Abstract
תרבויות organotypic לאפשר הכינון מחדש של סביבת 3D קריטית עבור אינטראקציות מגע תאי תאים ותא-מטריצה אשר מחקה את הפונקציה ופיזיולוגיה של עמיתיהם בvivo רקמה. זה בא לידי ביטוי על ידי תרבויות עור organotypic שנאמנות מסכמת את בידול אפידרמיס ותכנית ריבוד. קרטינוציטים אפידרמיס אנושיים עיקריים הם גנטי מניפולציה באמצעות רטרווירוסים שבו ניתן ביטוי יתר בקלות או הפילו את הגנים. קרטינוציטים מהונדסים גנטי אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להתחדש האפידרמיס אנושי בתרבויות עור organotypic מתן מודל רב עוצמה כדי לחקור מסלולים גנטיים צמיחה להשפיע אפידרמיס, בידול, והתקדמות מחלה. הפרוטוקולים שהוצגו כאן לתאר שיטות להכנת עור אנושי חסר חיוניות, כמו גם לבחינה גנטית לתפעל קרטינוציטים אדם ראשיים, במטרה ליצור תרבויות עור organotypic. עור אדם מחדש ניתן להשתמש בdownstrיישומי EAM כגון פרופיל ביטוי גנים, immunostaining, וimmunoprecipitations הכרומטין אחרי רצף תפוקה גבוה. כך, דור של תרבויות עור organotypic אלה מהונדסים גנטיים יאפשר הקביעה של גנים שהם קריטיים לשמירה על הומאוסטזיס עור.
Introduction
האפידרמיס האנושי הוא אפיתל מרובדת המתחבר לדרמיס הבסיס באמצעות מטריקס הידוע כהאפידרמיס zone.The הקרום במרתף לא רק משמש כמחסום בלתי חדיר כדי למנוע אובדן הלחות, אלא גם כקו הגנה ראשון כדי להגן על גוף מחומרים זרים ורעילים 1. שכבת הבסיס, המהווה את השכבה העמוקה ביותר של האפידרמיס, מכילה תאי גזע אפידרמיס ואב שיוצרים צאצאים המובחנים שמהווים את שאר האפידרמיס 2. כתאי אפידרמיס להבדיל הם נודדים כלפי מעלה כדי ליצור את השכבה הראשונה של תאים מובחנים הידועים כשכבת spinous 3. בשכבת spinous, תאים להפעיל את הביטוי של keratins 1 ו -10, אשר לאחר מכן לספק הכוח לעמוד בפני לחץ פיזי לשכבות מובחנות של האפידרמיס. כתאי שכבת spinous נוספים להבדיל, הם עוברים כלפי מעלה באפידרמיס למ 'שכבת גרגרים אשר מאופיינת על ידי ההיווצרות של גרגרי keratohyalin ושבשבת כמו גם חלבונים מבניים שהם התאספו מתחת קרום הפלזמה. כמו התאים להמשיך בתהליך ההתמיינות, החלבונים מתחת קרום הפלזמה הם צלב מקושרים זה לזה בזמן שגרגרי שבשבת נמתחים מהתאים ליצירת שומנים מחסום עשיר נקרא השכבה קרנית 4.
מחלות שקשורים לשינויים בצמיחת אפידרמיס והשפעת בידול ~ 20% מהאוכלוסייה 5. לפיכך, הבנת המנגנונים של תהליך זה היא בעל חשיבות רבה. מאז גילוים של רבים ממחלות אלה מותנה קשר תאי תאים או תא-מטריקס, תרבויות organotypic בי האפידרמיס האנושי מחדש בסביבת 3D נוצרו 6-10. שיטות אלו בדרך כלל כרוכות בשימוש בקרטינוציטים ראשוניים או הפכו זרע על מטריקס כגון אדם חסר חיוניותדרמיס, Matrigel, או קולגן.
כדי להבין את מנגנוני רגולציה גן שהם חשובים בגדילה באפידרמיס ובידול, ניתן להשפיע קרטינוציטים גנטיים באמצעות וקטורי retroviral למציאה או ביטוי יתר הגנים בתרבות 2D ולאחר מכן מחדש ב3D. שיטות אלה היו בשימוש נרחב כדי לאפיין את הגנים מעורבים בגזע אפידרמיס והתחדשות עצמית תא אב ובידול, כמו גם התקדמות לגידולים 11-21. כאן, פרוטוקול מעמיק על איך לשנות ביטוי גנים בתרבויות organotypic אפידרמיס באמצעות רטרווירוסים מסופק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול העור האנושי נערך בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קליפורניה, ועדת האתיקה של המחקר בסן דייגו. ניתן להשיג עור אדם מדגימות כירורגית שהושלכו או שנרכש מבנקי עור (בנק עור נזכר בטבלת חומר / ציוד). המיקום שבו העור נגזר מאו גיל של התורם אינו קריטי לניסוי עוד חלבוני אזור קרום במרתף (קולגן / laminin) בדרמיס אינם מושפלים.
1. הכנת עור אדם חסר חיוניות
- עם קבלת עור אנושי, הנח את הרקמה בשכונה תרביות הרקמה להפשיר (~ 3-5 דקות). בהתאם לגודל של העור, רקמות למקם מופשרים בצינור סטרילי חד פעמי 50 מיליליטר חרוטי או 125 מיליליטר בקבוק. הגודל האופייני של עור מבנק העור הוא 0.75 מ"ר.
- מלא את המכל 75% מלאים עם פניצילין וסטרפטומיצין 4x (עט / סטרפטוקוקוס) ב1x PBS. לנער במרץ לדקות ו -5 להיפטר מהנוזלים. חזור על פעולה זו 3 פעמים יותר.
- לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הרקמה לצינור / בקבוק חדש ולהוסיף 4x הטרי עט / סטרפטוקוקוס / PBS למלא 75% מהמכל. דגירה את התערובת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות כדי לאפשר את ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס.
- בתנאים סטריליים, להשתמש במלקחיים כדי לקלף את העור מהעור. הדרמיס הוא לבן לחלוטין תוך האפידרמיס יהיה צביעה בהתאם לגזע של התורם (איור 1 א). מחק את האפידרמיס על פי הפרוטוקול של המוסד לטיפול ברקמות אנושיות.
- מניחים את העור בצינור או בקבוק ולשטוף אותו בעט / סטרפטוקוקוס 4x המדולל ב1x PBS עם טלטול נמרץ (5 שטיפות דקות ל4 פעמים). לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הדרמיס לצינור / בקבוק חדש ב4x העט / סטרפטוקוקוס בדילול המלא 1x PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. ניתן לאחסן הדרמיס על 4 מעלות צלזיוס עד שנה. 2. גנטי שינוי קרטינוציטים
- יום 1: היום לפני transfection, תאי זרע פניקס בצלחת 6-גם בצפיפות של 800,000 תאים לכל גם בתקשורת DMEM מלאה.
- יום 2: יום transfection, להשתמש בכל טוב 3 מיקרוגרם של וקטורי retroviral. Aliquot 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral לתוך צינור 1.5 מיליליטר. להשתמש בשילוב של 100 μ; L DMEM בתוספת 6 μl של מגיב transfection לכל 3 מיקרוגרם של וקטור. מערבבים 6 μl של מגיב transfection עם 100 DMEM μl בצינור 1.5 מיליליטר. (וקטורי retroviral המשמשים מפורטים בטבלת ציוד / חומרים).
- דגירה של 5 דקות ומוסיפים את תערובת 106 μl לתוך הצינור מראש aliquoted המכיל 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral. לערבב דגירה על RT למשך 30 דקות. להוסיף כל dropwise את התערובת היטב בכל תאי הפניקס.
- יום 3: היום לאחר transfection, להסיר את המדיה מתאי הפניקס ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה הטרי. באותו היום, זרע קרטינוציטים אדם עיקריים ל6-גם צלחות בצפיפות של 75,000 תאים בכל טוב. לשמור על קרטינוציטים במדיום סרום keratinocyte חופשי (KCSFM) עם אנטיביוטיקה (עט / סטרפטוקוקוס).
הערה: קרטינוציטים אדם יסודיים נרכשו. ניתן לרכוש תאים ממגוון רחב של ספקים (המפורט בטבלת חומר / ציוד). - יום 4: הריבשילו התקשורת מתאי פניקס transfected, אשר כעת מכילים חלקיקים נגיפיים. להעביר את התקשורת באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק (כדי להסיר את כל תאי פניקס זיהום) ומקום 2 מיליליטר על קרטינוציטים (מצופים ב75,000 תאים / גם היום קודם לכן: ראה שלב 2.3). להוסיף ברומיד hexadimethrine (5 מיקרוגרם / מיליליטר) לתקשורת כדי לעזור לתווך בתהליך ההדבקה. titers ויראלי הם ~ 1 x 10 7 TU / מיליליטר.
- ספין 6 הצלחות גם בצנטריפוגה XG 200 עבור שעה 1 ב RT. אחרי הספין, להסיר את המדיה המכילה וירוס ולשטוף את התאים פעם עם PBS 1x לפני הוספת KCSFM.
- יום 5: להדביק אותו אצווה של קרטינוציטים שוב כמו בשלב 2.4.
הערה: בחר את קרטינוציטים באמצעות תרופה אם יש סמן לבחירה על וקטור retroviral ולהרחיב לשימוש בניתוח או יישומים כגון תרבויות organotypic במורד הזרם. - לבנותקלטת organotypic מחומרים נפוצים שנמצאו במעבדה או הקלטות יכולה להיות מותאמת אישית עשתה דרך חנות ייצור מתכת (איור 2 א - ו). כדי להפוך קלטות אלה מצלחת תרבית רקמת 3.5 סנטימטר, להשתמש כויה להסיר כיכר 1.0 סנטימטרים X 1.0 סנטימטר ממרכז המכסה של צלחת 3.5 סנטימטר (איור 2 א-ב). האם זה בתנאים סטריליים.
- צרף יתדות כיכר לחלק התחתון של הקלטת (מכסה של 3.5 מנה סנטימטרים) באמצעות פולני ברור מסמר (איור 2 ג). לאפשר 5 דקות ללק להתייבש ולהפוך את הקלטת על כך שהוא מונח על היתדות מרובעות (איור 2 ד). מניחים את הקלטת לתוך צלחת 6 סנטימטר.
הערה: כיכר יתדות ניתן לרכוש ממגוון רחב של אומנויות ומלאכות חנויות.
- צרף יתדות כיכר לחלק התחתון של הקלטת (מכסה של 3.5 מנה סנטימטרים) באמצעות פולני ברור מסמר (איור 2 ג). לאפשר 5 דקות ללק להתייבש ולהפוך את הקלטת על כך שהוא מונח על היתדות מרובעות (איור 2 ד). מניחים את הקלטת לתוך צלחת 6 סנטימטר.
- הכן מדיום גידול keratinocyte (קג"מ) היווה 66% DMEM, 22% F12 של בשר חזיר, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 10% FBS, 2.67 מיקרוגרם / מיליליטר אדנין, 40 ng / ml הידרוקורטיזון, 10 רעל ng / ml כולרה, 4.94 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 1.36 ng / ml Triiodo-L-thyronine, 10 ng / ml EGF, ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר hydrochloride ציפרופלוקסצין. סנן את התקשורת דרך מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
- קח את הדרמיס מתוך העט / סטרפטוקוקוס 4x + פתרון PBS ולשטוף 2 פעמים בקג"מ ואז דגירה בקג"מ ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני השימוש.
- חותך את העור באמצעות אזמל 1.5 סנטימטרים X 1.5 סנטימטר חתיכות בגודל ולאחר מכן למקם על גבי קלטת organotypic. מניחים את העור עם החלק העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה. חלקיו העליונים של הדרמיס יהיה הצד שבא במגע עם קרטינוציטים (איור 1).
- מניחים את העור החתוך מראש על החור המרובע של קלטת organotypic עם הצד העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה (איור 3 א).
- הפוך את הקלטת כל organotypic מכילה הדרמיס על שימוש במלקחיים (איור 3). להפשיר את פתרון מטריקס על קרח. שימוש במחט ומזרק לצייר מתוך פתרון מטריקס לקלטת 100 μl. הוסף 5 טיפות לתחתית של הדרמיס (צד מבריק) ולנער מעט כדי להבטיח אפילו הפצה ברחבי הדרמיס (איור 3).
- לאפשר 5 דקות לפתרון מטריצה סלולרית נוסף המסחרי לביסוס לחלוטין (איור 3 ג). לאחר התמצקות, להשתמש במלקחיים כדי להעיף את הקלטת בחזרה מעל. הוסף 4 מיליליטר של קג"מ לצלחת 6 סנטימטר.
- הנח 0.5-1,000,000 קרטינוציטים מהונדסים גנטי על קלטות organotypic מכילות הדרמיס (איור 3D).
- Trypsinize קרטינוציטים על ידי הצבת 4 מיליליטר של 0.05% טריפסין על צלחות 10 סנטימטרים למשך 5 דקות ולהרוות עם 4 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה.
- רוזן קרטינוציטים באמצעות hemocytometer ואז ספין למטה XG 200 במשך 5 דקות. תאי .5-1,000,000 גלולים (תלוי במספר התאים הזמינים) ב -90 μl של קג"מ ולמקם את כל התאים על גבי העור.
הערה: חשוב לשים את אותו המספר של תאים בדרמיס באותו הניסוי על מנת להבטיח כי כל הבדלים ראו בעובי של האפידרמיס מחדש הוא לא בשל הבדלים במתחילים מספר תא. הצבה פחות מ -0.5 מיליון תאים בדרמיס יכול להוביל לריבוד ובידול העניים.
- שינוי תקשורת קג"מ בתרבויות organotypic בכל יום אחר. רקמת קציר 1-14 ימים לאחר ההנפקה של קרטינוציטים בדרמיס. ריבוד ובידול מלא של האפידרמיס מתרחש בדרך כלל לאחר היום 5.
הערה: תאי פניקס amphotropic שימוש גדלו בתקשורת DMEM המלאה [DMEM + 10% בסרום שור (FBS) + עט / סטרפטוקוקוס העוברי] לייצר וירוסים להדביק קרטינוציטים אדם עיקריים. גני האריזה ויראלי, מקודדי חלבונים כגון איסור פרסום-Pol ומעטפה משולבים ביציבות לתוך הגנום של תאי הפניקס המאפשר לייצור וירוס כאשר transfected עם וקטור retroviral. ניתן transfected תאי פניקס עם יעילות גבוהה המאפשרת ייצור כייל נגיף גבוה. וירוס המופק מקו אריזה זה יכול להדביק גם מגוון גדול של תאי יונקים, כולל אדם.
3. הגדרת תרבויות עור Organotypic
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצעד הראשון ביצירת העור אנושי organotypic הוא להסיר את העור מהעור. הדגירה של השבועיים של העור על 37 מעלות צלזיוס ב4x העט / סטרפטוקוקוס / PBS צריכה לאפשר ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס (איור 1 א). אם מפריד את האפידרמיס והדרמיס הוא קשה ואז למקם את הרקמה על 37 מעלות צלזיוס בעט / סטרפטוקוקוס 4x / PBS לעוד שבוע ולאחר מכן נסה שוב קילוף באמצעות מלקחיים.
אחד המפתחות להתחדשות עור אנושי בדרמיס חסר חיוניות הוא להבטיח כי קרטינוציטים ממוקמים בצד הנכון של הדרמיס. יש הדרמיס עליון ותחתון. חלקיו העליונים של הדרמיס הוא הצד שבא במגע עם קרטינוציטים in vivo, כמו גם בתרבויות organotypic. חלקיו העליונים של הדרמיס יכול להיות מובחן מהחלק התחתון של הדרמיס בשל הברק של התחתית (איור 1). אם קרטינוציטים ממוקמים ישירות על גבי התחתיתצד (מבריק) של הדרמיס, האפידרמיס לא יבדיל או ריבוד כראוי. לפיכך, חשוב שיהיו לי העליון של הדרמיס (לא מבריק) פונה כלפי מעלה בקלטת organotypic. ניתן להציב הדרמיס ישירות על גבי קלטת organotypic (איור 2 א - ו). קלטות עשויות מצלחות תרבית רקמה צריכה להיות UV מעוקר ואילו יכולים להיות autoclaved קלטות מפוברקות מתכת לפני הדרמיס שיוצבו על. אז יכולים להיות ממוקמים קרטינוציטים המהונדסים גנטי על העור. קרטינוציטים תחילה שקועים בנוזל שכן הם הונחו על הדרמיס resuspended בקג"מ. לאחר 24 שעות קג"מ יהיה מתפזר דרך העור המאפשר קרטינוציטים להיחשף לממשק אוויר הנוזלי שגורם הריבוד ובידול לתוך האפידרמיס 7 (איור 3).
RNA, חלבונים, DNA / הכרומטין, כמו גם קטעי רקמה ניתן לקצור משל organotypicתרבויות קרובי משפחה שכולם יכול להיות בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם. RNA יכול לשמש כדי לקבוע הבדלי ביטוי גנים בין שליטה ומציאה / רקמת ביטוי יתר באמצעות RT-QPCR, microarrays, או RNA-Seq. DNA / הכרומטין יכול לשמש ליישומי ה- DNA או שבב Seq. העור מחדש יכול להיות מותקן ב אוקטובר וחתכים קפואים יכולים לשמש לאימונו-מכתים או hematoxylin והכתים eosin להעריך מורפולוגיה רקמה, ביטוי חלבון / לוקליזציה בשליטה וקבוצות ניסוי.
דוגמא לכך היא שמוצגת באיור 4 עם כתמי hematoxylin ו eosin של תרבות עור organotypic טיפוסית. שים לב שכל ארבע השכבות השונות של העור נוצרות עם ביטוי ספציפי שכבה של חלבונים הקשורים בידול (איור 4) 11,12,14,15. מערכת זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של ביטוי יתר או מציאה של גנים שונים בעור. איור 5 תערוכות רקמת אפידרמיס מחדש שמבטאת שליטה, lacZ כמו גם רקמת ביטוי יתר לSNAI2. ביטוי יתר של SNAI2 הוביל לעיכוב של בידול אפידרמיס כאמור על ידי חוסר 1 צביעת קרטין (K1), כמו גם אובדן של ביטוי של גני הבידול מושרה מבניים כגון TGM1 וSPRR1A (איור 5 א - ג) 13,22. עובי אפידרמיס מוצג באיור 4 ואיור 5 עשוי להשתנות בתוך המדגם זהה בשל יותר תאים מצטברים באמצע דרמיס לעומת הפריפריה כאשר התאים היו בתחילה הניחו על העור. כך, סעיפי האמצע נוטים להיות עבה יותר ואילו האפידרמיס הפריפריה נוטה להיות דק יותר. לשם השוואה ישירה בין מדגמים שונים אותו האזורים של סעיף צריכים להיות בהשוואה. עם זאת, הצביעה לסמנים צריכה להישאר עקבית.
src = /> "/ קבצים / ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg" "איור 1"
הכנת איור 1. של הדרמיס מעור אדם. (א) לאחר הדגירה של העור האנושי על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות, יכול להיות מופרד מהדרמיס לאפידרמיס. מלקחיים משמשים לקלף את האפידרמיס (בצבע חום) מהדרמיס (הלבן). (ב) ראש הדרמיס ניתן להבחין מהתחתית על ידי הברק של הרקמה. חלקיו העליונים של הדרמיס (הצד שאופן טבעי להתמודד עם העור in vivo או איפה קרטינוציטים יהיו זרע) הוא לא מבריק. התחתון של הדרמיס הוא מבריק. הרקמה היא ורוד בשל הדגירה בקג"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Figure 2. דור של קלטות organotypic. (א) שימוש כויה להסיר כיכר 1.0 סנטימטרים X 1.0 סנטימטר ממרכז המכסה של צלחת 3.5 סנטימטר. (ב) הסר את הכיכר ממרכז צלחת 3.5 סנטימטר. (ג) השתמש ברור לק לדבוק יתדות רבועות. לאפשר 5 דקות ללק להתייבש. (ד) תהפכו את המכסה מעל, כך שהוא מונח על היתדות רבועות. הקלטת מוכנה לשימוש כעת. תמונה (E) של מתכת מפוברקת קלטת organotypic עם ממדיה. (F) תמונה של קלטת מפוברקת מתכת התהפכה הפוכה להראות את יתדות תמיכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דור איור 3. של organotתרבויות ypic עור. () מניחים את הדרמיס עם החלק העליון של הדרמיס (צד הלא-מבריק) פונה כלפי מעלה על גבי קלטת organotypic. (ב) Flip הקלטת שוב ולהוסיף Matrigel לצד המבריק של הדרמיס. (ג) אפשר 5 דקות לMatrigel לביסוס ואז להעיף את הקלטת בחזרה מעל. (ד) הוסף מהונדס גנטי קרטינוציטים לדרמיס (0.5-1 מיליון תאים הם resuspended ב 90 μl של קג"מ). לקצור את הרקמה 1-14 ימים לאחר הזריעה של קרטינוציטים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עור אנושי איור 4. Hematoxylin וצביעת eosin של תרבויות עור organotypic. מחדש מכיל שני האפידרמיס והדרמיס. Epidermהוא הוא מרובד באופן מלא ומובחן עם 4 שכבות נפרדות. שכבות אלה כוללות את שכבת בסיס מובחנת ונבדלות ביניהם 3 שכבות spinosum השכבה, granulosum וקרני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. מכתים immunofluorescence וניתוח ביטוי גנים של האפידרמיס האנושי המהונדס גנטי. (א) יתר של SNAI2 מעכב בידול אפידרמיס. מכתים לקרטין חלבון בידול 1 (K1) מוצג בירוק וגרעינים מסומן בכחול (Hoechst). ניתוח RT-QPCR על רמות ה- mRNA של SNAI2 בlacZ שליטה ורקמה ביתר SNAI2 (B). ברים שגיאה = SD, n = 3. (ג) ניתוח RT-QPCR על mRNAרמות של תמלילי בידול KRT1, TGM1, וSPRR1A בlacZ שליטה ורקמה ביתר SNAI2. ברים שגיאה = SD, n = 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מניפולציה גנטית בעור אנושי תרבויות organotypic מציעות יתרונות רבים ללמדה נפוצה 2D תאים בתרבית וכן מודלים של עכברים. תרבויות 2D חסרות שלוש אינטראקציות מטריצת ממדי תא-תא ותא-תאי נמצאות ברקמות ואיברים שלמים. גם מחקרים שנעשו לאחרונה מצאו הבדלים עצומים בין תאי סרטן העור תרבותיים 2D and 3D עם התאים בתרבית 3D מראים הרבה יותר דמיון ביטוי גנים לעור אנושי ראשוני גידולים 16. תרבויות עור organotypic אדם יש גם כמה יתרונות על פני מודלים עכבר. מודלים עכבר הם זמן רב ויקר להפקה, כמו גם כמה הבדלים בולטים בין אדם ועור עכבר. אלה כוללים שיעורי תחלופת רקמה שונים, כמו גם את העובי של האפידרמיס בין עכברי והאפידרמיס אדם 8. עם טכנולוגיות חדשות מתפתחות כגון CRISPR-CAS, ניתן לשנות גנים ספציפיים / מוטציה מודל מחלות עור אנושיות באמצעות cultur עור organotypices 23. יתר על כן, הגנים יכולים להיות מועברים או הפילו בתאים אלה באמצעות מגוון רחב של שיטות מלבד העברת גני retroviral המתוארת כאן. כל עוד יש משלוח חזק ביעילות התמרה גבוהה או בחירת תרופה, יכולה להיות מועסק בשיטה. שיטות אלה כוללות משלוח nucleofection של siRNAs, lentiviral, וירוס adenoassociated, ווירוס adeno 11,12,24-26.
ניתן לשנות תרבויות עור organotypic על ידי הוספת תאים מסוגים שונים למערכת. לדוגמא, ניתן להוסיף fibroblasts אדם נורמלי או שינה גנטי לדרמיס חסר החיוניות ללמוד mesenchymal וcrosstalk אפיתל. ניתן גם להוסיף תאים חיסוניים לדרמיס ללמוד את התגובה הדלקתית להפרעות בעור. מגבלה אחת של המערכת היא שתהליך השלת התאים המתרחש בvivo אינו מתרחש בתרבויות organotypic. זה מונע את השימוש בתרבויות אלה לטווח ארוך ורוב הניתוחנעשה בין 1-14 ימים לאחר הזריעה של תאי האפידרמיס. למבחנים לטווח ארוכים יותר, יכולות להיות מורכבים תרבויות organotypic על גבם של עכברים בסכנה חיסוניים 17,27.
תרבות organotypic העור שהוצגה כאן היא ייחודית בכך שהוא מנצל הדרמיס אדם חסר חיוניות שלם שהוא המצע הטבעי של האפידרמיס in vivo ואילו רוב מערכות אחרות להשתמש קולגן או Matrigel כמצע 28. התקנה של תרבויות עור organotypic באמצעות מצעים כגון תוצאות Matrigel בריבוד דק יותר ופחות חזק של האפידרמיס בניסיון שלנו. הדרמיס מכיל חלבוני אזור הקרום במרתף כולל laminin וקולגן המאפשר תאי האפידרמיס לצרף, להתרבות, להבדיל, וריבוד 29. שימוש בדרמיס מאפשר לדור של האפידרמיס המחקה את עמיתם in vivo. לפיכך, תרבויות עור organotypic יכולות להיות יקרות מאוד בים טוקסיקולוגי והתרופתיtudies במקרים בהם מחקרים בבעלי החיים אינם מורשים (תעשיית קוסמטיקה) 30.
שימוש בדרמיס חסר חיוניות גם מגיע עם חסרונות משלו מאז העובי של הדרמיס בין תורמים שונים או אפילו בתוך אותו התורם יכול להשתנות. תאי האפידרמיס גדלו על הדרמיס עבה נוטים שלא להתרבות וליצור עבה כמו של האפידרמיס כתאים שגודל בדרמיס דק יותר. לפיכך, חשוב לבחור הדרמיס עובי דומה בעת הגדרת ניסויי השוואת דגימות מרובות. עוד פרמטר קריטי הוא לזרעו המספר של תאי האפידרמיס כאשר משווה קבוצות שונות, כך שכל הבדלים ראו הוא לא בשל ההבדלים במספר ראשוני של תאי זרע.
לסיכום, תרבות עור organotypic יכולה לשמש כמתקדמת ויעיל במודל חוץ גופית לאימות מסלולים מולקולריים בהקשר פיסיולוגי יותר, שסופו של דבר יאיץ את ההבנה של mechan הרגולציה הגןהאיזמים חשובים בגדילה באפידרמיס ובידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו הייתה supportedby האמריקאי למלחמה בסרטן אגודת מחקר החוקרים גרנט (RSG-12-148-01-DDC) ופרס CIRM יסוד הביולוגיה (RB4-05779).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A.
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E.
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A.
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V.
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
