Abstract
Organotypiska kulturer medge rekonstitution av en 3D-miljö kritiska för cell-cellkontakt och cell-matris-interaktioner som härmar funktion och fysiologi av deras in vivo vävnads motsvarigheter. Detta exemplifieras av organotypiska hud kulturer som troget rekapitulerar epidermal differentiering och stratifiering program. Primära humana epidermala keratinocyter är genetiskt manipuleras genom retrovirus där gener kan lätt överuttryckta eller nedslagen. Dessa genetiskt modifierade keratinocyter kan sedan användas för att regenerera human epidermis i organotypic hud kulturer tillhandahåller en kraftfull modell för att studera genetiska vägar slag epidermal tillväxt, differentiering, och sjukdomsutveckling. De protokoll som presenteras här beskriver metoder för framställning av devitaliserade human hud såväl som genetiskt manipulera primära humana keratinocyter för att generera organotypic hud kulturer. Regenererad människohud kan användas i downstrEAM applikationer såsom genuttryck profilering, immunfärgning, och kromatin immunoutfällningar följt av hög genomströmning sekvensering. Således kommer genereringen av dessa genetiskt modifierade organotypiska hud kulturer tillåter bestämningen av gener som är kritiska för att bibehålla hudens homeostas.
Introduction
De mänskliga epidermis är ett skiktat epitel som ansluter till de underliggande dermis genom en extracellulär matris kallas basalmembran zone.The epidermis inte bara fungerar som en ogenomtränglig barriär för att förhindra förlusten av fukt, men också som en första försvarslinje för att skydda kroppen från främmande och giftiga ämnen 1. Det basala skiktet, som är det djupaste lagret av överhuden, innehåller den epidermala stam- och stamfaderceller som ger upphov till den differentierade avkomma som bildar resten av epidermis 2. Som epidermala prekursorceller differentierar de migrerar uppåt för att bilda det första skiktet av differentierade celler som kallas spinosus skiktet 3. I spinosus skiktet, celler slå på uttrycket av keratiner 1 och 10, som sedan ger den styrka för att motstå fysisk stress för de differentierade skikten av epidermis. Som spinous skikt celler differentierar vidare, flyttar de uppåt i överhuden till förm det granulära skiktet, som kännetecknas av bildningen av keratohyalin och lamellära granuler samt strukturella proteiner som är sammansatta under plasmamembranet. Eftersom cellerna vidare i differentieringsprocessen, proteinerna nedanför plasmamembranet är kors kopplade till varandra medan de lamellära granuler extruderas från cellerna för att bilda en lipid rik barriär kallas hornlagret 4.
Sjukdomar som involverar förändringar i epidermal tillväxt och differentiering inverkan ~ 20% av befolkningen 5. Sålunda förstå mekanismerna för denna process är av stor betydelse. Eftersom manifestation av många av dessa sjukdomar är knuten cell cell eller cell-matrix kontakt har organotypic kulturer där de mänskliga epidermis rekonstitueras i en 3D-miljö skapats 6-10. Dessa metoder involverar typiskt användningen av primära eller transformerade keratinocyter sådda på extracellulär matrix såsom devitaliserad humantdermis, Matrigel eller kollagen.
För att förstå genreglerande mekanismer som är viktiga i epidermal tillväxtfaktor och differentiering, kan keratinocyter genetiskt manipuleras genom retrovirala vektorer för att knockdown eller överuttrycka gener i 2D kultur och rekonstituerades därefter i 3D. Dessa metoder har använts i stor utsträckning för att karakterisera gener involverade i epidermal stam och stamceller självförnyelse och differentiering samt progression till neoplasi 11-21. Här är en fördjupad protokoll om hur du ändrar genuttryck i epidermala organotypiska kulturer genom användning av retrovirus tillhandahålls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Människors hud protokollet utfördes i enlighet med riktlinjerna från University of California, San Diego forsknings etikkommitté. Mänsklig hud kan erhållas från kasserade kirurgiska prover eller köpt från huden banker (hud bank finns med i Material / Utrustning Table). Platsen där huden är härledd från eller ålder givaren är inte kritisk för experimentet så länge basalmembranzonen proteiner (kollagen / laminin) i dermis inte försämras.
1. Framställning av devitaliserad mänskliga Dermis
- Vid mottagande mänsklig hud, placera vävnaden i vävnadsodling huva för att tina (~ 3-5 min). Beroende på storleken av huden, placera tinade vävnaden i en steril engångs 50 ml koniskt rör eller 125 ml flaska. Den typiska storleken av hud från huden bank är 0,75 kvadratfot.
- Fyll behållaren 75% full med 4x penicillin och streptomycin (pen / strep) i 1x PBS. Skaka kraftigt under5 min och göra sig av med vätskan. Upprepa detta steg ytterligare 3 gånger.
- Efter den sista tvätten, överför vävnaden till ett nytt rör / flaska och tillsätt färsk 4x pen / strep / PBS för att fylla 75% av behållaren. Inkubera denna blandning i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C under 2 veckor för att tillåta separation av dermis från epidermis.
- Under sterila förhållanden, använd pincett att skala bort epidermis från dermis. Dermis är helt vit medan epidermis kommer att ha färg beroende på ras av givaren (Figur 1A). Kasta epidermis enligt institutets protokoll för att hantera mänsklig vävnad.
- Placera dermis i ett rör eller flaska och tvätta den i 4x pen / strep utspätt i 1x PBS kraftig skakning (5 min tvättar för 4 gånger). Efter den sista tvättningen, överföra dermis till ett nytt rör / flaska i 4x pen / strep utspädd i 1x PBS och förvara vid 4 ° C tills den ska användas. Dermis kan lagras vid 4 ° C i upp till ett år. 2. Genetiskt Ändra Primary humana keratinocyter
- Dag 1: Dagen före transfektion, frö phoenix celler i en 6-brunnsplatta vid en densitet av 800.000 celler per brunn i komplett DMEM-medium.
- Dag 2: Dagen för transfektion, använda 3 ^ g av retrovirala vektorer per brunn. Alikvot 3 pg av retroviral vektor i en 1,5 ml rör. Använd en blandning av 100 μ; l DMEM plus 6 il transfektionsreagens för alla 3 pg av vektorn. Blanda 6 il transfektionsreagens med 100 | al DMEM i en 1,5 ml rör. (De retrovirala vektorer som används är listade i tabell utrustningen / material).
- Inkubera i 5 minuter och tillsätt 106 | il blandningen i förväg alikvoteras röret med 3 pg av retroviral vektor. Blanda och inkubera vid RT i 30 min. Lägg till detta hela blandningen droppvis till varje brunn av phoenix cellerna.
- Dag 3: Dagen efter transfektion, ta bort media från Phoenix celler och tillsätt 2 ml av färsk komplett DMEM-medium. Samma dag, utsäde primära humana keratinocyter i 6-brunnsplattor vid en densitet av 75.000 celler per brunn. Behåll keratinocyterna i keratinocyt serumfritt medium (KCSFM) med antibiotika (pen / strep).
OBS: Primära humana keratinocyter köptes. Celler kan köpas från en mängd olika leverantörer (listade i Material / utrustning tabell). - Dag 4: Harvästen media från de transfekterade phoenix cellerna, som nu innehåller viruspartiklar. Passera media genom ett 0,45 um filter med hjälp av en spruta (för att avlägsna eventuella kontaminerande phoenix celler) och placera 2 ml på keratinocyterna (pläterade på 75.000 celler / brunn föregående dag: se steg 2.3). Lägg hexadimetrinbromid (5 | ag / ml) till media för att hjälpa medla infektionsprocessen. Virustitrar är ~ 1 x 10 7 TU / ml.
- Snurra 6-brunnars plattor i en centrifug vid 200 xg under 1 h vid RT. Efter dragning, ta bort media som innehåller virus och tvätta cellerna en gång med 1x PBS innan du lägger KCSFM.
- Dag 5: Infect samma parti av keratinocyter igen som i steg 2,4.
OBS! Välj keratinocyterna använder ett läkemedel om det finns en valbar markör på retrovirusvektorn och expandera för användning i analys eller applikationer som organotypic kulturer nedströms. - Byggorganotypisk kassett från vanliga material som finns i laboratoriet eller kassetterna kan skräddarsys genom en metall verkstaden (Figur 2A - F). För att göra dessa kassetter från en 3,5 cm vävnadsodlingsplatta, använd en diatermi för att ta bort en 1,0 cm x 1,0 cm torget från mitten av locket på en 3,5 cm skålen (Figur 2A-B). Gör detta under sterila betingelser.
- Fäst fyrkantiga pinnar till botten av kassetten (locket på 3,5 cm skål) med användning av genomskinligt nagellack (figur 2C). Låt 5 min för nagellack att torka och vänd kassetten över så att den vilar på de fyrkantiga pinnar (figur 2D). Placera kassetten i en 6 cm skål.
OBS: Square pegs kan köpas från en mängd olika konst och hantverk butiker.
- Fäst fyrkantiga pinnar till botten av kassetten (locket på 3,5 cm skål) med användning av genomskinligt nagellack (figur 2C). Låt 5 min för nagellack att torka och vänd kassetten över så att den vilar på de fyrkantiga pinnar (figur 2D). Placera kassetten i en 6 cm skål.
- Förbered keratinocyt tillväxtmedium (KGM) bestående av 66% DMEM, 22% Hams F12, 100 enheter / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 10% FBS, 2,67 | ig / ml adenin, 40 ng / ml hydrokortison, 10 ng / ml koleratoxin, 4,94 | ig / ml insulin, 5 | ig / ml transferrin, 1,36 ng / ml trijodo-L-tyronin, 10 ng / ml EGF, och 10 | ig / ml ciprofloxacinhydroklorid. Filtrera media genom ett 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C tills den ska användas.
- Ta dermis ur 4x pen / strep + PBS-lösning och tvätta 2 gånger i KGM och sedan inkubera i KGM vid 37 ° C under två dagar innan användning.
- Skär dermis med hjälp av en skalpell till 1,5 cm x 1,5 cm stora bitar och lägg sedan till organotypic kassetten. Placera dermis med toppen av dermis vända uppåt. Den övre delen av dermis kommer att vara den sida som kommer i kontakt med de keratinocyter (figur 1B).
- Placera förskurna dermis på det fyrkantiga hålet i organotypiska kassetten med ovansidan av dermis vända uppåt (figur 3A).
- Vänd på hela organotypiska kassett innehållande dermis över använder pincett (Figur 3B). Tina den extracellulära matrisen lösningen på is. Använd en nål och spruta för att dra ut 100 ul av extracellulär matrix lösning per kassett. Tillsätt 5 droppar till botten av dermis (glansiga sidan) och skaka lätt att säkerställa jämn fördelning genom dermis (Figur 3B).
- Tillåt 5 minuter för kommersiella extracellulära matrislösning att helt stelna (Figur 3C). Efter stelning, använder pincett för att vända kassetten tillbaka över. Tillsätt 4 ml KGM till 6 cm skålen.
- Placera 0,5-1 miljoner genetiskt modifierade keratinocyter på de organotypiska kassetter som innehåller dermis (Figur 3D).
- Trypsinisera keratinocyter genom att placera 4 ml av 0,05% trypsin på 10 cm plattor för 5 min och avbryt reaktionen med 4 ml fullständigt DMEM-medium.
- Räkna keratinocyterna med hjälp av en hemocytometer och sedan spinn ner vid 200 xg under 5 minuter. Återsuspendera 0,5-1.000.000 celler (beroende på antalet celler tillgängliga) i 90 μl KGM och placera alla celler på dermis.
OBS: Det är viktigt att placera samma antal celler på dermis inom samma experiment för att se till att eventuella skillnader ses i tjockleken av regenere epidermis inte beror på skillnader i utgångsmobilnummer. Placering mindre än 0,5 miljoner celler på dermis kan leda till dålig skiktning och differentiering.
- Ändra KGM media på organotypiska kulturer varannan dag. Harvest vävnad 1-14 dagar efter placering av keratinocyter på dermis. Full stratifiering och differentiering av överhuden sker oftast efter dag 5.
OBS: Använd amfotropa phoenix celler odlade i fullständigt DMEM media [DMEM + 10% fetalt bovint serum (FBS) + pen / strep] för att framställa virus att infektera primära humana keratinocyter. Virala förpacknings gener som kodar för proteiner såsom gag-pol och höljet är stabilt integrerad i Phoenix cellgenomet som medger virusproduktion när den transfekteras med en retroviral vektor. Phoenix celler kan transfekteras med hög effektivitet möjliggör hög virustiter produktion. Virus som produceras av detta förpackningslinje kan också infektera ett stort antal olika däggdjursceller inkluderande människa.
3. Konfigurera Organotypiska Skin kulturer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det första steget vid generering av organotypisk human hud är att avlägsna epidermis från dermis. De två veckor inkubation av huden vid 37 ° C i 4x pen / strep / PBS bör tillåta separationen av dermis från epidermis (Figur 1A). Om separering av epidermis och dermis är svårt sedan placera vävnaden vid 37 ° C i 4x pen / strep / PBS under en vecka och sedan försöka peeling igen med hjälp av pincett.
En av nycklarna till att regenerera human epidermis på devitaliserade dermis är att se till att keratinocyterna placeras på rätt sida av dermis. Dermis har en topp och en botten. Den övre delen av dermis är den sida som kommer i kontakt med keratinocyterna in vivo såväl som i organotypiska kulturer. Den övre delen av dermis kan differentieras från botten av dermis beror på glansen hos botten (Figur 1B). Om keratinocyter placeras direkt på bottensida (glättat) av dermis, kommer överhuden ingen skillnad eller stratifiera ordentligt. Därför är det viktigt att ha toppen av dermis (icke-glansiga) uppåt i organotypic kassetten. Dermis kan placeras direkt på en organotypisk kassett (Figur 2A - F). Kassetter gjorda av vävnadsodlingsplattor bör UV steriliseras medan metall fabricerade kassetter kan autoklaveras innan dermis släpps ut på. De genetiskt modifierade keratinocyter kan sedan placeras på dermis. Keratinocyterna initialt nedsänkt i vätska eftersom de placerades på dermis återsuspenderades i KGM. Efter 24 timmar i KGM kommer att ha spritt genom dermis som tillåter keratinocyterna att utsättas för luft-vätske-gränssnittet som orsakar skiktning och differentiering till epidermis 7 (Figur 3).
RNA, kan protein, DNA / kromatin, samt vävnadssnitt skördas från organotypiska sKin kulturer som alla kan användas för en mängd olika tillämpningar nedströms. RNA kan användas för att bestämma genuttryck skillnader mellan kontroll och knockdown / överuttryck vävnad med användning av RT-QPCR, mikroarrayer, eller RNA-Seq. DNA / kromatin kan användas för DNA- eller Chip-Seq applikationer. Den regenererade huden kan monteras i oktober och frusna sektioner kan användas för immunofärgning eller hematoxylin och eosinfärgning för att bedöma vävnadsmorfologi, proteinexpression / lokalisering i kontroll- och försöksgrupper.
Ett exempel på detta visas i fig 4 med hematoxylin och eosin-färgning av ett typiskt organotypisk hudkulturen. Observera att alla fyra distinkta skikt i överhuden är utformade med skikt specifik expression av differentieringsrelaterade proteiner (Figur 4) 11,12,14,15. Detta system kan användas för att bedöma inverkan av överuttryck eller knockdown av olika gener på epidermis. Figur 5 visar regenererad epidermal vävnad som uttrycker kontroll, LacZ samt vävnad överuttryckt för SNAI2. Uttryck av SNAI2 ledde till en hämning av epidermal differentiering som noterats av avsaknaden av keratin 1 (K1) färgning samt förlust av uttryck av differentiering inducerad strukturella gener såsom TGM1 och SPRR1A (figur 5A - C) 13,22. Den epidermal tjocklek som visas i fig 4 och fig 5 kan variera inom samma prov på grund av att flera celler som ackumuleras i mitten av dermis kontra periferin när cellerna initialt placeras på dermis. Således, i mitten sektionerna tenderar att ha tjockare epidermis medan periferin tenderar att ha tunnare. För direkt jämförelse mellan olika prover samma regioner i ett avsnitt ska jämföras. Bör dock färgning för markörerna stanna konsekvent.
"Figur 1" src = "/ filer / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" />
Figur 1. Beredning av dermis från mänsklig hud. (A) Efter inkubering av den humana huden vid 37 ° C under 2 veckor, kan dermis separeras från epidermis. Tång används för att skala epidermis (brun färgad) från dermis (vit). (B) Den övre delen av dermis kan särskiljas från botten av glansighet av vävnaden. Den övre delen av dermis (den sida som naturligt kommer att möta överhuden in vivo eller när keratinocyterna seedas) är icke-glansig. Den nedre delen av dermis är glansig. Vävnaden är rosa på grund av inkubation i KGM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 2. Generation av organotypiska kassetter. (A) Använd en diatermi för att ta bort en 1,0 cm x 1,0 cm torget från mitten av locket på en 3,5 cm maträtt. (B) Ta torget från mitten av 3,5 cm skålen. (C) Använd genomskinligt nagellack att följa fyrkantiga pinnar. Låt 5 min för nagellack att torka. (D) Vänd locket över så att den vilar på torget pinnar. Kassetten är nu klar att användas. (E) Bild på en metall tillverkad organotypic kassett med dess dimensioner. (F) Bild på en metall tillverkad kassett vänt upp och ner för att visa stödpinnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Generering av organotypic hud kulturer. (A) Placera dermis med toppen av dermis (icke-glansiga sidan) vända upp på organotypic kassetten. (B) Vänd på kassetten över och lägga till Matrigel till den glansiga sidan av dermis. (C) Tillåt 5 minuter för Matrigel att stelna och sedan vända kassetten tillbaka över. (D) Lägg till genetiskt modifierade keratinocyter till dermis (0,5-1 miljoner celler återsuspenderas i 90 il KGM). Skörda vävnaden 1-14 dagar efter sådd av keratinocyterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Hematoxylin och eosin färgning av organotypic hud kulturer. Regenererad mänsklig hud innehåller både epidermis och dermis. EPIDERMär är helt skiktad och differentierad med 4 distinkta skikt. Dessa skikt innefattar odifferentierade basala lagret och 3 differentierade skikten inklusive stratum spinosum, granulosum och corneum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. immunofluorescensfärgning och genuttryck analys av genetiskt modifierade human epidermis. (A) Överuttryck av SNAI2 hämmar epidermal differentiering. Färgning differentiering protein keratin 1 (K1) visas i grönt och kärnor markeras i blått (Hoechst). (B) RT-QPCR analys på mRNA-nivåer av SNAI2 i kontroll LacZ och SNAI2 överuttrycker vävnad. Felstaplar = standardavvikelse, n = 3. (C) RT-QPCR analys på mRNAnivåer differentiering avskrifter KRT1, TGM1 och SPRR1A i kontroll LacZ och SNAI2 överuttrycker vävnad. Felstaplar = SD, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetisk manipulation i mänsklig hud organotypiska kulturer erbjuder många fördelar gemensamt studerat 2D odlade celler samt musmodeller. 2D kulturer saknar de tredimensionella cell-cell- och cell-extracellulär matrix-interaktioner funna i intakta vävnader och organ. Nyligen genomförda studier har också funnit enorma skillnader mellan 2D- och 3D-odlade hud cancerceller med 3D odlade celler som visar mycket mer genuttryck likheter med primära humana hudtumörer 16. Mänskliga organotypiska hud kulturer har också flera fördelar jämfört med musmodeller. Musmodeller är tidskrävande och dyrt att generera samt flera anmärkningsvärda skillnader mellan människa och mus hud. Dessa inkluderar olika vävnadsomsättningshastigheter såväl som tjockleken av epidermis mellan murina och humana epidermis 8. Med ny teknik framväxande såsom crispr-CAS, kan specifika gener ändras / muteras för att modellera mänskliga hudsjukdomar använder organotypisk hud cultures 23. Vidare kan gener levereras eller slås ned i dessa celler genom en stor mängd metoder förutom den retrovirala genöverföringen beskrivs här. Så länge det är robust leverans genom hög transduktionseffektiviteten eller läkemedelsselektion, kan användas i metoden. Dessa leveransmetoder innefattar nucleofection av siRNA, lentiviral, adenoassocierad virus och adenovirus 11,12,24-26.
De organotypic hud kulturer kan modifieras genom tillsats av olika celltyper till systemet. Exempelvis kan normala eller genetiskt förändrade humanfibroblaster sättas till de devitaliserad dermis för att studera mesenkymala och epitelial överhörning. Immunceller kan också tillsättas till dermis för att studera inflammatoriska responsen på störningar i huden. En begränsning på systemet är att det deskvamation process som sker in vivo inte förekommer i organotypiska kulturer. Detta förhindrar användningen av dessa kulturer för långsiktig och mest analysgörs mellan 1-14 dagar efter sådd av hudceller. För långsiktiga analyser kan organotypic kulturer ympas på ryggen av nedsatt immunförsvar möss 17,27.
Odlings huden organotypiska presenteras här är unik i det att den utnyttjar intakta devitaliserade human hud som är det naturliga substratet av epidermis in vivo medan de flesta andra system använder kollagen eller Matrigel som substratet 28. Inställning av organotypiska hud kulturer med hjälp av substrat såsom Matrigel ger tunnare och mindre robust skiktning av epidermis i vår erfarenhet. Dermis innehåller källaren membran zon proteiner inkluderande laminin och kollagen som gör att epidermalceller att fästa, föröka sig, differentiera och stratifiera 29. Användning av dermis möjliggör för generering av epidermis som härmar deras in vivo motsvarighet. Således kan organotypic hud kulturer vara oerhört värdefullt i toxikologiska och farmakologiska studies i de fall där djurförsök inte är tillåtna (kosmetikaindustrin) 30.
Använda devitaliserad dermis också kommer med sina egna nackdelar eftersom tjockleken av dermis mellan olika givare eller ens inom samma donator kan variera. Epidermalceller odlas på tjocka dermis tenderar att inte föröka sig och skapa lika tjock av epidermis som celler odlade på tunnare dermis. Därför är det viktigt att välja liknande tjocklek dermis när du ställer in de experiment som jämför flera prover. En annan kritisk parameter är att ympa samma antal epidermalceller när man jämför olika grupper så att eventuella skillnader sett inte beror på skillnader i ursprungliga antalet celler seedade.
Sammanfattningsvis kan den organotypic hudkulturen tjäna som en avancerad och effektiv in vitro-modell för validering molekylära vägar på ett mer fysiologiskt sammanhang, vilket i slutändan kommer att accelerera förståelsen av genreglerande mechanismer som är viktiga för epidermal tillväxt och differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete var supportedby American Cancer Society Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) och CIRM Basic Biology Award (RB4-05779).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A.
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E.
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A.
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V.
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
