betingelser ble definert som, de som tillot cellene å vokse til 80-85% konfluens, hvoretter the veksten ble kunstig stoppet (data ikke vist).
hPSCs dyrket på feeder-celler eller syntetiske matrikser kan overføres til gelatin-belagte retter i hPCCM. Figur 3 viser at hPSC linjer kan bli opprettholdt i hPCCM på et nivå tilsvarende den som er observert for Matrigel-belagte plater (figur 3A og B). 0,1% gelatin er ikke blitt brukt er for hPSC kultur inntil nå. I våre betingelser, hPSCs utvidet og opprettholdt pluripotency, ligner hPSCs i kontrollgruppen. For å bekrefte at hPCCM nås andre matriser for hPSC kultur, hPSCs var subdyrkes på laminin, vitronektin og ikke-belagte retter. hPSC festet og vokste i hPCCM på laminin- og Vitronectin belagt retter. Men etter flere passasjer, ble mange kolonier differensiert og ikke opprettholde, i motsetning til de på gelatin-belagt gruppe. Etter overføring til ikke-belagt retter, ble ingen vedlegg observert for hPSCs (Figur 3C). Til confirm at hPSCs var genetisk identisk med kontrollgruppen etter langvarig kultur i hPCCM, hPSCs dyrket i parallell fra begge gruppene ble analysert ved hjelp av en kort tandem gjentagelse (STR) teknikk for 16 genomiske loci (figur 3D og E).
En allment akseptert forestillingen om ex vivo kultur hPSCs er at bFGF er nødvendig for å fremme selvfornyelse. I fravær av bFGF, hPSCs mister sin selvfornyelse evne og differensiere 12,13. I hPCCM tilstand, gjorde hPSCs ikke miste sin selvfornyelse evne og stabilt uttrykte pluripotency markører i forbindelse med langvarig kultur (Figur 4A - C).
Evnen til differensiering i celler av tre bakterie lag er en unik egenskap for hPSCs. Hver hPSC bør testes for å verifisere bevaring av denne muligheten. Som vist i figur 5, hPSCs spontant differensiert i cellens av de tre bakterie lag etter to uker med induksjon i hPCCM (Figur 5A og B). Disse data indikerer at hPCCM er optimal for klinisk bruk.
Vedlegget tid på gelatinbelagte retter under hPSC overføringen er lengre enn den er på retter belagt med kommersielt syntetiske matriser for hPSC forplantning. Vanligvis celler festet innen en dag etter belegning med syntetiske substrater. Figur 6 viser feste på 0,1% gelatin, og på kontrollplater. Etter 24 timer subdyrkes hPSCs festet litt mer på gelatin enn på kontrollen (figur 6A). hPSCs skal håndteres med forsiktighet. Etter 48 timer ble hPSCs helt festet og begynte utvidelse på gelatinbelagte retter (figur 6B). Videre hPSCs syntes å vokse effektivt og dannet pakket kolonier på dag 5 etter sub-kultur på gelatin (figur 6C). I vedlegget perioden for hPSCs, forsiktig behandlingert er viktig og kan påvirke overlevelse og selvfornyelse. I hPCCM forhold, en 48 timers periode anbefales sterkt for feste av hPSCs.
Figur 1: Celle isolert fra human placenta chorion villi (A) Fersk morkake chorionic vev ble vasket i PBS etter trypsinisering.. (B) Den villi ble skåret i stykker ved hjelp av steriliserte kirurgiske saks. (C) villi ble vasket flere ganger i PBS for å fjerne rusk og fartøy. (D - E) villi ble overført til et mikro-sentrifugerør, hakket (maksimum) og vasket. (F) Vevet ble sentrifugert ved bruk av en bordsentrifuge. (G) Denne prosessen ble gjentatt tre ganger i PBS og to ganger i forvarmet kulturmediet. (H) Cells og vev ble sådd sammen på en pre-coated gelatin kolbe og inkubert i 5-7 dager. Cellene festet og spiret.
Figur 2: Dyrking av menneskelige placenta-avledet celler (A) Omtrent en uke etter isolering, menneskelige placenta vev og celler festet til gelatin-belagte kolber og fibroblast-lignende celler spiret.. (B) Etter den første subkultur passasjen, ble vev fjernet. Mediet ble erstattet med friskt medium hver annen dag. (C) Etter den tredje passering, celler dukket opp mer homogen. Skala barer:. 200 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
es / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
Figur 3:. Menneskelig pluripotente stamceller i hPCCM på gelatinbelagte retter Etter 13 passasjer, hPSCs, dyrket i hPCCM på gelatinbelagte retter, viste høy alkalisk fosfatase (AP) aktivitet. (A) H1 og iPSCs ble dyrket i kontrollforhold (mTeSR1 på Matrigel-belagte retter). (B) H1 og iPSCs ble dyrket i hPCCM på gelatinbelagte retter. Venstre panel: lyse felt; Høyre panel: alkalisk fosfatase farging. (C) H1 og IPSC ble overført og dyrket på flere matrix-belagt retter for sammenligning. Som vist, etter 5 passasjer hPSCs ble dyrket. Laminin belagt retter, Vitronectin belagt retter, ikke-belagte retter. (D - E) STR analyse for hPSCs dyrket i hPCCM sammenlignet med kontroll hPSCs. Skala barer:. 10 mikrometer Vennligst cslikke her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Menneskelig pluripotent stamcelle forplantning krever ikke bFGF (A) H1 celle immunfluorescens farging med antistoffer mot SSEA-4, oktober-4, SOX2, Nanog, TRA-1-60, og TRA-1-81 etter 14 passeringer på gelatin-belagt retter i hPCCM. Skala: 10 mikrometer. (B) RT-PCR-analyse ble brukt for å måle ekspresjonen av stemness markører, OCT4, Nanog, og REX1 i de forskjellige cellelinjer i eksperimentelle og kontrollbetingelser. (C) protein uttrykk nivåer av pluripotency markører, OCT4, SOX2, og FGF2, i hPSCs ble bestemt av vestlige blotter. Klikk her for å se en større versjon av denne figure.
Figur 5: Analyse av pluripotency in vitro. (A) QRT-PCR-analyse ble brukt for å måle ekspresjonen av stemness markører, OCT4 og Nanog og ekspresjon av tre-lags bakterie markører i differensierte celler og udifferensierte celler dyrket i hPCCM forhold. Som vist i grafen, målinger ble normalisert til uttrykket nivåer observert i kontrollgruppen dyrkningsforhold (Oct4) T, HNF3 β. Mesoderm, nestin, SOX1: ektoderm, AFP, GATA3: endoderm. De feilfelt indikerer gjennomsnitt ± SD. (B) H1 og IPSC linjer som var dyrket i 10 passasjer under eksperimentelle forhold dannet embryoid organer etter to uker som inneholdt mesoderm (desmin), ektoderm (TUJ1),og endoderm (AFP, GATA4), som målt ved immunofluorescens farging. Skala barer:. 100 mikrometer, 200 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Sammenligning av hPSC tilknytning mellom to matrix-belagte plater H1 og IPSC-1 ble overført til ulike forhold, 0,1% gelatin i hPCCM og kontrollgruppen. (A) 1 dag etter hPSC sub-kultur. (B) to dager etter hPSC sub-kultur. (C) 5 dager etter hPSC sub-kultur. Skala barer:. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne modell ble utviklet for å kunne forplante hPSCs, samtidig som deres egenskaper, humaniserte matefrie dyrkningsbetingelser uten tilsetning av eksogene rekombinante vekstfaktorer så som bFGF eller insulin, slik at manipulering av hPSCs i et humanisert mikromiljøet. Eksogent bFGF tilskudd er vanlig og anvendelse av substrater som Matrigel eller laminin er avgjørende for materen fritt dyrkning av hPSCs 14.
Denne protokollen er enkel og lett å gjennomføre. Men noen tiltak er avgjørende for suksessen. Det viktigste steget er aseptisk isolering av chorion celler fra morkaken. På grunn av de innsamlingsmetoder for placenta, er risikoen for forurensing av patogener, slik som mykoplasma høy. Derfor patogen undersøkelse og styring under isolering av celler er svært viktig. I tillegg må alle de prosedyrer utføres aseptisk. Samlingen av conditioned media fra kulturen av menneskelige placenta celler er vanligvis lett. Men erfaring i hPSC kulturer er nødvendig fordi deres håndtering er noe vanskelig. Som et annet viktig punkt, må forskeren bruker denne protokollen huske på at det faktum at den tiden som er nødvendig for å feste hPSCs i denne protokollen er lengre (36-48 timer) enn populærkulturelle metoder (ca. 24 timer). Denne forskjellen påvirker ikke levedyktighet eller spredning av hPSCs. Tvert imot, er veksten av hPSCs dyrket i henhold til denne protokollen mer robust enn den for celler dyrket under anvendelse av vanlige protokoller.
Videre har denne protokollen applikasjoner for induksjon av differensiering avstamning. For eksempel kan human embryoniske bakterie-lignende celler eller progenitorceller vendes til nyttige celler eller vev ved anvendelse eller modifikasjon av denne protokollen. Det gir en mer tilgjengelig plattform for å identifisere spesifikke eksogene kosttilskudd i ulike forhold.En begrensning av denne protokollen er avhengigheten av hPCCM produksjonen på placenta oppkjøpet. Derfor er en kontinuerlig human placenta tilførsel.
Denne protokollen er viktig fordi det gir en ex vivo mater fritt humanisert miljø for hPSC forplantning uten ekstra eksogene syntetisk underlag. Fremtidige retninger etter å mestre denne teknikken kan brukes på dyr og kliniske studier av produkter som stammer fra hPSCs dyrket i hPCCM, og å bestemme hvilke mekanismer som påvirker spredning og feste hPSCs. Dette er den første detaljert protokoll for vellykket formering av hPSCs i hPCCM. Spesielt, kan denne protokollen åpne nye horisonter i stamcelleforskning og videre studier vedrørende sine programmer og tilhørende funn er garantert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne viser ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., førsteamanuensis, Institutt for obstetrikk og gynekologi, Medical College Korea University) for å gi placenta vev. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd (R1211902) fra National Research Foundation of Korea (NRF), Republic of Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
