Evaluering af lungemetastase i musebrysttumor modeller af kvantitativ real-time PCR

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man bruger kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) til påvisning af tumorcellespecifikke mRNA repræsenterer metastase i mus lungevæv.

Abstract

Metastatisk sygdom er spredningen af maligne tumorceller fra den primære kræft websted til et fjernt organ, og er den primære årsag til kræft forbundet død ^1. Almindelige steder af metastatisk spredning indbefatter lunge, lymfeknude, hjerne og knogler ^2. Mekanismer, der driver metastaser er intense områder af kræftforskning. Derfor effektive analyser måle metastatisk byrde i fjerne steder for metastaser er medvirkende til kræftforskning. Evaluering af lungemetastaser i mammae tumormodeller udføres generelt ved grov kvalitativ observation af lungevæv efter dissektion. Kvantitative metoder til evaluering metastaser er i øjeblikket begrænset til ex vivo og in vivo imaging teknikker, der kræver brugerdefinerede parametre. Mange af disse teknikker er på hele organismen snarere end det cellulære niveau ^3-6. Selv om nyere billeddannende fremgangsmåder under anvendelse af multi-foton mikroskopi er i stand til at vurdere metasTASIS på celleniveau ^7, disse meget elegante procedurer er mere egnet til at evaluere mekanismer formidling snarere end kvantitativ vurdering af metastatisk byrde. Her er en simpel in vitro metode til kvantitativ vurdering metastase fremlagt. Anvendelse af kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcellespecifik mRNA påvises i mus lungevæv.

Introduction

Foreslås QRT-PCR-analyse som en metode til vurdering tumormetastase. Foreslås denne metode som et alternativ for brugere, der er interesseret i at evaluere metastaser, men måske ikke har adgang til særligt udstyr såsom in vivo imaging udstyr eller en fluorescens stand stereoskop. En diskussion af almindeligt anvendte metoder præsenteres efterfulgt af en demonstration for, hvordan QRT-PCR-analyse kan anvendes enten som en separat eller som ledsager metode til at evaluere metastase. Denne fremgangsmåde har potentialet til at tilvejebringe en kvantitativ analyse af metastatisk byrde.

Standard metoder til grov analyse, herunder visualisering af lungerne under et stereomikroskop samt seriel sektionering efterfulgt af hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning af lungevæv, er kvantificerbare, men er stærkt afhængige brugerdefinerede parametre for at tælle ^2-5. Ved evalueringen hele lunger ved hjælp af et stereomikroskop, kun store overflade metastaser er visible og analyse kræver investigator til at have rimeligt kendskab til lunge anatomiske struktur til at afgøre, hvad der udgør en metastatisk læsion. Fluorescerende mærkning af tumorceller med en markør, såsom GFP og anvendelse af et stereomikroskop, som indeholder en let kube med passende excitation / emission maxima (f.eks tæt 470/510 nm for GFP) bistår i denne proces, men kun overfladen tumorknuder kan påvises . Derudover fluorescens fra blod forurening, som er synlig under de samme parametre som GFP, kan føre til falsk identifikation af mulige metastatiske læsioner.

Sektionering af lungen, efterfulgt af H & E-farvning til visualisering af lungemetastase er en nyttig metode til at evaluere mikrometastaser og andre mikroskopiske processer, herunder immune celleinfiltration, men kræver ofte brug af hele lungevæv for indlejring i paraffin, sektionering og farvning procedurer. Derfor er downstream procedurer ikke ideelle følger denne method. Selv kvantificerbare, denne procedure kræver investigator at evaluere et stort antal farvede lungesnit hvert dyr for at sikre, at analysen tegner sig for hele 3D-struktur af lungen. Derfor denne type undersøgelse er tidskrævende, kan føre til at tælle fejl, og analyse stærkt afhængig investigator skøn.

Adskillige in vivo imaging-teknikker (f.eks MRI, PET, SPECT) er i øjeblikket bruges til at udføre eller teste biologiske processer i eksperimentelle gnavermodeller ^8. In vivo bioluminiscerende billeddannelse er en fælles metode, der anvendes til at erhverve en grov visning af metastaser ^9. Denne teknik anvendes generelt til at vurdere tilstedeværelsen af ​​luciferase reporter aktivitet på grund af ophobning af tumorceller, som er manipuleret til at indeholde en luciferaserespons element, der er placeret i bestemte organer som brystkirtlen efter tumorcelleimplantation og lungen ved spontan metastase ¹0. Visualisering af luciferase reporter aktiviteten induceres ved tilstedeværelsen af luciferin substrat (D-luciferin). Luciferase katalyserer oxidativ decarboxylering af D-luciferin at oxyluciferin generere bioluminescens. Mens informativ, er denne metode begrænset af flere faktorer, herunder substrat stabilitet (dvs. korte halveringstid), passende fordeling af substrat, som afhænger af, hvordan det leveres til forsøgsdyr, og lav følsomhed afsløring ^9. En af de vigtigste fortjeneste til denne teknik er, at det er ikke-invasiv, kan udføres på levende dyr, og kan føre til påvisning af tumor celle metastaser i flere organer, der ikke har været normalt høstet ved dissektion ^9,10.

Et positivt aspekt af in vivo-billeddannelse teknikker er, at lungevævet er uforstyrret giver mulighed for sekundære procedurer som paraffinindlejring eller som præsenteres her, QRT-PCR-analyse. Men fordi QRT-PCR er theoretically en mere følsom måling af detektion, kan grov evaluering ikke afsløre lavt antal tumorceller til stede i lungerne. Nyttige, kan de billeddannende teknikker beskrevet ovenfor være substitueret eller suppleres med QRT-PCR-fremgangsmåden øjeblikket beskrevet. QRT-PCR har potentialet til at tilvejebringe et følsomt mål for tumorafledte mRNA i en lunge.

Protocol

Protokollen følger de retningslinjer og dyr pleje standarder for Medical University of South Carolina (MUSC) og dens Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

1. Lung Dissektion

1. Mammatumor dissektion (ekstraudstyr afhængig af undersøgelsens mål, og om primær tumor analyse eller haleveneinjektion blev udført).
   1. Aflive musen ved hjælp af en dødelig dosis af isofluran anæstesi ifølge IACUC og universitet regulering. Bekræft euthanization ved kirurgisk dislokation.
   2. På skum bord, pin med dissektion stifter ved at placere musen på ryggen med benene spredt.
   3. Spray mus med 70% ethanol.
   4. Ved hjælp af pincet fat i den nedre del af dyret i midten.
   5. Ved hjælp af saks, klippe opad mod halsen gennem huden, og pas på ikke at gennembore bughulen af ​​musen.
   6. Skære huden på lemmerne at afsløre tumorvæv.
   7. Dissekere ud tumorvæv og preserve af foretrukne metode, såsom frysning eller fiksering, til yderligere analyse (ikke yderligere i denne protokol).
2. Lungevæv dissektion.
   1. Hvis tumorvæv blev høstet som beskrevet ovenfor, pin ned eventuelt overskydende hud.
   2. Ved hjælp af pincet, gribe peritoneum ved nedre ende af dyret og begynde at skære opad mod bunden af ​​halsen.
   3. Skær forsigtigt langs venstre og højre side af brystkassen være omhyggelig med at undgå overskæring enhver blodkar, der kan bløde ind i brysthulen. Fjern ribbenene ved at skære til venstre og højre gennem membranen og øvre dele af brystkassen.
   4. Ved hjælp af pincet fat i luftrøret af mus og træk fremad.
   5. Sever luftrøret med dissektion saks og fjern lungerne fra mus.
      Bemærk: Hjertet kan forblive fastgjort til lungen. Hvis dette sker, forsigtigt dissekere hjerte væk fra lungerne være omhyggelig med at indsamle alle fem lapper (se figur 1
   6. Vask forsigtigt med PBS for at fjerne overskydende blod.
3. Gross evaluering af lungevæv.
   1. Mulighed 1: In vivo imaging.
      1. For luciferase imaging, ~ 10 minutter før billeddannelse, giver dyrene en 150 mg / kg dosis af luciferin ved intraperitoneal (ip) injektion. Billede lungerne in vivo i bedøvede dyr eller efter fjernelse efter dissektionen (figur 2) ^5.
   2. Mulighed 2: Brutto evaluering.
      1. Undersøg lungerne under stereomikroskop at visualisere tumorknuder. Bemærk: Hvis cellerne er GFP mærket, kan et fluorescens-stereomikroskop stand indeholdende en let kube med passende excitation / emission maxima (f.eks nær 470/510 nm) for at detektere GFP anvendes til at undersøge lungerne stereoscopically for fluorescens før bearbejdning.
   3. Hvis lunger skal analyseres med det samme, gå videre til 'RNA Isolation "sektionen. Ellers snap fryse væv ved hjælp liquid nitrogen eller tøris. Opbevar ved -80 ° C.

2. RNA Isolation

Bemærk: det repræsentative analyse blev RNA isoleret ved hjælp af en RNA-isolation kit (se Materialer List). Mens den aktuelle analyse bruger et bestemt producentens produkt, en række isolation kits er tilgængelige fra flere anerkendte leverandører. Derudover, ikke-kit baseret centrifugering metoder er også en mulighed. cDNA bør også fremstilles ud fra en positiv kontrol RNA-prøve, såsom en cellelinie eller et plasmid, for standardkurve analyse. Alternativt kan en positiv kontrol specifik for primer probesæt købes (se Materialer List).

1. Hvis du bruger tidligere frosne væv, samle frosne væv på tøris.
2. Homogeniseres væv ved hjælp af en af ​​følgende metoder såsom morter og støder formaling udføres med hånden på tøris efter frysning af væv i flydende nitrogen; vævshomogenisator eller mekanisk dissociation enhedifølge producentens forslag; lydbehandling eller anden foretrukne fremgangsmåde.
   Bemærk: Til repræsentativ analyse, den foretrukne fremgangsmåde til homogenisering er sonikering.
   1. Til analysen vist i figur 3, forberede lysisbuffer (tilvejebragt i RNA-isolering kit) og 2-mercaptoethanol i et forhold på 20 pi 2-mercaptoethanol til hver 1 ml lysisbuffer. Resuspender væv i 300 pi lysisbuffer suppleret med 2-mercaptoethanol for hver 30 g væv og sonikeres i 10 sek med sonikator indstillet til 30% amplitude.
   2. Hvis du bruger morter og støder, resuspender jorden væv i 300 pi lysisbuffer efter slibning.
3. Tilsæt 10 pi proteinase K til 590 pi TE-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 1 mM EDTA). Tilføj 600 pi proteinase K-opløsning til hver 300 pi (dvs. for hver 30 mg) af væv. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
   Bemærk: Fordøjelse kan variere.
4. Centrifuger prøver ved ≥13.000 g i 10 minutter til fjernelse af snavs.
5. Overfør supernatanten til nye rør.
6. Tilføj 450 pi ethanol (96% -100%) for hver 900 ul supernatant til udfældning RNA.
7. Overfør 700 ul af lysatet / ethanol blanding til søjlen.
8. Centrifuger prøver ved ≥13,000 g i 1 min til at binde RNA til kolonne.
9. Kassér flydende affald og tilføj resterende supernatant til spalte og spin igen.
10. Når alle lysatet centrifugeres gennem søjlen, tilsættes 350 pi vaskebuffer 1 til den øvre del af kolonnen, og der centrifugeres prøver ved de ≥13,000 g i 30 sek.
11. Kassér væske fra kolonnen og erstatte øvre del.
12. Forbered DNase ved at blande 5 enheder DNase I enzymet med 5 pi 10x DNase og 40 pi DNase / RNase-frit vand per prøve (samlet volumen på 50 ul / prøve).
13. Der tilsættes 50 pi DNase blandes til hver søjle og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
14. Tilføj 350 ul vaskebuffer 1 til søjle og centrifuge Sampler på ≥13,000 g i 30 sek.
15. Kassér væske fra kolonnen og erstatte øvre del.
16. Tilføj 600 ul vaskebuffer 2 til kolonnen og spin 30 sekunder ved ≥13,000 g.
17. Kassér væske fra kolonnen og erstatte øvre del.
18. Tilføj 250 ul vaskebuffer 2 og centrifugeres i 2 minutter ved ≥13,000 g.
19. Put del af kolonnen i nye opsamlingsrør og kassér gamle opsamlingsrør.
20. Tilføj 50-100 pi RNase / DNase frit vand til søjle og inkuberes i 1 min.
21. Spin i 1 min ved ≥13,000 g.
22. Re-run indsamlet eluat gennem kolonnen for at øge RNA udbytte.
23. Til øjeblikkelig brug, holde prøverne på is og fortsæt til kvantificering. Til senere brug, snap fastfrysning af tøris eller flydende nitrogen. Opbevares ved -80 ° C fryser indtil brug.

3. First Strand Synthesis

Bemærk: det repræsentative analyse blev revers transkriptase (RT) reaktion udført en FFØRSTE cDNA-syntese kit designet til QRT-PCR (se Materialer List).

1. Hvis prøverne tidligere blev indsamlet, tø rør på is.
2. Mål RNA mængde ved hjælp af et spektrofotometer.
3. Anvendelse af 0,5-2 ug af total RNA, udføre første streng syntese under anvendelse af revers transkriptase til at generere cDNA lager.
   1. I sterile, RNase / DNase-fri PCR-rør / plader, forberede reaktionsblandingen (tabel 1). Bland forsigtigt og centrifuger. Programmere en standard-PCR-maskine (tabel 2).
4. Færdige reaktion på ønsket volumen (generelt 50-100 pi) under anvendelse af sterilt nuklease-frit vand fortyndes.

4. Real-time PCR

Bemærk: det repræsentative analyse blev SYBR grøn brugt. Imidlertid kan en hvilken som helst foretrukken fremgangsmåde være substitueret ved brugerens skøn.

1. Ved hjælp af en positiv kontrol cDNA, nedsat en standardkurve for hver primer sæt.
   1. Til analysen vist in Figur 3, forberede standardkurve for human HER2 anvendelse af producentens anbefalede positiv kontrol cDNA (se Materialer List). For muse GAPDH, bruge den negative kontrol lunge-cDNA til frembringelse af en standardkurve. For hver probe, serielt fortynde cDNA 1: 4 til at generere 5-standarderne.
2. Beregn det samlede antal prøver, som bør omfatte standardkurve og eksperimentelle prøver.
   Bemærk: Til analysen beskrives her blev 2-3 eksperimentelle replikater pr prøve analyseret. Standardkurve-analyse blev udført for at fremskaffe en simpel lineær regressionsmodel, der kan anvendes til at bestemme den relative mængde af HER2 og GAPDH per prøve at beregne endelige normaliserede mængde. Denne analyse vil også sikre, at primeren effektivitet er tilstrækkelig for analysen ved hånden.
3. I en steril, RNase / DNase-fri rør, forberede Master Mix (tabel 3).
   1. Beregn mester mix amount per prøve. Skalere op i mere end én prøve. Brug en master mix for hver eksperimentel gen af interesse, såvel som en intern kontrol, såsom GAPDH. Brug primere til GAPDH ved en slutkoncentration på 200 nM.
      Bemærk: Den interne kontrol er især nyttig, når de forsøger at skelne mellem menneske og mus celle oprindelse.
      Bemærk: Primer koncentration for HER2 blev optimeret og bestemmes af producenten.
4. Forbered test plade indeholdende 1 pi cDNAer svarende til hver standard eller eksperimentel prøve. Tildele mindst 1 cDNA prøve / brønd for hver primer probe. Tilføj 19 pi mastermix per brønd for hver primer probe.
   Bemærk: Ved de repræsentative data i figur 3, blev cDNA prøver analyseret dobbelt for hver primer sonde og plottes som gennemsnittet af de to prøver.
5. Kør reaktion i QRT-PCR maskine ved hjælp anbefalet eller tidligere testet PCR-protokol. Se tabel 4 figur 3 og 4.

Representative Results

Ud over den tid, det tager at udføre den indledende inokulering af tumorceller i forsøgsdyret og hvis udførelse, primær in vivo tumor analyse, vævet høsten RNA-isolering, og QRT-PCR-analyse er en 1-2 dages procedure (figur 1) .

Et eksempel på grov analyse bioluminescerende billeddannelse at evaluere tumorceller i lungevævet. Her blev en mamma tumorgenese eksperiment udført for at vurdere, om et stof, der undersøges, der er målrettet den gap junction protein connexin43, kaldet ACT1, ville svække spontan metastase af 4T1-Luc brysttumorceller til lungen. Efter flere ugers behandling, dyr, der modtog placebo eller testmidlet blev injiceret med luciferin og aflivet. Ved dissektion, blev lunger visualiseret for luciferase bioluminescens. Fra de repræsentative billeder ser det ud til, at lungerne fra lægemidletbehandlede dyr er negative for luciferaseaktivitet hvilket indikerer, at ingen tumorceller er til stede i lungerne, hvilket tyder på en inhibering af metastase efter AKT1 behandling (figur 2A). Hovedformålet med disse repræsentative billeder er at vise, at bioluminescerende billeddannelse er en hensigtsmæssig metode til påvisning af metastaser. Men efter detaljeret undersøgelse af H & E sektioner af lungerne fra dyr behandlet med AKT1, blev identificeret, som ikke blev belyst af luciferase imaging (figur 2B), måske antyder, at denne form for billeddannelse ikke kan være følsomme nok til at detektere lave antal tumor mikrometastaser celler indlejret i lungen. Ideelt set ville en følgesvend analyse for QRT-PCR udføres for at bekræfte disse resultater.

Den QRT-PCR-analyse præsenteres her anvender en probe specifik for human HER2 til påvisning humane tumorceller i lungen fra HER2 + JIMT-1-celler, derblev oprindeligt transplanteres ind i brystfedtpuden af værtsdyr (figur 3). Metastase opstod spontant efter tumorudvikling. Efter dissektion, når de ses under et stereomikroskop, blev der ikke groft synlige metastaser observeret på et hvilket som helst af lungerne. , Baseret på den efterfølgende QRT-PCR-analyse ser det dog, at to af de elleve lunger høstet fra tumorbærende dyr nærede metastaser, angivet med pilene i figur 3, hvilket antyder, at tumorceller, som blev opdaget af visualisering er til stede. cDNA afledt fra et stykke JIMT-1-afledt tumor blev anvendt som en positiv kontrol for HER2-ekspression (figur 3, (+)) og en lunge fra en mus, der ikke var injiceret med tumorceller blev anvendt som en negativ kontrol (figur 3, (-)). En mus specifik probe for GAPDH blev anvendt som en intern kontrol for at bestemme andelen af humane tumorceller til den samlede muse lungevæv. Den positive kontrolprøve blev normaliseret til GAPDH niveauer fra kontrol lungen som reference. En alternativ normalisering strategi ville være at gennemsnittet mængden af GAPDH tværs af alle lunge prøver at erhverve mere konsistente normalisering niveauer for kontrolprøver. Alternative prober til ikke-mus og ikke-humane gener, såsom GFP kunne erstattes til påvisning af tumorceller, der er blevet mærket i overensstemmelse hermed, før indføring i musen.

En sekundær analyse blev også udført for at tilvejebringe en relativ kvantificering af den samlede tumor celleantal til stede i lungerne. Disse resultater er vist i figur 4. Her en standardkurve-analyse var parat til at bestemme den relative mængde HER2 normaliseret til GAPDH muselunge i en celle nummerserier. I teorien, dette gør det muligt for forskeren at bestemme den relative mængde af HER2 i 1x10 ^6, 1x10 ^5, 1x10 ^4, 1x10 > 3, 1x10 ² og 10 celler. Resultaterne viser, at QRT-PCR-proben og analyse udført var følsomme nok til at detektere HER2 niveauer så lave som 10-celler (figur 4A). De resulterende beregnede HER2 værdier blev afbildet på en log-skala og en enkel lineær regressionsanalyse blev anvendt til at bestemme den relative celleantal i hver lunge prøve, samt de positive og negative kontroller. Som vist i figur 4B, blev celle nummer specifikke værdier genereret for de eksperimentelle prøver.

Figur 1. Skematisk repræsentation af lunge dissektion og analyse. Musen lunge indeholder 5 lapper, som angivet ved det indsatte forstørret tegning. Fra dissektion til analyse af QRT-PCR procedure tager normalt 1-2 dage at gennemføre.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Gross analyse af metastase. (A) Repræsentative bioluminiscerende billeder af lunger fra dyr, der blev injiceret med 4T1-Luc celler og behandlet med enten placebo eller et testpræparat stof kaldet AKT1 der retter sig mod gap junction protein, connexin43. (B). Repræsentant H & E del af en mikrometastase i lunge af et dyr med en 4T1 tumor, der blev behandlet med AKT1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. repræsentant QRT-PCR-analyse. Søjlediagramrepræsenterer kvantificeret data fra QRT-PCR analyse af humant HER2, et gen er til stede i JIMT-1 human brystcancer cellelinje. Menneskelige HER2 niveauer i lungerne normaliseres til mus GAPDH. (+) Betegner positiv kontrol. (-) Betegner negativ kontrol. Resultaterne er plottet på en log-skala. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Repræsentative QRT-PCR-analyse fra celletal analyse. (A) graf, der repræsenterer HER2 niveauer i forhold til celleantallet mængde JIMT-1-celler fra 1x10 ^{6 til 10} celler. (B) søjlediagram, som viser de kvantificeret data fra QRT-PCR analyse af humant HER2, et gen er til stede i JIMT-1 humane bryst- kancer cellelinie. Menneskelige HER2 niveauer i lungerne normaliseres til mus GAPDH. (+) Betegner positiv kontrol. (-) Betegner negativ kontrol. Resultaterne er plottet på en log-skala. Klik her for at se en større version af dette tal.

Skabelon RNA	0,5-2 pg
iScript Supermix	4 pl / prøve
Nuklease-frit vand	op til 20 pl / prøve

Tabel 1. Syntese af første streng reaktionsblanding komponenter (trin 3.3.1).

ellpadding = "0" cellspacing = "0" fo: holde-together.within-side = "1" width = "397">

Trin 1: 25 ° C	5 min
Trin 2: 42 ° C	30 min
Trin 3: 85 ° C (terminering)	5 min

Tabel 2. PCR-betingelser for First Strand Synthesis (trin 3.3.3).

"> Nucleasefrit vand

iTAQ Master Mix	10 pl / prøve
Primer Mix	1 pl / prøve
op til 20 pl / prøve

Tabel 3. Real-time PCR-reaktion mix komponenter (trin 4.3).

Trin 1	Aktivering	95 ° C	2 min	1 cyklus
Trin 2	Denaturering	95 ° C	5 sek	40 cykler
	Annealing / Extension	60 ° C	30 sek
Trin 3	Smelt Curve (valgfrit)	65-95 ° C (0,5 trin)	5 sek / trin </ td>

Tabel 4. Real-time PCR-betingelser (trin 4.5).

Discussion

Denne protokol beskriver anvendelse af QRT-PCR at vurdere mamma tumorcellemetastase til lungen ved hjælp af et xenotransplantat musemodel. Det erkendes, at andre teknikker, herunder bioluminescerende billeddannelse, er tilgængelige og er også effektive til påvisning af metastaser trods deres egne værdier og begrænsninger. De fremlagte data viser, at QRT-PCR giver en effektiv foranstaltning til påvisning af tumor-afledte mRNA inden lungevæv til kvantificering af den samlede metastase. Det foreslås, at QRT-PCR-analyse tilvejebringer en sekundær fremgangsmåde, som kan supplere eller udføres i stedet for disse billeddannende teknikker. Denne teknik kan bedst egnet til forskningsmiljøer med begrænset adgang til visse former for udstyr eller til forskergrupper med særlige interesser i metastatisk byrde, men ikke detaljerede mekanistiske undersøgelser.

Mens informativ, den QRT-PCR-analyse er beskrevet her har begrænsninger. Det er ikke muligt at udføre yderligere nedstrømsanalyse, herunder immunhistokemi (IHC) eller immunofluorescens (IF) farvning, fordi hele lungevæv anvendes til RNA-isolering. Men hvis parret med en in vivo imaging teknik lungevævet kan isoleres post-billeddannelse til at udføre denne sekundære type analyse. Desuden er denne teknik begrænset til påvisning af mRNA og dermed proteinanalyse er kun mulig, en multi-prep isolationssæt anvendes til fremstilling af lungevævet. Analysen af ​​resulterende protein er stadig begrænset til at skulle evaluere en totalt protein mix, der omfatter tumoren og lungevæv alt i én, mens IHC / IF tillader brugeren at afgrænse proteiner farves i tumorvæv fra farvning fundet i muse væv baseret på visualisering af IHC / IF-farvning. Alternativ til anvendelse af hele lungen, vedligeholdelse halvdelen af ​​lungevævet for andre analyser såsom histologi kan være fordelagtig, men der er risiko for modstridende resultater, hvis metastaser identificeres i en del af lungen og ikke the anden.

Flere punkter af modifikation og fejlfinding anbefales. Nøjagtigheden af ​​QRT-PCR data er afhængig af primer-probe, der er valgt til analyse og optimering af prober anbefales herunder anvendelse af en passende standardkurve analyse for transkript kvantificering. Derudover er det vigtigt at måle kvalitet RNA, isoleres. Over-fordøjelse af væv med proteinase K kan reducere RNA kvalitet og dermed anbefales optimering baseret på det specifikke væv af interesse og en fremgangsmåde til RNA-fremstilling. Vælge en passende rengøring henvisning genet er også vigtig. Mens GAPDH er et almindeligt anvendt henvisning genet, hvert gen tjener en normal funktion i den celle, der kunne ændres på grund af eksperimentelle betingelser (dvs. den genetiske modifikation af værtsdyr, såsom gen knockout) og dermed alternative valg er nyttige. Nogle fælles referencepunkter gener, der rapporteres at have allestedsnærværende expression og lav variation i mængde er generne, der koder TATA-box-bindingsprotein (TBP), retinitis pigmentosa 2 (Rp2), Actin-lignende protein (lov), og Tubby todelt transkriptionsfaktor (Tub) ^11. Endvidere er de kritiske trin, der sikrer nøjagtig analyse omfatter nøjagtig dissektion og vask af lungen (trin 1.2.2-1.2.6), korrekte kvantificering af det totale RNA isoleret (trin 3.2), og nøjagtig pipettering under QRT-PCR opsætning (trin 4.4). Anvendelse af en gentagelse pipette kan støtte i denne proces.

Sammenfattende denne protokol har til formål at vise, at QRT-PCR er en kvantificerbar metode til at identificere lungemetastaser. Både positiv værdi og begrænsninger er identificeret med brugen af ​​denne procedure, og det kan være bedst egnet til at blive parret med en sekundær analysemetode. Imidlertid kunne denne metode være en ligetil procedure for kvantificering for dem forskning LABORATORerne med specifikke forskningsbehov eller mangel på omfattende udstyr til at undersøge metastaser. . Fremtidige anvendelser af denne fremgangsmåde indbefatter modifikation til at søge metastaser i målorganer uden lungen, såsom lymfeknude eller hjerne, som er andre almindelige steder for metastaser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG