Protocol
Ethics Statement: Die menschlichen Plazenta Studie wurde prospektiv durchgeführt, mit Zustimmung des Institutional Review Board für die menschliche Erforschung der Korea University (AN09085-001). Alle Experimente wurden in einem Rein Germ Zimmer Anlage am Korea University Medical Center durchgeführt. Der Versuchsaufbau und Verfahren mit hPSCs wurden von der Institutional Review Board der Korea University Medical Center (AN12277-003) zugelassen.
1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte
- Coat alle Kulturschalen mit 0,1% Gelatine. Autoklav phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Pinzette. Sterilisieren chirurgischer Scheren, Mikrozentrifugenröhrchen, und Gaze bei 121 ° C unter £ 15 psi über 15 min.
- Vorbereitete vorgewärmten 0,25% Trypsin-Ethylenamin tetra-essigsäure (Trypsin-EDTA), und vorgewärmte filtrierten Kulturmedium (DMEM), das 20% fötales Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 g / ml streptomycin vor Beginn der Verfahren.
2. Zellisolierung aus menschlicher Plazenta
- Erhalten Plazentagewebe nach Kaiserschnitt Lieferung, die von gesunden schwangeren Frauen, die sich normal oder therapeutische Abtreibung in 7-32 Wochen der Schwangerschaft nach schriftlicher Einwilligung.
- Haben die geburtshilflichen Fach chirurgisch getrennten menschlichen Plazenta chorionic Platten (HPC) aus der Plazenta; inkubieren diese in 0,25% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 20 min und dann mit 5 ml PBS waschen.
- Isolieren Chorionzotten von HPC mit einer Schere; Blatt vor den Zotten und waschen Sie sie dreimal mit 1 ml PBS. Nach dem Zerkleinern, legen Sie die Chorionzotten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipettenspitze; waschen Sie die Proben mit 500 ul PBS durch Auf- und Abpipettieren und zentrifugieren die Rohre für 120 × g für 3 min. Zweimal waschen Gewebe mit 500 ul vorgewärmtes Kulturmedium.
- Kulturzellen in einem Medium auf Gelatine-beschichteten Platten bei 37 ° C in 5% CO 2
- Tauschen Sie das Medium alle 2-3 Tage bis zum dritten Durchgang. Während der Kultur, das Entfernen von Zelltrümmern schwebend in dem Kulturmedium; wachsenden Plazenta Fibroblasten wird an der Platte zu befestigen. Kultur die Fibroblasten-ähnliche Zellen aus dem HPC up abgeleitet, um dem 10. Durchgang und dann ernten sie für hESC-Kulturen nach Trypsinisierung und Mitomycin-C (10 ug / ml) Behandlung.
- Vor dem Einfrieren HPC als Lager Proben verwenden reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), um zu bestätigen, dass HPC nicht mit Krankheitserregern, die häufig infizieren die Plazenta, einschließlich Mycoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M verunreinigt . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,und M. capricolum), und die Bakterienspezies, Ureaplasma urealyticum, durch die Verwendung eines Mycoplasma Detection Kit.
- Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um RT-PCR durchzuführen, verwenden alle Primer und Mischungen im Kit enthalten. Benutzen Sie die Überstände der Zellen, die für 36 Tage auf Mykoplasmen Nachweis kultiviert wurden. Werden 3 ul dieser Proben an die PCR-Ansätze und führen die 1. PCR-Verfahren für 35 Zyklen, jeweils bestehend aus 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 2 min und 72ºC für 1 min.
- 0,5 ul der 1. PCR-Produkt sorgfältig in den PCR-Ansatz und führen Sie die 2. PCR-Verfahren für 30 Zyklen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. Analysieren der amplifizierten Produkte von 1% Agarose-Gelelektrophorese; Anwendung 10 ul jeweils der 1. und der 2. PCR-Produkte in den Gelen.
- Wenn HPC gefunden werden, um mit Krankheitserregern kontaminiert sind, beseitigen dieseVerwendung einer Kombination von Antibiotika (BM-Cyclin) gemß den Anweisungen des Herstellers. Fügen neue Medium, das 10 ug / ml BM-Cyclin 1 für 3 Tage, und dann Behandlung der Zellen mit 5 ug / ml BM-Cyclin 2 für weitere 4 Tage. Wiederholen Sie diesen Zyklus zweimal und dann für Mycoplasmenkontamination überprüfen erneut.
3. Ernten Menschliche Plazenta abgeleiteten Zellen konditioniertem Medium (hPCCM)
- Nach Ausschluss der Kontamination, behandeln die anhaftenden Zellen (85-90% Zusammenfluss; (1,5 x 10 7 Zellen / Kolben) mit Mitomycin-C (10 ug / ml) für 2 Stunden und 30 Minuten, und dreimal mit 10 ml gewaschen der Zellen PBS. die Zellen mit vorgewärmten Medium inkubiert ohne Mitomycin-C für 24 Stunden.
- Einen Tag nach der Behandlung, Inkubation Zellen in 10 ml Medium (DMEM-F12 mit 20% Knock-Out Serumersatz [KOSR] ergänzt, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 1% NEAA und 1% Penicillin-Streptomycin). Nach 24 Stunden Inkubation Ernte CM in einem 15 ml konischen Rohr undfiltern die CM mit einem 0,22 um Spritzenfilter.
- In weitere 10 ml der neuen Medium und Inkubation. Sammle alle Überstände der Kulturen täglich für 1 Woche und frieren das geerntete Medium bei -80 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
4. Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) und Induktion von pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)
- Erhalten Menschliche embryonale Stammzelllinien, H1 und H9-Zellen (in der NIH hESC-Registrierung unter dem Namen WA01 WA09 und aufgeführt, respectively) und induzierten pluripotenten Stammzellen iPS-1: iPS (Vorhaut) -1 und iPS-2 (IISH1i- BM) von der WiCell Research Institute (Madison, WI, USA). Zellen sollten aufgetaut und kultiviert werden nach Herstelleranweisungen.
- Für die Kontrollgruppe, die Kultur Zellen auf Basalmembranmatrix-beschichteten Schalen in weit verbreiteten feeder freien und serumfreien definierten Kulturmedium bei 37 ° C in 5% CO 2. Zunächst Saatgut 80-100 Klumpen von hPSCs in 35-mm-Gerichte. Wachsen Zellen in diesen Gerichten, bis 70-80% Konfluenz und routinemäßig Gang Zellen für Unter Kultivierung einmal alle 5-6 Tage, mit mechanischen oder enzymatischen Verfahren (Dispase). Wasche die Zellen zweimal mit Medium und der Platte sie in einem Verhältnis von 1: 4. Jeden Tag Ersetzen des Mediums mit frischem Medium.
- Für die experimentellen Gruppen, Kulturzellen in hPCCM auf Geschirr mit 0,1% Gelatine vorbeschichtet, und führen Routine Passagierung einmal alle 5 Tage, entweder mechanisch oder enzymatisch. Plattenzellen bei Verhältnissen im Bereich von 1: 6-1: 10. hPSCs heften sich an die Gelatine innerhalb von 2 Tagen nach der Übertragung. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium täglich.
5. Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzellen
HINWEIS: Charakterisieren Sie hPSCs mit verschiedenen Methoden, wie alkalische Phosphatase-Färbung, Immunzytochemie, Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) und Western Blot.
- Immunfluoreszenzfärbung
- Für immunofluorescencE-Färbung, Kultur hPSCs und fixieren Sie die Zellen in 8-well slide Kammern mit 4% (w / v) Paraformaldehyd für 10 min; Dann permeabilisierten Zellen mit 0,1% (v / v) Triton-X100 für 15 min, und blockieren die Zellen für 1 Stunde mit 3% (v / v) normales Pferdeserum in PBS, enthaltend 0,1% (v / v) Tween- 20. Zweimal waschen PBS für 5 Minuten zwischen jedem Schritt.
- Zellen, die mit dem primären Antikörper (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, Verdünnung von 1: 1000) inkubieren O / N bei 4 ° C und mit dem sekundären Antikörper.
- Vor der Montage inkubieren Zellen mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 Minuten in der Dunkelheit. Wash Zellen stringent dreimal für jeweils 5 min und Trockenzellen völlig im Dunkeln. Preserve Zellen im Fluoreszenz Eindeckmedium und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
- qRT-PCR
- Isolieren Gesamt-RNA aus Zellen unter Verwendung eines RNeasy Mini Kit nach Herstellerangaben und Quantifizierung der extrahierten RNA mit Hilfe eines Nano-Tropfen-Spektralphotometer. Synthetisieren cDNA durch Zugabe von 2 & mgr; g der Gesamt-RNA zu einer 20 ul-Reaktionsmischung, die Oligo (dT) Primern und Superscript II Reverse Transkriptase; folgen Sie den Anweisungen des Herstellers in diesem Verfahren.
- Verstärken die synthetisierte cDNA mit einem Bio-Rad iCycler iQ-System, mit iQ SYBR Green qPCR Master Mix und die in Supplemental Tabelle S1 beschriebenen Primer-Sequenzen. Normalisieren die Zyklusschwellenwerte der Gene von Interesse, die denen von Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH).
- Alkalische Phosphatase (AP) -Färbung
- Detektieren die AP-Aktivität mit Hilfe des ES-Zell-Charakterisierung Kit nach Vorschrift des Herstellers.
- Am Tag 5 aspirieren die Medien und fixieren die hPSCs mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 12 min. Sie overfix nicht; Fixierung von Zellen länger als 2 min wird bei der Inaktivierung der alkalischen Phosphatase führt. Saugen Sie das Fixierungsmittel und spülen Sie mit 1x Rinse Buffer. Unterlassen SieDie Vertiefungen dürfen zwischen den Schritten zu trocknen.
- Fügen Sie genug Farblösung in jede Vertiefung (1 ml pro Vertiefung einer 35-mm-Schale) zu decken. Platten im Dunkeln inkubieren bei RT für 15 min.
- Nach der Inkubation spülen mit 1x Rinse Buffer. Cover-Zellen mit 1x PBS, um das Trocknen zu verhindern und zu prüfen und die Bild gefärbten Zellen unter Verwendung eines Olympus-Mikroskop.
- Western Blot
- Western Blot-Analyse durchführen, wie zuvor in 9 beschrieben. Kurz gesagt, bestimmen die Proteinkonzentrationen in Zellysaten. Lösen gleiche Mengen Protein auf einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) -Gel und den Transfer der Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran.
- Blockieren Sie den Blot zu sondieren und es O / N mit unterschiedlichen primären Antikörper bei 4 ° C; anschließend Inkubation des Blots mit HRP-konjugierten Sekundärantikörper für 1 Std. Dreimal für jeweils 10 Minuten Zeit zwischen Inkubationen Waschen Sie die Membran. Erfassen Signale mit einem ECL-Reagenz.
- Short Tandem Repeat (STR) Analyse
- hPSCs wurden aus der Kontroll- und Versuchsgruppen gleichzeitig Gang, eingesammelt. Genomische DNA wurde unter Verwendung eines DNA Micro Kit extrahiert, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
- Verstärken die genomische DNA für 16 verschiedene Genloci mit der AMPF / STR PCR Amplification Kit nach den Angaben des Herstellers und Kapillarelektrophorese wurde unter Verwendung eines Genetic Analyzer.
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Representative Results
Ein Vorteil dieser HPSC Ausbreitungsverfahrens ist, dass es Bauteile aus menschlichen Zellen sekretiert verwendet. Eine am meisten ciritical Schritt im Protokoll ist die Isolierung und Kultur von menschlichen Plazenta-abgeleitete Zellen. Dies erfordert und präzise Präparation von einer genauen Teil der HPC Platte Zotten. 1 zeigt die Vorgehensweise der menschlichen Plazenta abgeleitete Zellisolierung. Dieses Verfahren ist einfach und für die Isolierung von Zellen, und kann leicht innerhalb von 1 h durchgeführt werden. Wie in Figur 2 beschrieben, Gewebe, um die Gelatine-beschichtete Schale und Fibroblasten-ähnlichen Zellen robust gekeimt befestigt. Entfernung von Schutt und abgeklungen Gewebe während Passagen durch Trypsinisierung ermöglicht die Auswahl von Zellen und gewährleistet eine homogene Kultur. Diese Zellen können verwendet werden, um konditioniertes Medium zu HPSC Proliferation nach der Bestätigung einen Mangel an Kontamination zu erzeugen. Optimale Bedingungen waren wie diejenigen, die Zellen zu 80-85% Konfluenz wachsen gelassen definiert, wonach the Wachstum wurde künstlich gestoppt (Daten nicht gezeigt).
hPSCs auf Feeder-Zellen oder synthetische Matrix kultiviert können auch Gelatine-beschichteten Schalen in hPCCM übertragen werden. 3 zeigt, dass HPSC Linien können in hPCCM auf einem Niveau ähnlich dem für Matrigel-beschichteten Platten (3A und B) beobachtet, aufrechterhalten werden. 0,1% Gelatine wurde nicht für HPSC Kultur uesd bis jetzt. In unseren Bedingungen, erweitert und gepflegt hPSCs Pluripotenz, ähnlich hPSCs in der Kontrollgruppe. Um zu bestätigen, dass die hPCCM abgerufen anderen Matrices für die HPSC Kultur wurden hPSCs auf Laminin, Vitronectin und nicht-beschichtete Platten subkultiviert. HPSC befestigt und aufgewachsen in hPCCM auf laminin- und Vitronectin-beschichteten Schalen. Nach mehreren Durchgängen, viele Kolonien wurden differenziert und nicht geltend gemacht, im Gegensatz zu denen auf der mit Gelatine beschichtete Gruppe. Nach Überführung in den nicht-beschichteten Platten wurde kein Anhaften für hPSCs (3C) festgestellt. Zu cestätigen dass hPSCs waren nach einer Langzeitkultur in hPCCM genetisch identisch mit der Kontrollgruppe, wurden hPSCs aus beiden Gruppen parallel kultiviert unter Verwendung einer kurzen Tandem Repeat (STR) Technik für 16 genomischen Loci (3D und E) analysiert.
Eine weithin akzeptierte Vorstellung in Bezug auf die Ex-vivo-Kultur von hPSCs ist, dass bFGF ist notwendig, um die Selbsterneuerung zu fördern. In Abwesenheit von bFGF, hPSCs verlieren ihre Selbsterneuerungsfähigkeit und Differenzierung 12,13. Im hPCCM Zustand hat hPSCs nicht verlieren ihr Selbsterneuerungsfähigkeit und stabil exprimiert Pluripotenzmarker während der Langzeitkultur (4A - C).
Die Fähigkeit zur Differenzierung zu Zellen von 3 Keimblätter ist ein einzigartiges charakteristisches Merkmal hPSCs. Jeder HPSC sollte getestet werden, um die Erhaltung dieser Fähigkeit zu überprüfen. Wie in 5 gezeigt, hPSCs spontan in Zellen differenzierts der 3 Keimblätter nach 2 Wochen der Induktion in hPCCM (5A und B). Diese Daten zeigen, dass hPCCM optimal ist für die klinische Verwendung.
Die Befestigung Zeit auf Gelatine-beschichteten Schalen während HPSC Transfer ist länger, als es auf mit handels synthetischen Matrizen für HPSC Ausbreitungs beschichteten Schalen. Üblicherweise Zellen innerhalb eines Tages nach der Beschichtung mit synthetischen Substraten angebracht. 6 zeigt Befestigung an 0,1% Gelatine und auf den Kontrollplatten verglichen. Nach 24 Stunden subkultiviert hPSCs etwas Gelatine gebunden als auf dem Steuer (6A). hPSCs sollten mit Vorsicht behandelt werden. Nach 48 h wurden hPSCs vollständig befestigt und begann Expansion auf Gelatine-beschichteten Schalen (6B). Ferner zeigte hPSCs effektiv und gebildet gepackten Kolonien am Tag 5 nach der Subkultur auf Gelatine (6C) wachsen. Während der Befestigung Frist hPSCs, sorgfältige treatment ist wichtig und kann das Überleben und die Selbsterneuerung zu beeinflussen. In hPCCM Bedingungen wird eine 48 Stunden-Zeitraum stark zur Befestigung hPSCs empfohlen.
Abbildung 1: Zellisolierung aus menschlicher Plazenta Chorionzotten (A) Frische Plazenta Chorion-Gewebe wurde in PBS nach Trypsinisierung gewaschen.. (B) Die Zotten wurden in Stücke mit sterilisiert chirurgische Schere geschnitten. (C) Villi wurden mehrere Male in PBS gewaschen, um Schmutz und Behälter zu entfernen. (D - E) Villi wurden zu einem Mikrozentrifugenröhrchen überführt, zerhackt (maximal) und gewaschen. (F) Die Gewebe wurden unter Verwendung einer Tischzentrifuge zentrifugiert. (G) Das Verfahren wurde dreimal in PBS und zweimal in vorgewärmtem Kulturmedium wiederholt. (H) Zellen und die Gewebe wurden zusammen auf einem vorbeschichteten Gelatine Flasche ausgesät und für 5-7 Tage inkubiert. Die Zellen befestigt und gekeimt.
Abbildung 2: Kultivierung von menschlichen Plazenta abgeleiteten Zellen (A) Etwa 1 Woche nach der Isolation, der menschlichen Plazenta Gewebe und Zellen zu Gelatine beschichtete Kolben und Fibroblasten-ähnliche Zellen gekeimt befestigt.. (B) Nach dem ersten Durchgang Subkultur wurden die Gewebe entfernt wird. Wurde das Medium durch frisches Medium jeden zweiten Tag ersetzt. (C) Nach dem dritten Durchgang, erschienen Zellen homogener. Maßstabsbalken:. 200 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Fig. 3: Menschliche pluripotente Stammzellen in hPCCM auf Gelatine-beschichteten Schalen Nach 13 Passagen hPSCs in hPCCM kultiviert auf Gelatine-beschichteten Schalen, zeigte eine hohe alkalische Phosphatase (AP) -Aktivität. (A) H1 und iPSCs waren (auf Matrigel-beschichteten Schalen mTeSR1) in Kontrollbedingungen kultiviert. (B) H1 und iPSCs wurden hPCCM auf Gelatine-beschichteten Schalen gezüchtet. Linkes Bild: Hellfeld; Rechts: der alkalischen Phosphatase-Färbung. (C) H1 und iPSC wurden übertragen und für den Vergleich von verschiedenen Matrix-beschichteten Schalen kultiviert. Wie gezeigt, nach 5 Passagen hPSCs wurden kultiviert. Laminin-beschichteten Schalen, Vitronektin-beschichteten Schalen, nicht beschichteten Gerichte. (D - E) in hPCCM STR-Analyse für hPSCs kultiviert im Vergleich zu Kontroll hPSCs. Maßstabsbalken:. 10 & mgr; m Bitte clecken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 4: Menschliche pluripotente Stammzellvermehrung nicht bFGF erfordern (A) H1 Zellimmunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen SSEA-4, OCT-4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 und TRA-1-81 nach 14 Durchgängen auf Gelatine-beschichteten Schalen in hPCCM. Maßstab: 10 & mgr; m. (B) RT-PCR-Analyse wurde verwendet, um die Expression der stemness Markern OCT4, NANOG und Rex1 in den verschiedenen Zelllinien in experimentellen und Kontrollbedingungen zu messen. (C) Die Proteinexpressionsniveaus von Pluripotenz Marker, OCT4, SOX2 und FGF2, in hPSCs wurden durch Western-Blots bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figur ansehene.
Figur 5: Analyse von Pluripotenz in vitro. (A) qRT-PCR-Analyse wurde verwendet, um die Expression der stemness Markern OCT4 und NANOG und die Expression der drei Keim Marker in differenzierten Zellen und in undifferenzierten Zellen hPCCM Bedingungen gezüchtet messen. Wie in dem Graph gezeigt, waren die Messungen normalisiert auf die in den Kontrollkulturbedingungen (OCT4) T, HNF3 β beobachtet Expressionsniveaus. Mesoderm NESTIN, SOX1 Ektoderm, AFP, GATA3: Entoderm. Die Fehlerbalken zeigen Mittelwerte ± SD. (B) H1 und iPSC Linien, die für 10 Passagen unter experimentellen Bedingungen gebildet Embryoidkörpern nach 2 Wochen, das Mesoderm enthalten (Desmin) Ektoderm (TuJ1) kultiviert wurden,und Endoderm (AFP, GATA4), wie durch Immunfluoreszenzfärbung gemessen. Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m, 200 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 6: Vergleich der HPSC Befestigung zwischen beiden Matrix-beschichteten Platten H1 und iPS-1 wurden zu verschiedenen Bedingungen übertragen werden, 0,1% Gelatine in hPCCM und Kontrollgruppe. (A) 1 Tag nach HPSC Subkultur. (B) 2 Tage nach HPSC Subkultur. (C) 5 Tage nach HPSC Subkultur. Maßstabsbalken:. 10 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Modell wurde entwickelt, um hPSCs erfolgreich zu verbreiten, unter Beibehaltung ihrer Eigenschaften, in humanisierter Einzug freien Kulturbedingungen ohne Zusatz von exogenen rekombinanten Wachstumsfaktoren, wie bFGF oder Insulin, so dass die Manipulation von hPSCs in einem humanisierten Mikroumgebung. Exogenem bFGF Ergänzung ist üblich und die Anwendung von Substraten wie Matrigel oder Laminin ist für Feeder-freien Kultur von hPSCs 14.
Dieses Protokoll ist einfach und leicht zu implementieren. Jedoch sind einige kritische Schritte zum Erfolg. Der wichtigste Schritt ist die aseptische Isolierung von Chorion-Zellen aus der Plazenta. Aufgrund der Erhebungsmethoden für die Plazenta ist das Kontaminationsrisiko von Krankheitserregern wie Mykoplasmen hoch. Daher sind pathogen Prüfung und Verwaltung bei der Isolierung von Zellen wichtig. Darüber hinaus müssen alle Verfahren aseptisch durchgeführt werden. Die Sammlung von conditioned Medium aus der Kultur von menschlichen Plazenta-Zellen ist im allgemeinen einfach. Allerdings ist Erfahrung in HPSC Kulturen notwendig, weil ihre Handhabung ist etwas schwierig. Als weiteren wichtigen Punkt muss sich der Forscher mit diesem Protokoll im Hinterkopf behalten, dass die Tatsache, dass die Zeit für die Befestigung von hPSCs in diesem Protokoll benötigt wird, ist länger (36-48 h) als Volkskultur-Methoden (etwa 24 h). Dieser Unterschied wirkt sich nicht auf die Lebensfähigkeit oder Proliferation von hPSCs. Im Gegenteil, ist das Wachstum von hPSCs entsprechend diesem Protokoll kultiviert robuster als die der Zellen unter Verwendung von herkömmlichen Protokollen kultiviert.
Außerdem hat dieses Protokoll Anwendungen für die Induktion der Differenzierung Abstammung. Zum Beispiel können menschliche embryonale Keimartigen oder Vorläuferzellen in nützliche Zellen oder Gewebe durch die Anwendung oder Abwandlung dieses Protokolls gedreht werden. Es bietet eine zugängliche Plattform, um spezifische exogene Ergänzungen in unterschiedlichsten Bedingungen zu identifizieren.Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Abhängigkeit der hPCCM Produktion Plazenta Erfassung. Daher wird ein kontinuierlicher menschlicher Plazenta Versorgung erforderlich.
Dieses Protokoll ist von Bedeutung, weil es eine ex-vivo-Zuführung freie Umgebung für humanisierte HPSC Ausbreitung ohne zusätzliche exogenen synthetischen Substraten. Zukünftige Richtungen nach Beherrschung dieser Technik könnte die Tier- und klinische Studien von Produkten aus hPSCs in hPCCM kultiviert abgeleitet angewendet werden, und die Mechanismen beeinflussen die Proliferation und Anbringung hPSCs bestimmen. Dies ist der erste detaillierte Protokoll für die erfolgreiche Vermehrung von hPSCs in hPCCM. Bemerkenswert ist, könnte dieses Protokoll neue Horizonte in der Stammzellforschung und weitere Studien in Bezug auf ihre Anwendungen und die damit verbundenen Erkenntnisse eröffnen sind gerechtfertigt.
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Disclosures
Die Autoren zeigen, keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Soon-Cheol Hong (MD, Ph.D., Associate Professor, Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, Medical College Korea University) für die Bereitstellung von Plazentagewebe danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse (R1211902) von der National Research Foundation of Korea (NRF), Republik Korea unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich Corporation | M4287 | 10 μg/ml |
| Mycoplasma detection kit | TaKaRa Bio Inc. | #6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | #354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | #05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 mg/ml |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10% |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 μg/ml |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Nano Drop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc | ||
| iQ SYBR Green qPCR Master Mix | Bio-Rad Laboratories | #170-8882AP | |
| ES Cell Characterization kit | Chemicon International, Inc., | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit | iNtRON Biotechnology | 25011 | |
| QIAamp® DNA Micro kit | Qiagen | 56304 | |
| AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems Inc. |
References
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