Protocol
Etik uttalande: Den mänskliga placenta Studien genomfördes prospektivt, med godkännande av Institutional Review Board för mänskliga forsknings av Korea University (AN09085-001). Alla experiment utfördes i en ren Germ rum anläggning vid Korea University Medical Center. Den experimentella designen och förfaranden som använder hPSCs godkändes av Institutional Review Board i Korea University Medical Center (AN12277-003).
1. Framställning av instrument, Kultur Media och Rätter
- Coat alla odlingsskålama med 0,1% gelatin. Autoklav fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och pincett. Sterilisera kirurgisk sax, mikrocentrifugrör och gasväv vid 121 ° C under 15 £ psi under mer än 15 minuter.
- Beredda förvärmda 0,25% trypsin-etylen amintetraättiksyra (trypsin-EDTA) och förvärmda filtrerade odlingsmedia (DMEM) innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 100 g / ml streptomycinnan påbörjas förfaranden.
2. Cell Isolering från Human Placenta
- Skaffa placentavävnad efter kejsarsnitt leverans, från friska gravida kvinnor som genomgår normal eller terapeutisk abort på 7-32: e graviditetsveckan efter att ha erhållit skriftligt informerat samtycke.
- Har förlossnings specialist kirurgiskt separata human placenta chorionic plattor (HPC) från moderkakan; inkubera dessa i 0,25% trypsin-EDTA vid 37 ° C under 20 minuter, och sedan tvätta med 5 ml PBS.
- Isolera korionvilli från HPC med sax; finhacka villi och tvätta dem tre gånger med 1 ml PBS. Efter malning, placera korionvilli till ett mikrofugrör med användning av en pipettspets; tvätta proverna med 500 pl PBS genom att pipettera upp och ner, och centrifugera rören för 120 xg under 3 min. Tvätta vävnader två gånger med 500 mikroliter av förvärmda odlingsmedium.
- Kulturceller i medium på gelatinbelagda plattor vid 37 ° C, i 5% CO2
- Byt ut medium var 2-3 dagar tills den tredje passagen. Under kultur, avlägsna celldebris flytande i odlingsmedium; växande moderkakan fibroblaster kommer att fästa till plattan. Kultur de fibroblastliknande celler härledda från HPC upp till 10: e passagen och sedan skörda dem för hESC odlingar efter trypsinering och mitomycin-C (10 ^ g / ml) behandling.
- Innan frysning HPC som lagerprover, använda omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för att bekräfta att HPC inte är förorenade med patogener som vanligen infekterar moderkakan, inklusive mykoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginin, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,och M. capricolum) och bakteriearter, Ureaplasma urealyticum, genom användning av en mykoplasmadetektionskit.
- Följ tillverkarens instruktioner för att utföra RT-PCR, använda alla primers och blandningar som tillhandahålls i kitet. Använd supernatanterna av de celler som har odlats i 36 dagar för mykoplasma upptäckt. Lägg 3 | il av dessa prover till de PCR-blandningarna och utföra den 1 PCR-förfarande för 35 cykler, var och en bestående av 94 ° C under 30 sek, 55 ° C under 2 min och 72 ° C under 1 minut.
- Sätt försiktigt 0,5 pl av den 1-PCR-produkten till PCR-blandningen och utföra 2 nd PCR-förfarande för 30 cykler med användning av samma betingelser som tidigare. Analysera de amplifierade produkter av en% agarosgelelektrofores; applicera 10 ul av var och en av den 1: a och 2: a PCR-produkter till gelerna.
- Om HPC befinns vara förorenade med patogener, eliminera dessamed en kombination av antibiotika (BM-cyklin), enligt tillverkarens anvisningar. Lägg till ett nytt medium innehållande 10 | j, g / ml av BM-cyklin en för 3 dagar, och sedan behandla cellerna med 5 pg / ml BM-cyklin 2 under ytterligare 4 dagar. Upprepa denna cykel två gånger och sedan kontrollera mykoplasmkontaminering igen.
3. Skörd Human Placenta-härledda celler konditionerat medium (hPCCM)
- Efter exklusive kontamination, behandla de vidhäftade celler (85-90% konfluens, (1,5 x 10 7 celler / kolv) med mitomycin-C (10 ^ g / ml) under 2 h och 30 min och tvättade cellerna tre gånger med 10 ml PBS. Inkubera cellerna med förvärmda medium utan mitomycin-C i 24 timmar.
- En dag efter behandling, inkubera celler i 10 ml medium (DMEM-F12 kompletterat med 20% Knock-Out Serum Byte [KOSR], 0,1 mM β-merkaptoetanol, 1% NEAA, och 1% penicillin-streptomycin). Efter 24 timmars inkubation, skörd CM i en 15-ml koniskt rör ochvälja CM med användning av en 0,22 fim sprutfilter.
- Lägg till ytterligare 10 ml nytt medium och inkubation. Samla alla supernatanter från kulturerna varje dag i en vecka och frysa den skördade mediet vid -80 ° C. Undvik upprepade frys-tö cykler.
4. Kultur av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och induktion av pluripotenta stamceller (iPSCs)
- Skaffa mänskliga embryonala stamcellslinjer, H1 och H9-celler (som anges i NIH hESC registret under namnet WA01 och WA09, respektive) och inducerad pluripotenta stamceller IPSC-1: iPS (förhud) -1 och iPSC-2 (IISH1i- BM) från WiCell Forskningsinstitut (Madison, Wl, USA). Celler bör tinas och odlas i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- För kontrollgruppen, odlingsceller på basalmembran Matris-belagda rätter i stor utsträckning används matarfria och serumfritt definierat odlingsmedium vid 37 ° C och i 5% CO2. Inledningsvis utsäde 80-100 klumpar av hPSCs in 35-mm skålar. Odla celler i dessa rätter tills 70-80% konfluens och rutinmässigt passage celler för under odling en gång var 5-6 dagar, med hjälp av mekaniska eller enzymatiska metoder (Dispase). Tvätta cellerna två gånger med medium och plattan dem vid ett förhållande av 1: 4. Ersätt mediet med färskt medium varje dag.
- För försöksgrupperna, kulturceller i hPCCM på rätter i förväg belagd med 0,1% gelatin och utföra rutin passage en gång var 5 dagar, antingen mekaniskt eller enzymatiskt. Plate celler vid förhållanden inom intervallet av 1: 6-1: 10. hPSCs fäster gelatinet inom två dagar efter överföringen. Ersätt mediet med färskt medium varje dag.
5. Karakterisering av mänskliga pluripotenta stamceller
OBS: karakterisera hPSCs med hjälp av flera metoder, såsom alkalisk fosfatas-färgning, immunocytokemi, Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR), och western blotting.
- Immunofluorescensfärgning
- För immunofluorescencE-färgning, kultur hPSCs och fixera cellerna i 8-brunnars glidkamrar med 4% (vikt / volym) paraformaldehyd under 10 min; sedan, permeabiliserades cellerna med 0,1% (vol / vol) Triton-X100 i 15 min, och blockerar cellerna under 1 h med 3% (volym / volym) normalt hästserum i PBS innehållande 0,1% (volym / volym) Tween- 20. Tvätta PBS två gånger under 5 minuter mellan varje steg.
- Inkubera cellerna med den primära antikroppen (oktober-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, spädning av 1: 1000) O / N vid 4 ° C och med den sekundära antikroppen.
- Innan montering, inkubera celler med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) under 5 minuter i mörker. Tvätta cellerna stringent tre gånger under 5 min vardera och torrbatterier helt i mörker. Bevara celler i fluorescensmonteringsmedium och observera dem under ett fluorescensmikroskop.
- QRT-PCR
- Isolera totalt RNA från celler med användning av ett RNeasy Mini Kit i enlighet med tillverkarens specifikationer och kvantifiera det extraherade RNA: t med användning av en Nano droppe spektrofotometer. Syntetisera cDNA genom tillsats av 2 | ig av totalt RNA till en 20-pl reaktionsblandning innehållande oligo (dT) primers och Superscript II omvänt transkriptas; Följ tillverkarens instruktioner i den här proceduren.
- Förstärk det syntetiserade cDNA med en Bio-Rad iCycler iQ systemet, med hjälp av iQ SYBR Green qPCR Master Mix och primersekvenser beskrivs i ett brev Tabell S1. Normalisera cykeltröskelvärdena för generna av intresse med de för glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH).
- Alkaliskt fosfatas (AP) färgning
- Detect AP-aktivitet med användning av ES-cellen Karakterisering Kit, enligt tillverkarens protokoll.
- På dag 5, aspirera media och fixera hPSCs med 4% paraformaldehyd i PBS under 12 minuter. Inte overfix; fastställande celler under längre tid än två minuter kommer att resultera i inaktivering av alkaliskt fosfatas. Sug fixativ och skölj med 1x Rinse Buffer. Gör intetillåta brunnar torka mellan stegen.
- Tillsätt tillräckligt färglösning för att täcka varje brunn (1 ml per brunn i en 35 mm skål). Inkubera plattorna i mörker vid RT i 15 min.
- Efter inkubation, diska med 1x Rinse Buffer. Täck celler med 1x PBS för att förhindra uttorkning och undersöka och bild de färgade cellerna med hjälp av en Olympus mikroskop.
- Western Blöt
- Utför western blot-analys såsom tidigare beskrivits i 9. I korthet, bestämma proteinkoncentrationer i cellysat. Lösa lika mängder protein på en natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) -gel och överföra proteinerna till en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran.
- Blockera blotten och sonden det O / N med olika primära antikroppar vid 4 ° C; därefter inkubera blotten med HRP-konjugerade sekundära antikroppar under 1 timme. Tvätta membranet tre gånger under 10 minuter varje gång mellan inkuberingar. Detektera signaler med användning av en ECL-reagens.
- Kort Tandem Repeat (STR) Analys
- hPSCs skördades från kontroll- och experimentgrupper i samma passage. Genomiskt DNA extraherades med användning av ett DNA-Micro-kit, enligt tillverkarens instruktioner.
- Förstärk det genomiska DNA för 16 olika genetiska lokus använder AmpF / STR PCR amplifieringskit, enligt tillverkarens specifikationer och kapillärelektrofores genomfördes med en Genetic Analyzer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fördel med denna hPSC förökning metod är att den använder komponenter utsöndrade från humana celler. En mest ciritical steg i protokollet är isolering och odling av human placenta-härledda celler. Detta kräver och noggrann dissektion från en exakt del av HPC platta villi. Figur 1 visar förfarandet för human placenta härledda cellisolering. Denna process är enkel och bekväm för isolering av celler, och kan lätt utföras inom en timme. Såsom beskrivs i figur 2, vävnader fästa vid gelatinbelagda skålen och fibroblastliknande celler grodda kraftigt. Borttagning av skräp och vissna vävnad under passager genom trypsinering möjliggör val av celler och säkerställer en homogen kultur. Dessa celler kan användas för att producera konditionerat medium för hPSC proliferation av efter att ha bekräftat avsaknad av kontaminering. Optimala förhållanden definierades som de som får cellerna att växa till 80-85% sammanflödet, varefter ee tillväxten var artificiellt stoppad (data visas ej).
hPSCs odlade på matarceller eller syntetiska matriser kan överföras till gelatinbelagda rätter i hPCCM. Figur 3 visar att hPSC linjer kan upprätthållas i hPCCM på en nivå liknande den som observerades för Matrigel-belagda plattor (Figur 3A och B). 0,1% gelatin har inte uesd för hPSC kultur fram till nu. I våra betingelser hPSCs expanderade och underhålls pluripotens, liknande hPSCs i kontrollgruppen. För att bekräfta att hPCCM åt andra matriser för hPSC kultur, hPSCs var sub-odlades på laminin, vitronektin och icke-belagda rätter. hPSC bifogas och växte i hPCCM på laminin- och vitronektin-belagda rätter. Men efter flera passager, var många kolonier differentierade och inte underhålla, till skillnad från de på gelatinbelagda grupp. Efter överföring till de icke-belagda rätter, ingen bifogad fil observerades för hPSCs (Figur 3C). Till confirm att hPSCs var genetiskt identiska med kontrollgruppen efter långtidsodling i hPCCM, hPSCs odlade parallellt från båda grupperna analyserades med användning av en kort tandemupprepning (STR) teknik för 16 genomiskt lokus (figur 3D och E).
En allmänt accepterad uppfattning om ex vivo kultur hPSCs är att bFGF behövs för att främja självförnyelse. I frånvaro av bFGF, hPSCs förlorar sin självförnyelse förmåga och differentiera 12,13. I hPCCM tillstånd, gjorde hPSCs inte förlorar sin självförnyelse förmåga och stabilt uttryckte pluripotens markörer under långtidsodling (Figur 4A - C).
Förmågan att differentiering till cellerna i tre germinallager är en unik egenskap hos hPSCs. Varje hPSC bör testas för att kontrollera att bevara denna förmåga. Såsom visas i fig 5, hPSCs spontant differentieras till cellenar av de tre germinallager efter två veckors induktion i hPCCM (figur 5A och B). Dessa data indikerar att hPCCM är optimal för klinisk användning.
Fäst tid på gelatinbelagda rätter under hPSC överföringen är längre än den är på skålar belagda med kommersiellt syntetiska matriser för hPSC förökning. Vanligtvis celler fäst inom en dag efter beläggning med syntetiska substrat. Figur 6 visar fastsättning på 0,1% gelatin och på kontrollplattorna. Efter 24 timmar under odlade hPSCs fäst något mer på gelatin än kontrollen (figur 6A). hPSCs bör hanteras med försiktighet. Efter 48 timmar var hPSCs ordentligt fastsatt och började expansion på gelatinbelagda rätter (Figur 6B). Dessutom hPSCs tycktes växa effektivt och bildade packade kolonier på dag 5 efter subkultur på gelatin (figur 6C). Vid fastsättningen perioden för hPSCs, försiktig treatment är viktigt och kan påverka överlevnad och självförnyelse. I hPCCM villkor, är en 48 timmarsperiod rekommenderas för fastsättning av hPSCs.
Figur 1: Cell isolering från human placenta korionvilli (A) Färsk placenta chorionic vävnad tvättades i PBS efter trypsinisering.. (B) villi skars i bitar med hjälp av steriliserade kirurgiska saxar. (C) Villi tvättades flera gånger i PBS för att avlägsna skräp och fartyg. (D - E) Villi överfördes till ett mikro-centrifugrör, malet (max) och tvättades. (F) Vävnader centrifugerades med hjälp av en bordscentrifug. (G) Detta förfarande upprepades tre gånger i PBS och två gånger i förvärmda odlingsmedium. (H) Celler och vävnader såddes tillsammans på en förbelagd gelatin kolv och odlades under 5-7 dagar. Cellerna bifogas och grodda.
Figur 2: Odling av humana placenta-härledda celler (A) Ungefär en vecka efter isoleringen, human placenta vävnader och celler fästa till gelatinbelagda kolvar och fibroblastliknande celler grodda.. (B) Efter den första subkultur passagen, var vävnader som tas ifrån. Mediet ersattes med färskt medium varannan dag. (C) Efter den tredje passagen, dök celler mer homogen. Skala barer:. 200 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
es / ftp_upload / 53204 / 53204fig3.jpg "/>
Figur 3:. Mänsklig pluripotenta stamceller i hPCCM på gelatinbelagda rätter Efter 13 passager, hPSCs, odlade i hPCCM på gelatinbelagda rätter, uppvisade hög alkalinfosfatas (AP) aktivitet. (A) H1 och iPSCs odlades i kontrollförhållanden (mTeSR1 på Matrigel-belagda rätter). (B) H1 och iPSCs odlades i hPCCM på gelatinbelagda rätter. Vänster panel: ljusa fält; Höger panel: alkaliskt fosfatas färgning. (C) H1 och iPSC överfördes och odlades på flera matrisbelagda rätter för jämförelse. Som visas, efter fem passager hPSCs odlades. Laminin-belagda rätter, vitronektin-belagda rätter, icke-belagda rätter. (D - E) STR analys för hPSCs odlas i hPCCM jämfört med kontroll hPSCs. Skala barer:. 10 pm Vänligen cslicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Human pluripotenta stamceller förökning kräver inte bFGF (A) H1 cell immunofluorescensfärgning med antikroppar mot SSEA-4, OKT-4, Sox2, NANOG, TRA-1-60, och TRA-1-81 efter 14 passager på gelatin-belagda rätter i hPCCM. Skala bar: 10 pm. (B) RT-PCR-analys användes för att mäta uttrycket av stemness markörer, Oct4, NANOG och Rex1 i de olika cellinjer i försöks- och kontrollbetingelser. (C) De proteinuttrycksnivåer av pluripotens markörer, Oct4, Sox2 och FGF2 i hPSCs bestämdes av western blöts. Klicka här för att se en större version av denna figure.
Figur 5: Analys av pluripotens in vitro. (A) QRT-PCR-analys användes för att mäta uttrycket av stemness markörer, Oct4 och NANOG och uttrycket av tre-GRODDBLAD markörer i differentierade celler och odifferentierade celler odlas i hPCCM betingelser. Som framgår av diagrammet, mätningar normaliserades till den uttrycksnivåer som observerades i kontrollodlingsbetingelser (Oct4) T, HNF3 β. Mesoderm, nestin, SOX1: ektoderm, AFP, GATA3: endoderm. Felstaplarna indikerar medel ± SD. (B) H1 och IPSC linjer som odlades under 10 passager under experimentella betingelser bildade embryoidkroppar efter 2 veckor som innehöll mesoderm (Desmin), ektoderm (TUJ1),och endoderm (AFP, GATA4), mätt genom immunofluorescensfärgning. Skala barer:. 100 pm, 200 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Jämförelse av hPSC fastsättning mellan två matrisbelagda plattor H1 och iPSC-1 överfördes till olika förhållanden, 0,1% gelatin i hPCCM och kontrollgruppen. (A) en dag efter hPSC subkultur. (B) 2 dagar efter hPSC subkultur. (C) 5 dagar efter hPSC subkultur. Skala barer:. 10 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna modell har utvecklats för att framgångsrikt propagera hPSCs, samtidigt som deras egenskaper, humaniserade matarfria odlingsbetingelser utan tillsats av exogena rekombinanta tillväxtfaktorer, såsom bFGF eller insulin, vilket möjliggör manipulation av hPSCs i en humaniserad mikro. Exogent bFGF tillskott är vanligt och tillämpningen av substrat såsom Matrigel eller laminin är väsentlig för matarfria odling av hPSCs 14.
Detta protokoll är enkel och lätt att genomföra. Men några steg är avgörande för dess framgång. Det viktigaste steget är aseptisk isolering av chorion celler från moderkakan. På grund av de insamlingsmetoder för moderkakan, är föroreningsrisken av patogener såsom mykoplasma hög. Därför patogen undersökning och förvaltning under isoleringen av celler är mycket viktiga. Dessutom måste alla de förfaranden som skall utföras aseptiskt. Insamlingen av conditioned media från odling av humana placentaceller är i allmänhet lätt. Det krävs dock erfarenhet av hPSC kulturer eftersom deras hantering är ganska svårt. Som en annan viktig punkt, måste forskaren använder detta protokoll tänk på att det faktum att den tid som behövs för att fästa hPSCs i detta protokoll är längre (36-48 timmar) än populära odlingsmetoder (ca 24 h). Denna skillnad påverkar inte livskraft eller spridning av hPSCs. Tvärtom, är tillväxten av hPSCs odlas enligt detta protokoll mer robust än den hos celler som odlats med användning av konventionella protokoll.
Dessutom har detta protokoll ansökningar om induktion av härstamning differentiering. Till exempel, human embryonala könsliknande celler eller stamceller kan omvandlas till användbara celler eller vävnader genom tillämpning eller ändring av detta protokoll. Det ger en mer lättillgänglig plattform för att identifiera specifika exogena kosttillskott i olika förhållanden.En begränsning av detta protokoll är beroende av hPCCM produktion placenta förvärv. Därför behövs en kontinuerlig human placenta försörjningen.
Detta protokoll är betydelsefullt eftersom det tillhandahåller en ex vivo-feeder-fria humaniserad miljö för hPSC förökning utan ytterligare exogena syntetiska substrat. Framtida riktningar efter att behärska denna teknik kan tillämpas på djur och kliniska studier av produkter som härrör från hPSCs odlade i hPCCM, och för att bestämma de mekanismer som påverkar spridningen och fastsättning hPSCs. Detta är den första detaljerat protokoll för en framgångsrik spridning av hPSCs i hPCCM. Noterbart är kanske detta protokoll öppnar nya horisonter i stamcellsforskning och ytterligare studier om dess tillämpningar och tillhörande slutsatser är motiverade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna visar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., docent, Institutionen för obstetrik och gynekologi, Medical College Korea University) för att ge placentavävnad. Detta arbete stöddes delvis av bidrag (R1211902) från National Research Foundation of Korea (NRF), Sydkorea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod. 70 (3), 837-845 (2004).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Jin, S., Yao, H., Weber, J. L., Melkoumian, Z. K., Ye, K. A synthetic, xeno-free peptide surface for expansion and directed differentiation of human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (11), e50880 (2012).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Xu, C., et al. Basic fibroblast growth factor supports undifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium. Stem Cells. 23 (3), 315-323 (2005).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Park, Y., et al. Human feeder cells can support the undifferentiated growth of human and mouse embryonic stem cells using their own basic fibroblast growth factors. Stem Cells Dev. 20 (11), 1901-1910 (2011).
- Park, Y., et al. The efficacy of human placenta as a source of the universal feeder in human and mouse pluripotent stem cell culture. Cell Reprogram. 12 (3), 315-328 (2010).
- Park, Y., et al. Undifferentiated propagation of the human embryonic stem cell lines, H1 and HSF6, on human placenta-derived feeder cells without basic fibroblast growth factor supplementation. Stem Cells Dev. 19 (11), 1713-1722 (2010).
- Seok, K., et al. Human placenta-derived feeders support prolonged undifferentiated propagation of a human embryonic stem cell line, SNUhES3: comparison with human bone marrow-derived feeders. Stem Cells Dev. 16 (3), 421-428 (2007).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Mahmood, A., Harkness, L., Schrøder, H. D., Abdallah, B. M., Kassem, M. Enhanced differentiation of stem cells mesenchymal progenitors by inhibition of TGF-beta/activin/nodal using SB-431542. J Bone Miner Res. 25 (6), 1216-1233 (2010).
