Abstract
器官型培养允许它模仿功能和其在体内的组织对应的生理3D环境进行细胞-细胞接触和细胞-基质相互作用至关重要的重构。这是通过皮肤器官培养忠实地概括了表皮分化和分层方案例证。原代人表皮角质形成细胞是通过逆转录病毒基因在那里可以很容易地过度表达或撞倒的基因操纵。这些遗传修饰的角质形成细胞随后可以用来再生人表皮在器官型培养物的皮肤提供了强大的模型来研究遗传途径冲击表皮生长，分化和疾病进展。这里介绍的协议描述方法以制备灭活人真皮以及遗传操作初级人角质形成细胞，以便产生皮肤器官培养物。再生人体皮肤可downstr使用EAM的应用，如基因表达分析，免疫染色，和染色质免疫沉淀，随后通过高通量测序。因此，这些代转基因器官皮肤培养物将允许基因是保持皮肤稳态的关键的确定。
Introduction
人类表皮是一个分层上皮，它可通过细胞外基质被称为基底膜zone.The表皮不仅作为不可渗透的屏障，以防止水分的损失，而且作为防御的第一道防线，以保护连接到下面的真皮身体从国外和有毒物质1。基底层，这是表皮的最深处层，包含表皮干细胞和祖细胞的产生的已分化后代，形成了表皮2的其余部分。表皮祖细胞分化它们迁移向上，以形成被称为棘层3分化的细胞的第一层。在棘层，细胞打开角蛋白1和10的表达，其然后提供强度来承受物理应力为表皮的分化层。作为棘层细胞进一步分化，它们向上移动在表皮为米颗粒层其特征是，形成的透明角质和片状颗粒以及其组装下面质膜结构蛋白。随着细胞继续在分化过程中，质膜下方的蛋白质交联到对方，而层状颗粒从细胞挤出 ，以形成富含脂质屏障称为角质层4。
疾病涉及在表皮生长和分化的影响〜人口5的20％的改变。因此，了解该方法的机制是非常重要的。因为许多这些疾病的表现是在细胞-细胞或细胞-基质接触队伍，器官型培养其中人表皮复原在3D环境中已创建6-10。这些方法通常包括使用接种在细胞外基质的主要或转化角化细胞如失活的人类的真皮层，基质胶或胶原蛋白。
要明白，在表皮生长和分化的重要的基因调控机制，角化细胞可以遗传通过逆转录病毒载体操纵以拦截或过表达的基因在二维培养，然后在三维重构。这些方法已被广泛用于表征涉及表皮干细胞和祖细胞的自我更新和分化以及进展为肿瘤11-21基因。这里，提供了深入协议，关于如何通过利用逆转录病毒的改变在表皮器官型培养的基因表达。
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Protocol
根据加州大学圣迭戈分校的研究伦理委员会的指导方针进行了人体皮肤的协议。人的皮肤可以从废弃的手术样本中获得，或从皮肤银行购买（皮肤银行被列在材料/设备表 ）。其中皮肤是从主或施主的年龄衍生的位置不是本实验只要基底膜区蛋白（胶原蛋白/层粘连蛋白）在真皮临界不会降解。
1.准备失活的人真皮的
- 在接收到人体皮肤时，将组织在组织培养罩解冻（〜3-5分钟）。根据皮肤的大小，放置解冻组织在一个无菌的一次性50ml锥形管或125毫升瓶装。从皮肤银行皮肤的典型大小为0.75平方英尺。
- 填充容器75％满，支持4倍青霉素和链霉素（笔/链球菌）的1X PBS。剧烈摇晃5分钟和处置的液体。重复此步骤3次以上。
- 在最后一次洗涤后，将组织转移到新的试管/瓶，加上新的4倍青霉素/链霉素/ PBS中以填充容器的75％。孵育在组织培养箱此混合物在37℃下进行2周，以允许从表皮真皮的分离。
- 在无菌条件下，使用镊子剥离表皮从真皮。真皮是全白，而表皮会有着色根据供体（ 图1A）的比赛。根据该机构的协议处理人体组织丢弃表皮。
- 将在管或瓶真皮和4倍笔/链球菌稀释于1×PBS中剧烈振荡（5分钟洗4次）清洗。在最后一次洗涤后，将真皮转移到新的试管/瓶在4倍青霉素/链霉素稀释于1×PBS中，并储存在4℃直至准备使用。真皮可以储存在4℃下长达一年。 2.遗传修饰小学的人角质形成细胞
- 第1天：转染前一天，种子凤细胞在6孔板中以每孔80万细胞在完全DMEM培养基中的密度。
- 第2天：转染的当天，用3微克的逆转录病毒载体的每孔。等分试样3微克逆转录病毒载体导入1.5ml试管。使用100μ组合;升的DMEM加6微升转染试剂的每3微克载体的构建。拌6微升转染试剂用在1.5ml管100微升DMEM中。 （对所使用的逆转录病毒载体中列出的设备/材料表）。
- 孵育5分钟，并添加106微升混合物到预等分管含有3微克的逆转录病毒载体的构建。混合并在室温下孵育30分钟。添加这种混合物全部滴凤凰细胞的每一个孔。
- 第3天：转染后的第二天，从凤凰细胞取出媒体和加入2毫升新鲜完整的DMEM培养基。在同一天，种子初级人角质形成细胞到6孔板中，每孔75000个细胞的密度。保持在角质形成细胞无血清培养基（KCSFM）抗生素（青霉素/链霉素）的角质形成细胞。
注：原代人角质形成细胞购买。细胞可以从多家供应商（在材料/设备表中列出）购买。 - 第4天：HAR从转染的凤细胞，其现在包含病毒颗粒归属介质。通过使用注射器0.45μm的过滤器传递介质（以除去任何污染的凤细胞），并放置2 ml的到角质形成细胞（前一天接种在75000个细胞/孔：参见步骤2.3）。加入聚凝胺（5微克/毫升）向媒体帮助调解感染过程。病毒滴度是〜1×10 7 TU /毫升。
- 旋6孔板在离心机中，在200×g离心1小时，在室温。旋转后，取出含有病毒的媒体和添加KCSFM前，用1×PBS洗一次细胞。
- 第5天：感染同一批次的角质形成细胞的再按照步骤2.4。
注意：选择使用药物的角化细胞是否存在的逆转录病毒载体的选择标记和扩大用于下游分析或应用，例如器官型培养使用。 - 构建从实验室中常用的材料或盒录像带器官可以通过金属加工店进行定制（ 图2A - F）。从3.5厘米组织培养板使这些磁带盒，使用烧灼来从一个3.5厘米培养皿（ 图2A-B）的盖子的中心除去1.0厘米×1.0厘米的正方形。为此无菌条件下。
- 附加方形栓用透明指甲油（ 图2C）纸盒（3.5 cm培养皿的盖子）的底部。允许5分钟的指甲油干，翻转磁带上，使其搁在方形栓（ 图2D）。放置盒插入直径6cm培养皿。
注：方形栓可以从各种手工艺品商店购买。
- 附加方形栓用透明指甲油（ 图2C）纸盒（3.5 cm培养皿的盖子）的底部。允许5分钟的指甲油干，翻转磁带上，使其搁在方形栓（ 图2D）。放置盒插入直径6cm培养皿。
- 制备角质形成细胞生长培养基（KGM）由66％的DMEM，22％的Ham的F12，100单位/毫升青霉素，100微克/ ml链霉素，10％FBS，2.67微克/毫升腺嘌呤，40 N克/ ml氢化可的松，10纳克/毫升的霍乱毒素，4.94微克/毫升的胰岛素，5微克/毫升转铁蛋白，1.36纳克/毫升三碘左旋甲腺氨酸，10纳克/毫升的EGF，和10微克/毫升盐酸环丙沙星。用0.22微米的过滤和储存过滤介质在4°C，直到准备使用。
- 取真皮出在4x青霉素/链霉素+ PBS溶液和在KGM中洗2次，然后孵育在KGM中，在37℃下在使用前两天。
- 切割用手术刀真皮至1.5厘米×1.5厘米大小的块，然后放置到器官盒。放置真皮朝上真皮的顶部。真皮的顶部将是进入与角质形成细胞（ 图1B）接触的一侧。
- 将预切真皮到器官盒朝上（图3A）的真皮的顶侧的方孔。
- 翻转整个器官盒含有真皮过使用镊子（图3B）。冰上解冻的细胞外基质的解决方案。使用针头和注射器绘制出100微升每盒细胞外基质的解决方案。加入5滴到真皮（光面）的底部，并轻微振荡以确保整个真皮（图3B）的均匀分布。
- 允许用于商业细胞外基质溶液5分钟后，完全固化（图3C）。凝固后，使用镊子翻动录像带回去。添加4毫升KGM到直径6cm培养皿。
- 放置0.5-1百万遗传修饰的角质形成细胞在含有真皮（图3D）的器官型盒。
- Trypsinize角化细胞通过将4 ml的0.05％胰蛋白酶的10个到厘米板5分钟，骤冷用4ml完全DMEM介质。
- 计数使用血球的角化细胞，然后降速，在200×g离心5分钟。重悬0.5-1百万个细胞在90μ（取决于可用的细胞数）升KGM和放置所有单元格到真皮层。
注意：它放置细胞相同数量的上真皮同样的实验中，以确保出现在再生表皮的厚度的任何差异不是由于在初始细胞数的差异是很重要的。在真皮层放置少于0.5万个细胞可导致分层穷人和分化。
- 隔日变化对器官文化KGM媒体。嘉实组织对真皮的角质形成细胞放置后1-14天。表皮完整的分层和分化通常在5天后发生。
注：生长在完全DMEM培养基[DMEM + 10％胎牛血清（FBS）+青霉素/链霉素]，制造病毒感染的原代人角质形成细胞用嗜凤细胞。病毒包装基因编码蛋白质如的gag-pol和信封被稳定地整合到凤细胞基因组中时，用逆转录病毒载体转染其允许病毒的生产。凤凰细胞可被转染的高效率，可用于高病毒效价的生产。从这个包装线生产的病毒也可以感染多种哺乳动物细胞，包括人。
3.设置器官皮肤文化
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Representative Results
在产生器官型人皮肤的第一步是从真皮除去表皮。皮肤在37℃下在4×青霉素/链霉素/ PBS两周孵化应该允许真皮从表皮（图1A）的分离。如果分离表皮和真皮层，很难然后将组织在37℃于4笔/链球菌/ PBS一个星期，然后再次尝试剥离使用镊子。
一个关键的灭活真皮再生人表皮的是，确保了角质形成细胞被放置在真皮的正确的一面。真皮具有顶部和底部。真皮的顶部是附带在体内角化细胞接触到，以及在器官型培养的一侧。真皮的顶部可以从真皮的底部来区分由于底部 （图1B）的光泽度。如果角化细胞被直接放置在底部侧真皮（光泽），表皮不会分化或分层正常。因此，关键是要具有真皮（无光泽）朝上在器官型盒的顶部。真皮可以直接放置在一个器官盒（图2A - F）。从组织培养板制成磁带应抗紫外线消毒，同时金属制成录像带可高压灭菌之前，真皮被置于。遗传修饰的角质形成细胞随后可以放置到真皮。角化细胞最初浸没在液体中，因为它们被放置到再悬浮于KGM真皮。 24小时后的KGM将已通过其允许角质细胞暴露于气-液界面引起分层和分化为表皮7（图3）的真皮扩散。
RNA，蛋白质，DNA /染色质，以及组织切片可从器官s内收获亲属培养物都可以用于各种的下游应用。 RNA可被用于确定控制和敲除/用RT-QPCR，微阵列，或RNA测序过表达组织之间基因表达的差异。的DNA /染色质，可用于DNA或芯片起应用。再生的皮肤可被安装在OCT和冷冻切片可用于免疫染色或苏木精和伊红染色，以评估在对照组和实验组的组织形态，表达/定位。
这样的一个例子示于图4与典型的器官型培养皮肤的苏木精和曙红染色。需要注意的是表皮的所有四个不同的层形成有分化相关蛋白的层特异性表达（图4）11,12,14,15。该系统可以被用于确定过表达或上表皮不同基因的敲低的影响。 图5表明表达控制，LACZ以及组织过表达对SNAI2再生表皮组织。 SNAI2的过表达导致了表皮分化的抑制所指出的缺乏角蛋白1（K1）染色以及分化诱导结构基因如TGM1和SPRR1A（图5A - C）的表达的丧失13,22。在图4和图5中所示的表皮厚度可在同一样品中，由于更多的细胞在真皮相对于周边的中间累积当细胞最初放置在真皮而变化。因此，中间部分趋向于具有更厚的表皮而周边趋于具有更薄。对于不同的样品之间的直接比较的部分的相同区域应该比较。然而，染色标记应保持一致。
“图1”SRC =“/文件/ ftp_upload / 53280 / 53280fig1.jpg”/>
图1.制备人皮肤真皮的。（A）中的人的皮肤在37℃下进行2周的培养后，将真皮从表皮分离。镊子用于剥离表皮（棕色）远离真皮（白色）。 （B）的真皮的顶部可以从底部由组织的光泽度区分。真皮的顶部（即自然会面临在体内或在角化细胞将被接种表皮的一侧）是非镜面。真皮的底部是有光泽的。该组织是粉红色的，由于孵化KGM。 请点击此处查看该图的放大版本。
Figure 2代器官盒。（A）使用烧灼从3.5 cm培养皿的盖子的中心删除1.0厘米×1.0厘米见方。从3.5 cm天线的中心 （B型），去掉所有方。 （三）用透明指甲油坚持方形栓。允许5分钟的指甲油晾干。 （D）的翻转盖过，以便它搁在方形栓。磁带盒现在已准备好被使用。金属（E）图像制作器官的磁带，它的尺寸。 （F）的金属制成录像带的图像翻转倒置以示支持挂钩。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.生成organot的ypic皮肤培养物。（ 甲 ）将真皮与真皮（无光泽面）朝上到器官盒的顶部。 （B）翻转磁带上，并添加基底膜真皮的光面。 （ 三）允许5分钟的基质胶固化，然后翻转录像带回去。 （D）中添加遗传修饰角质到真皮（0.5-1百万个细胞再悬浮于90微升的KGM）。收获的角质形成细胞接种后1-14天的组织。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.苏木精和器官皮肤培养物的曙红染色。再生人体皮肤包含表皮和真皮。该表皮是完全分层和分化有4个不同的层。这些层包括未分化的基础层和3层的分化，包括棘，以及，颗粒角质层。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.免疫荧光染色和转基因人类表皮基因表达分析。SNAI2（一）表达抑制表皮分化。染色分化蛋白角蛋白1（K1）示于绿色和细胞核标记为蓝色（Hoechst公司）。 （ 二）对SNAI2的控制LACZ和SNAI2过表达组织的mRNA水平RT-QPCR分析。误差线= SD，N = 3（C），RT-QPCR在mRNA分析分化的成绩单KRT1，TGM1和SPRR1A的控制LACZ和SNAI2过度组织水平。误差线= SD，N = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
遗传操作在人皮肤器官型培养提供许多优点常用研究2D培养细胞以及小鼠模型。 2D培养缺乏完整的组织和器官中发现的三维细胞 - 细胞和细胞 - 细胞外基质相互作用。最近的研究还发现，与三维培养的细胞显示多基因表达的相似性对原代人皮肤肿瘤16的二维和三维培养的皮肤癌细胞之间的巨大差异。人体器官皮肤的文化也有过小鼠模型的几个优点。小鼠模型是耗时且昂贵的产生以及人类和小鼠的皮肤之间有几个显着的差异。这些包括不同组织转化率，以及鼠和人表皮8之间的表皮的厚度。新兴如CRISPR-CAS新技术，特定的基因可被修饰/突变成模拟使用器官型皮肤文化性人类皮肤疾病上课23。此外，基因可以被递送或通过各种各样的除了这里所描述的反转录病毒基因转移方法在这些细胞中撞倒。只要有稳定传送通过高转导效率或药物选择，该方法可以被采用。这些递送方法包括核转染的siRNA，慢病毒，腺相关病毒和腺病毒11,12,24-26。
器官型培养物的皮肤可以通过添加不同类型的细胞对系统进行修改。例如，在正常或遗传改变的人成纤维细胞可添加到灭活真皮研究间充质和上皮串扰。免疫细胞也可以被添加到真皮，研究在皮肤炎性反应扰动。该系统的一个限制是，发生在体内的脱屑过程中不会发生器官型培养。这防止了使用这些培养物对于长期和最分析表皮细胞接种后1-14天之间完成。对于较长期测定中，器官型培养可被移植到免疫缺陷小鼠17,27的背部。
这里介绍的皮肤器官型培养是在它利用完整失活的人真皮是表皮的天然底物的体内 ，而大多数其他的系统使用胶原或基底膜作为基板28是唯一的。安装器官皮肤培养用基材，如基质胶导致在我们的经验，表皮较薄，并不太可靠分层。真皮包含基底膜带蛋白包括层粘连蛋白和胶原蛋白，让表皮细胞附着，增殖，分化和分层29。使用真皮的允许生成表皮的模仿它们在体内的对应。因此，器官皮肤文化可以在毒理学和药理学小号极为宝贵在案件案例研究，其中动物研究是不允许的（化妆品行业）30。
使用灭活真皮层还带有因为即使在同一个捐赠者可以为不同的捐助者之间或真皮层的厚度，其自身的缺点。生长在厚厚的真皮表皮细胞往往不能增殖并产生厚的表皮生长在真皮层变薄细胞。因此，重要的是建立在比较多个样品的实验时，选择类似厚度真皮。另一个重要的参数是比较不同组时，使看到任何差别并非由于在细胞接种的初始数量的差异播种表皮细胞的数目相同。
最后，该器官皮肤培养可作为在体外模型中的先进高效验证分子途径在更多的生理范围内，这最终将加速基因调控mechan的理解是在表皮细胞生长和分化的重要主义。
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Acknowledgments
这项工作是supportedby美国癌症协会的研究学者格兰特（RSG-12-148-01-DDC）和CIRM基础生物学奖（RB4-05779）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html | |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 | |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 | |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 | |
| DMEM | GIBCO | 11995 | |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F | |
| FBS | GIBCO | 10437-028 | |
| Adenine | Sigma | A-9795 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 | |
| Insulin | Sigma | I-1882 | |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 | |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P | |
| square pegs | Arts and crafts stores | ||
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n | |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 | |
| LZRS retroviral vector | Addgene | ||
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
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