Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) gebruikt om tumorcel specifieke mRNA die metastase in de muis longweefsel detecteren.
Abstract
Metastatische ziekte is de verspreiding van kwaadaardige tumorcellen uit de primaire kankertype naar een verre orgaan en is de primaire oorzaak van kanker-geassocieerde overlijden 1. Voorkomende plaatsen van metastatische verspreiding omvatten longen, lymfeklieren, hersenen en bot 2. Mechanismen die metastase rijden zijn intense gebied van kankeronderzoek. Bijgevolg effectieve assays voor uitgezaaide last te meten in verre plaatsen van metastase zijn instrumenteel voor kankeronderzoek. Evaluatie van longmetastasen in borsttumor modellen wordt in het algemeen uitgevoerd door het bruto kwalitatieve observatie van longweefsel na dissectie. Kwantitatieve evaluatie van metastasen momenteel beperkt tot ex vivo en in vivo imaging gebaseerde technieken die gebruiker gedefinieerde parameters vereisen. Veel van deze technieken zijn op het hele organisme niveau in plaats van het cellulaire niveau 3-6. Hoewel nieuwere beeldvormende methoden gebruik te maken van multi-foton microscopie zijn in staat om metas evaluerenTasis op cellulair niveau 7, deze zeer elegante procedures zijn meer geschikt voor het evalueren mechanismen van verspreiding dan kwantitatieve beoordeling van metastatische belasting. Hier is een eenvoudige in vitro werkwijze kwantitatief beoordelen metastase gepresenteerd. Met behulp van kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcel specifieke mRNA worden gedetecteerd in de muis longweefsel.
Introduction
QRT-PCR analyse is voorgesteld als een werkwijze voor het beoordelen van tumormetastase. Deze werkwijze is voorgesteld als een alternatief voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in de beoordeling metastase zijn slechts toegankelijk voor bepaalde apparatuur niet zoals in vivo beeldvormende apparatuur of fluorescentie staat stereoscoop. Een bespreking van de meest gebruikte methoden gepresenteerd, gevolgd door een demonstratie van hoe QRT-PCR-analyse kan worden gebruikt als een afzonderlijke of als gezelschap methode om metastase te beoordelen. Deze procedure heeft het potentieel om een kwantitatieve analyse van metastatische belasting verschaffen.
Standaardmethoden van de bruto-analyse, met inbegrip van visualisatie van de longen onder een stereomicroscoop evenals seriële snijden, gevolgd door hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van longweefsel, kwantificeerbaar zijn maar sterk afhankelijk van door de gebruiker gedefinieerde parameters voor het tellen van 2-5. Bij de evaluatie van hele longen met behulp van een stereomicroscoop, alleen grote oppervlakte uitzaaiingen zijn visible en analyse vereist de onderzoeker om een redelijke kennis van de long anatomische structuur te bepalen wat een metastatische laesie te hebben. Fluorescentielabelling van tumorcellen met een merker zoals GFP en het gebruik van een stereomicroscoop met een lichte kubus met de geschikte excitatie- / emissie maxima (bijv nabij 470/510 nm voor GFP) bevat helpt bij dit proces, maar alleen aan de oppervlakte tumornoduli detecteerbaar . Bovendien fluorescentie van bloed verontreinigingen, die zichtbaar worden onder dezelfde parameters als GFP is, kan leiden tot vals identificeren van mogelijke metastatische laesies.
Snijden van de long, gevolgd door H & E kleuring long metastase visualiseren is een nuttige methode om micrometastasen en andere microscopische processen zoals immune infiltratie te evalueren, maar het gebruik van de gehele long weefsel voor inbedden in paraffine, snijden en kleuringen vereist vaak. Daarom stroomafwaartse procedures niet ideaal na deze method. Hoewel kwantificeerbaar, vereist deze procedure de onderzoeker een groot aantal gekleurde longsecties per dier evalueren om te garanderen dat de analyse rekening voor de gehele 3D-structuur van de longen. Bijgevolg is dit type onderzoek is tijdrovend, kan leiden tot het tellen fout, en analyse leunt zwaar op de onderzoeker discretie.
Verscheidene in vivo beeldvormende technieken (bijvoorbeeld MRI, PET, SPECT) worden momenteel gebruikt uitvoeren of testen biologische processen in experimentele diermodellen 8. Bioluminescentie beeldvorming is een gemeenschappelijke methode om een bruto weergave van metastase 9 verwerven. Deze techniek wordt algemeen op de aanwezigheid van luciferase-reporter-activiteit te evalueren als gevolg van de accumulatie van tumorcellen die zijn ontworpen om een luciferase responselement bevatten, die in bepaalde organen zoals de melkklier na tumorcel implantatie en de longen op spontane metastase verblijven 10. Visualisatie van luciferase-activiteit wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van luciferine substraat (D-luciferine). Luciferase katalyseert de oxidatieve decarboxylering van D-luciferine tot oxyluciferine genereren bioluminescentie. Terwijl informatief, is deze werkwijze beperkt door verscheidene factoren, waaronder substraat stabiliteit (bijv korte halfwaardetijd), adequate verdeling van substraat hangt af van hoe het wordt geleverd aan proefdieren en lage detectiegevoeligheid 9. Een belangrijke verdienste van deze techniek is dat het niet-invasief kan worden uitgevoerd op levende dieren, en kan leiden tot de detectie van tumorcellen metastasen in meerdere organen die niet zijn normaliter geoogst dissectie 9,10.
Een positief aspect van in vivo imaging technieken is dat het longweefsel wordt ongestoorde waardoor secundaire procedures zoals paraffine inbedding of zoals hier gepresenteerd, QRT-PCR-analyse. Omdat QRT-PCR theoretically een gevoeligere maat voor detectie bruto evaluatie niet gering aantal tumorcellen in de long zichtbaar. Hoewel nuttig, kan de beeldvormende technieken hierboven beschreven gesubstitueerd of aangevuld met QRT-PCR methode die momenteel beschreven. QRT-PCR heeft het potentieel om een gevoelige maatstaf van tumor afgeleide mRNA binnen een long.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen en verzorging van dieren normen van de Medische Universiteit van Zuid-Carolina (MUSC) en de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1. Lung Dissection
- Borsttumor dissectie (optioneel afhankelijk van de studie doelen en of de primaire tumor analyse of staartader injectie werd uitgevoerd).
- Euthanaseren muis met behulp van een dodelijke dosis van isofluraananesthesie volgens IACUC en universitaire regelgeving. Bevestig euthanization door chirurgische dislocatie.
- Op schuim aan boord, pin met dissectie pinnen door het plaatsen van de muis op zijn rug met de ledematen gespreid.
- Spray muis met 70% ethanol.
- Met behulp van een tang, pakt het onderste gedeelte van het dier in het centrum.
- Met behulp van schaar, sneed omhoog in de richting van de hals door de huid, zorg dat u de buikholte van de muis niet te doorboren.
- Bezuinigen huid op de ledematen om tumorweefsel te onthullen.
- Ontleden tumorweefsel en preserve door voorkeursmethode, zoals bevriezing en fixatie, voor verdere analyse (niet verder in dit protocol besproken).
- Longweefsel dissectie.
- Als tumorweefsel werd geoogst zoals hierboven beschreven, vastpinnen overtollige huid.
- Met behulp van een tang, grijpen peritoneum aan ondereinde van het dier gaan knippen opwaarts naar de basis van de hals.
- Knip voorzichtig langs de linker en rechterkant van de ribbenkast en voorzichtig om te voorkomen dat eventuele bloedvaten die kan bloeden in de borstholte verbreken. Verwijder de ribben door het snijden naar links en rechts door het membraan en bovenste gedeelten van de ribbenkast.
- Met behulp van een tang grijpen van de luchtpijp van de muis en trek naar voren.
- Sever de luchtpijp met dissectie schaar en verwijder de longen van de muis.
Let op: kan het hart verbonden aan de longen blijven. Als dit gebeurt, zorgvuldig ontleden hart weg van de longen voorzichtig om alle vijf lobben te verzamelen (zie figuur 1 - Was voorzichtig met PBS om overtollig bloed te verwijderen.
- Bruto evaluatie van longweefsel.
- Optie 1: In vivo beeldvorming.
- Voor luciferase imaging, ~ 10 min voor beeldvorming, geven de dieren een 150 mg / kg dosis van luciferine door intraperitoneale (ip) injectie. Afbeelding longen in vivo verdoofde dieren of bij verwijdering na sectie (figuur 2) 5.
- Optie 2: Bruto evaluatie.
- Onderzoek longen onder stereo microscoop om tumoren te visualiseren. Opmerking: Als cellen GFP label, kan een fluorescentie staat stereomicroscoop met een lichte kubus met de juiste excitatie / emissie maxima (bijvoorbeeld in de buurt van 470/510 nm) om GFP te detecteren worden gebruikt om de longen stereoscopisch onderzoeken voor fluorescentie voorafgaand aan de verwerking.
- Als longen zijn om onmiddellijk te worden geanalyseerd, gaat u naar sectie 'RNA Isolation'. Anders snap bevriezen weefsel met behulp van vloeibare zeeid stikstof of droogijs. Bewaren bij -80 ° C.
- Optie 1: In vivo beeldvorming.
2. RNA Isolation
Opmerking: Voor de representatieve analyse werd RNA geïsoleerd met behulp van een RNA-isolatie kit (zie Materials List). Terwijl de huidige analyse gebruikt product een bepaalde fabrikant, diverse isolatie kits zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers betrouwbare. Bovendien, non-kit gebaseerde centrifugeren methoden zijn ook mogelijk. cDNA tevens bereid vanuit een positieve controle RNA-monster, bijvoorbeeld een cellijn of plasmide voor standaard curve analyse. Als alternatief kan een positieve controle specifiek voor de primer probe set worden aangeschaft (zie Materials List).
- Bij gebruik van eerder ingevroren weefsel, verzamelen bevroren weefsel op droog ijs.
- Homogeniseren weefsel met behulp van een van de volgende methoden zoals: mortier en stamper slijpen uitgevoerd door de hand over droog ijs na het bevriezen van weefsel in vloeibare stikstof; weefselhomogenisator of mechanische dissociatie apparaatper suggestie fabrikant; sonicatie of andere voorkeurswerkwijze.
Opmerking: Voor de vertegenwoordiger van de analyse, de voorkeur van homogenisering is sonicatie.- Voor de in figuur 3 analyse bereiden lysis buffer (verschaft in RNA isolatie kit) en 2-mercaptoethanol in een verhouding van 20 pl 2-mercaptoethanol voor elke 1 ml lysisbuffer. Resuspendeer weefsel in 300 pi lysisbuffer aangevuld met 2-mercaptoethanol per 30 g weefsel en ultrasone trillingen gedurende 10 sec met sonicator vastgesteld op 30% amplitude.
- Bij gebruik van mortier en stamper, resuspendeer grond weefsel in 300 pi lysisbuffer na het slijpen.
- Voeg 10 ul proteinase K tot 590 gl TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Voeg 600 ul proteinase K oplossing voor elke 300 gl (dat wil zeggen voor elk 30 mg) weefsel. Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
Opmerking: De spijsvertering kan variëren. - Centrifugeer monsters bij ≥13000 g gedurende 10 minuten om vuil te verwijderen.
- Breng supernatant nieuwe buizen.
- Voeg 450 pl ethanol (96% -100%) per 900 pl supernatant precipiteren RNA.
- Breng 700 pi van het lysaat / ethanol mengsel aan de kolom.
- Centrifugeer monsters bij ≥13,000 g gedurende 1 min om RNA te binden aan de kolom.
- Gooi vloeibaar afval en voeg de resterende supernatant naar kolom en spin weer.
- Zodra alle lysaat wordt gesponnen door de kolom, voeg 350 ul wasbuffer 1 naar het bovenste gedeelte van de kolom en centrifugeer monsters bij ≥13,000 g gedurende 30 sec.
- Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte.
- Bereid DNase door 5 eenheden DNase I enzym met 5 ui 10X DNase en 40 gl DNase / RNase vrij water per monster (totaal volume van 50 ul / monster).
- Voeg 50 ul DNase mengen om elke kolom en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 350 ui wasbuffer 1 kolom en centrifugeer samselen bij ≥13,000 g gedurende 30 sec.
- Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte.
- Voeg 600 ui wasbuffer 2 aan de kolom en spin 30 sec bij ≥13,000 g.
- Gooi vloeistof uit kolom en vervang bovenste gedeelte.
- Voeg 250 ui wasbuffer 2 en centrifugeer gedurende 2 min bij ≥13,000 g.
- Zet een deel van de kolommen in de nieuwe collectie buis en oude collectie buis weggooien.
- Voeg 50-100 ul van RNase / DNase-vrij water kolom en incubeer gedurende 1 min.
- Spin gedurende 1 min bij ≥13,000 g.
- Re-run verzameld eluaat door de kolom om RNA opbrengst te verhogen.
- Voor onmiddellijk gebruik, houden monsters op ijs en overgaan tot kwantificering. Voor later gebruik, snap bevriezen van droogijs of vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 ° C vriezer totdat het nodig is.
3. First Strand Synthesis
Opmerking: de representatieve analyse het reverse transcriptase (RT) reactie uitgevoerd een First Strand cDNA synthese kit ontworpen voor QRT-PCR (zie Materials List).
- Als monsters die eerder werden verzameld, ontdooien buizen op ijs.
- Meet RNA hoeveelheid met behulp van een spectrofotometer.
- Met behulp van 0,5-2 ug totaal RNA, voeren de eerste streng synthese met behulp van reverse transcriptase om cDNA voorraad genereren.
- In steriele, RNase / DNase-vrij PCR tubes / platen bereiden het reactiemengsel (tabel 1). Meng voorzichtig en centrifuge. Programmeer een standaard PCR machine (tabel 2).
- Verdunnen afgewerkte reactie gewenste volume (meestal 50-100 pi) met steriele nuclease-vrij water.
4. Real-time PCR
Opmerking: Voor de representatieve analyse werd SYBR groen gebruikt. Echter kan elke voorkeurswerkwijze worden vervangen naar keuze van de gebruiker.
- Met behulp van een positieve controle cDNA, het opzetten van een standaard curve voor elke primer set.
- Voor de analyse getoond in figuur 3, de voorbereiding van de standaard curve voor menselijke HER2 met de fabrikant aanbevolen positieve controle cDNA (zie Materials List). Voor muis GAPDH, met de negatieve controle long cDNA van een standaardcurve. Voor elke probe, serieel verdunnen cDNA 1: 4-5 normen genereren.
- Bereken het totale aantal monsters dat moet de standaardkromme en experimentele monsters.
Opmerking: Voor de hier beschreven analyse, werden 2-3 experimentele herhalingen per monster geanalyseerd. Standaard curve analyse werd uitgevoerd om een eenvoudige lineaire regressiemodel dat kan worden toegepast om te bepalen de relatieve hoeveelheid HER2 en GAPDH per monster genormaliseerd uiteindelijke hoeveelheid berekenen genereren. Deze analyse zal er ook voor zorgen dat de primer efficiëntie is voldoende voor de analyse bij de hand. - In een steriele, RNase / DNase-vrij buis bereiden master mix (Tabel 3).
- Bereken master mix amount per monster. Opschalen voor meer dan één monster. Gebruik een master mix voor elke experimentele gen van belang, evenals een interne controle zoals GAPDH. Gebruik voor GAPDH primers in een uiteindelijke concentratie van 200 nM.
Opmerking: De interne controle is vooral handig wanneer het proberen om onderscheid te maken tussen mens en muis cel oorsprong.
Opmerking: Primer concentratie HER2 werd bepaald en geoptimaliseerd door de fabrikant.
- Bereken master mix amount per monster. Opschalen voor meer dan één monster. Gebruik een master mix voor elke experimentele gen van belang, evenals een interne controle zoals GAPDH. Gebruik voor GAPDH primers in een uiteindelijke concentratie van 200 nM.
- Bereid testplaat met 1 pl cDNAs overeenkomt met elke standaard of experimentele monster. Goed toe te wijzen ten minste 1 cDNA monster / voor elke primer sonde. Voeg 19 ul van de master mix per putje voor elke primer sonde.
Opmerking: de representatieve gegevens in Figuur 3 werden de cDNA monsters in duplo geanalyseerd voor elke primer probe en geplot als gemiddelde van de twee monsters. - Run reactie in QRT-PCR machine met aanbevolen of eerder geteste PCR-protocol. Zie tabel 4 gegevens in Figuur 3 en figuur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbij de tijd die nodig is om de initiële inoculatie van tumorcellen te voeren in het proefdier en zo uitvoeren, de primaire tumor in vivo analyse van het weefsel oogst, RNA-isolatie en QRT-PCR analyse een 1-2 dagen procedure (figuur 1) .
Een voorbeeld van grove analyse bioluminescentie beeldvorming tumorcellen te evalueren in het longweefsel. Hier werd een borstklier tumorgenese experiment uitgevoerd om te evalueren of een experimenteel middel dat de gap junction eiwit connexin43, genaamd ACT1 gericht, spontane metastase van 4T1-luc mammaire tumorcellen voor de long zou schaden. Na enkele weken behandeling, dieren die placebo of het testmiddel ontvingen werden geïnjecteerd met luciferine en geofferd. Na dissectie werden de longen gevisualiseerd op luciferase bioluminescentie. Van de vertegenwoordiger van de beelden blijkt dat de longen van de drugbehandelde dieren negatief voor luciferase activiteit die aangeeft dat er geen tumorcellen aanwezig in de longen, suggereert een remming van metastase na ACT1 behandeling (Figuur 2A). Het belangrijkste doel van deze representatieve beelden is aan te tonen dat bioluminescentie beeldvorming is een geschikte methode van detectie voor metastase. Echter, na grondig onderzoek van H & E secties van longen van dieren die met ACT1, micrometastasen werden geïdentificeerd die niet zijn verlicht door de luciferase imaging (figuur 2B), misschien suggereert dat dit type beeldvorming niet gevoelig genoeg zijn om lage aantallen tumor detecteren cellen ingebed in de longen. Idealiter zou een begeleider analysis for QRT-PCR worden uitgevoerd om deze resultaten te bevestigen.
De QRT-PCR analyse die hier gebruikt een probe specifiek voor humaan HER2 met humane tumorcellen te detecteren in de longen van HER2 + JIMT-1 cellen dieOorspronkelijk werden getransplanteerd in het uiervet pad van gastheerdieren (figuur 3). Metastase opgetreden spontaan na de ontwikkeling van tumoren. Na dissectie, wanneer bekeken onder een stereomicroscoop, geen grove zichtbare metastasen werden waargenomen op elk van de longen. Op basis van de volgende QRT-PCR-analyse blijkt dat twee van de elf longen geoogst van tumordragende dieren geherbergd metastasen, aangegeven met pijlen in figuur 3, wat suggereert dat tumorcellen die werden onopgemerkt door visualisatie aanwezig zijn. cDNA verkregen uit een stuk JIMT-1 afgeleide tumor werd gebruikt als een positieve controle voor HER2 expressie (Figuur 3, (+)) en een long van een muis die niet is geïnjecteerd met tumorcellen werd gebruikt als negatieve controle (Figuur 3, (-)). Een muis specifieke probe voor GAPDH werd gebruikt als een interne controle om het aandeel van humane tumorcellen aan totale muizen longweefsel bepaald. De positieve controlemonster werd genormaliseerd op het GAPDH niveau van de controle longen als referentie. Een alternatieve normaliseringsstreven zou zijn om de hoeveelheid GAPDH gemiddelde over alle long monsters meer consistente normalisatie niveaus controlemonsters verkrijgen. Alternatief probes voor niet-muis en niet-humane genen zoals GFP kan worden vervangen tumorcellen die dienovereenkomstig zijn gelabeld vóór inbrengen in de muizen te detecteren.
Een tweede analyse werd uitgevoerd om een relatieve kwantificering van totaal aantal tumorcellen in de longen te verschaffen. Deze resultaten worden weergegeven in figuur 4. Hier wordt een standaardcurve analyse bereid was de relatieve hoeveelheid HER2 genormaliseerd op GAPDH muislong in een aantal cellen serie bepalen. In theorie, dit stelt de onderzoeker om de relatieve hoeveelheid HER2 bepalen 1x10 6, 5 1x10, 1x10 4, 1x10
Figuur 1. Schematische weergave van de long dissectie en analyse. De muislong bevat 5 lobben, zoals aangegeven door de inzet vergroot tekening. Dissectie van de analyse van de QRT-PCR procedure duurt meestal 1-2 dagen in beslag.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Bruto analyse van metastase. (A) Representatieve bioluminescente beelden van longen van dieren die werden geïnjecteerd met 4T1-luc cellen behandeld met placebo of een experimenteel geneesmiddel genaamd ACT1 de gap junction eiwit, connexin43 gericht. (B). Representatieve HE-gedeelte van micrometastasen in het long van een dier met een 4T1 tumor die werd behandeld met WERKW1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger QRT-PCR-analyse. Grafiekdie de gekwantificeerde gegevens van de QRT-PCR analyse van humane HER2, een gen aanwezig in het JIMT-1 humane borstkanker cellijn. Menselijk HER2 niveaus in de long zijn genormaliseerd om de muis GAPDH. (+) Geeft positieve controle. (-) Geeft negatieve controle. De resultaten worden uitgezet op een log-schaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve QRT-PCR-analyse van celaantal analyse. (A) Grafiek die HER2 niveaus in verhouding tot het aantal cellen hoeveelheid JIMT-1 cellen van 1x10 6 tot 10 cellen. (B) Grafiek die de gekwantificeerde gegevens uit het QRT-PCR analyse van humane HER2, een gen aanwezig in het JIMT-1 menselijke borst kancer cellijn. Menselijk HER2 niveaus in de long zijn genormaliseerd om de muis GAPDH. (+) Geeft positieve controle. (-) Geeft negatieve controle. De resultaten worden uitgezet op een log-schaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Template RNA | 0,5-2 ug |
| iScript Supermix | 4 ul / monster |
| Nuclease-vrij water | tot 20 ul / monster |
Tabel 1. First Strand Synthesis reactiemix componenten (stap 3.3.1).
| Stap 1: 25 ° C | 5 minuten |
| Stap 2: 42 ° C | 30 min |
| Stap 3: 85 ° C (ontbinding) | 5 minuten |
Tabel 2. PCR voorwaarden voor First Strand Synthesis (stap 3.3.3).
| ItaQ Master Mix | 10 ul / monster |
| Primer Mix | 1 ul / monster |
| tot 20 ul / monster |
Tabel 3. Real-time PCR reactiemix componenten (stap 4,3).
| Stap 1 | Activering | 95 ° C | 2 min | 1 cycle |
| Stap 2 | Denaturatie | 95 ° C | 5 sec | 40 cycli |
| Annealing / Uitbreiding | 60 ° C | 30 sec | ||
| Stap 3 | Smelten Curve (optioneel) | 65-95 ° C (stappen van 0,5) | 5 sec / stap </ td> |
Tabel 4. Real-time PCR-omstandigheden (stap 4,5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van QRT-PCR om mammaire tumorcelmetastase evalueren aan de longen met een xenograft muismodel. Er wordt erkend dat andere technieken, zoals bioluminescentie beeldvorming, zijn beschikbaar en zijn ook effectief voor het detecteren van metastasen ondanks hun eigen waarden en beperkingen. De gepresenteerde gegevens suggereren dat QRT-PCR een effectieve maatregel detecteren tumor afgeleide mRNA in longweefsel voor kwantificering van totaal metastase. Voorgesteld wordt QRT-PCR analyse een secundaire methode kan als aanvulling op of in plaats van deze technieken worden uitgevoerd. Deze techniek kan het best geschikt is voor het onderzoek omgevingen met beperkte toegang tot bepaalde apparatuur of voor onderzoek groepen met specifieke belangen in uitgezaaide last, maar niet gedetailleerd mechanistische studies.
Terwijl informatief, de QRT-PCR-analyse die hier beschreven heeft beperkingen. Het is niet mogelijk om stroomafwaarts voeren aanvullendeanalyse, met immunohistochemie (IHC) of immunofluorescentie (IF) kleuring omdat het hele longweefsel wordt gebruikt voor RNA-isolatie. Indien gecombineerd met in vivo beeldvormende techniek het longweefsel worden geïsoleerd na beeldvorming die secundaire type analyse. Ook is deze techniek beperkt tot het detecteren van mRNA en dus eiwitanalyse is niet mogelijk als multi-prep isolatie kit wordt gebruikt om het longweefsel bereiden. De analyse van de resulterende eiwit is nog steeds beperkt tot het hebben van een totale eiwit mix die de tumor en longweefsel omvat in één evalueren terwijl IHC / IF kan de gebruiker de eiwitten gekleurd met tumorweefsel afbakening van kleuring in muis weefsel op basis van de visualisatie van de IHC / IF kleuring. Alternatief voor het gebruik van de gehele long, handhaven de helft van het longweefsel voor andere analyses zoals histologie kan gunstig zijn, maar dreigt tegenstrijdige bevindingen als metastasen geïdentificeerd in een deel van de long en niet the andere.
Een aantal punten van de wijziging en het oplossen van problemen worden aanbevolen. De nauwkeurigheid van de QRT-PCR data afhankelijk van de primer probe die wordt gekozen voor de analyse en optimalisatie van probes wordt aanbevolen inclusief het gebruik van een geschikte standaardcurve analyse voor kwantificering transcript. Daarnaast is het belangrijk om de kwaliteit van het RNA dat is geïsoleerd meten. Over-digestie van weefsel met proteinase K RNA kwaliteit te verminderen en aldus optimalisatie aanbevolen op basis van het specifieke weefsel plaats en wijze van RNA-bereiding. Kiezen van een geschikte referentie housekeeping gen van belang. Terwijl GAPDH is een veel gebruikte referentie-gen, elk gen wordt een normale functie in de cel kan worden gewijzigd als gevolg van experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld genetische modificatie van gastheerdieren zoals knockout) en daarmee alternatieve keuzes bruikbaar. Een aantal gemeenschappelijke referentie genen die worden gemeld aan alomtegenwoordige uitdrukkelijke hebbenion en lage variatie in hoeveelheid zijn de genen die coderen TATA-box bindende eiwitten (tbp), Retinitis pigmentosa 2 (Rp2), Actin-achtig eiwit (Act), en Tubby bipartiete transcriptiefactor (bad) 11. Bovendien is de kritische stappen die nauwkeurige analyse verzekeren onder nauwkeurige dissectie en wassen van de long (stap 1.2.2-1.2.6), correcte kwantificering van de totale RNA geïsoleerd (stap 3.2), en nauwkeurig pipetteren tijdens de QRT-PCR setup (stap 4.4). Gebruik van een herhaling pipet kan helpen bij dit proces.
Kortom, dit protocol wil demonstreren dat QRT-PCR is een methode om meetbare longmetastasen identificeren. Zowel positieve waarde en beperkingen worden geïdentificeerd met behulp van deze procedure kan het best geschikt zijn om te worden gecombineerd met een secundaire analysemethode. Toch zou deze methode een straight forward procedure van kwantificering voor degenen onderzoek laboratories met specifieke behoeften aan onderzoek of het ontbreken van uitgebreide apparatuur om metastase te onderzoeken. . Toekomstige toepassingen van deze methode zijn modificatie te zoeken uitzaaiingen in doelwitorganen buiten de long, zoals lymfeknopen of de hersenen, die andere gemeenschappelijke plaatsen van metastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ESY en MAA zijn niet in dienst van FirstString Research Inc. en hebben geen financieel belang in de onderneming niet in het bezit. FirstString Research Inc., mits de luciferase beeldgegevens die werd gepresenteerd in dit manuscript. GSG is voorzitter en CEO van FirstString Research. CLG is een werknemer van FirstString Research. GSG en CLG hebben aandelenopties uitgegeven door FirstString Research.
Acknowledgments
De Yeh lab wordt ondersteund door de financiering van onderzoek van een American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG-97-219-14) toegekend aan de Hollings Cancer Center op MUSC, door de financiering van onderzoek van het Ministerie van Defensie subsidie (W81XWH-11-2- 0229) op MUSC, en door een award van het Concern Foundation (tot ESY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J.
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).
- Saxena, M., Christofori, G.
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).
- Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis. Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).
