Introduction
الحليب هو المصدر الوحيد لتغذية الثدييات حديثي الولادة، وتوفير الطاقة والمواد المغذية للنمو الرضع و1،2 التنمية. بينما الحليب يتكون أساسا من الخلايا، والدهون، والبروتين 1، كما أنه يحتوي على عدد كبير من المركبات النشطة بيولوجيا التي تعدل تطوير الحياة في وقت مبكر من ذرية بما في ذلك الإنزيمات، الكربوهيدرات، الهرمونات، والأجسام المضادة، عوامل النمو، السيتوكينات، exosomes، microvesicles، والرنا صغيرة من هذا القبيل كما الرنا الميكروي 1،2. الدور الأساسي للحليب الأم في إنشاء ذرية المناعة، وصحة الأمعاء 3، بالإضافة إلى أدلة على أن الرضاعة الطبيعية الرضع أقل عرضة للإصابة بالأمراض 2، يسلط الضوء على أهمية تحديد مكونات الحليب المرتبطة بعمليات المرض في وقت مبكر من الحياة والآليات الجزيئية المشاركة في أعمالهم. الفئران النامية هو نموذج شعبية للتحقيق في تأثير مختلف الغذائية والفسيولوجية، والتدخلات الكيميائية في وقت مبكرتطوير -life 4. ولذلك فإن تحليل الحليب الفئران توفير نظرة جديدة إلى صحة الأم والأبناء.
التقدم العلمي الحالية توفر الآن زيادة الفرص المتاحة للتحريات متعمقة للآثار مكونات الحليب محددة على الصحة والمرض. على سبيل المثال، تسلسل ملامح الحليب البكتيرية وتوضيح دورها في استعمار الامعاء في وقت مبكر للامعاء الرضيع 5، قدمت تحليل الطيف الكتلي من يغوساكاريدس الحليب التبصر في تغيير ملامح الحليب قليل السكاريد عن طريق النظام الغذائي للأم 6، وتسلسل عميق من الرنا الميكروي يفرز في كريات الدهون في حليب الأم يسلط الضوء على الأدوار المحتملة في النسخ الجيني، والتمثيل الغذائي، والوظيفة المناعية 7.
نماذج الفئران تمثل واحدة من الكائنات النموذج الأكثر شعبية المستخدمة في الدراسات الأمهات 8،9. ميزة واحدة هي قصيرة الحمل والرضاعة فترات، approximat فقط دائماعل 21 يوما لكل منهما؛ وبالتالي فإن الوقت الإجمالي من بداية الحمل إلى الرضاعة يمثل فترة قصيرة من الوقت الذي يمكن أن تتولد البيانات القيمة. حجم أكبر من الفئران بالمقارنة مع الفئران، في سياق جمع الحليب، يمكن أن توفر ميزة كبيرة من حيث الحجم من الحليب وسهولة جمع الحليب. إنتاج الحليب في الماوس، على سبيل المثال، يبدو أن تعتمد على وزن الجسم الكلي مع الفئران أثقل إنتاج المزيد من الحليب 10.
هنا، يتم توفير وصفا عاما لجمع اليدوي من الحليب من الفئران المرضعات. هذا البروتوكول يتطلب الحد الأدنى من المعدات، وغير الغازية، وغير مكلفة، ويمكن استخدامها لجمع كميات كافية من الحليب لإجراء المزيد من التحليلات المصب. وباختصار، هو تخدير السد مع isoflurane، يتم تحفيز الحليب خيبة أمل من قبل الأوكسيتوسين، ويتم جمع الحليب في الأنابيب الشعرية عن طريق التعبير المستعمل من الحليب. أخيرا، وكما عنصرين رئيسيين من الحليب والدهون والبروتينات، وdescriptio موجزويرد ن تقدير الحليب نسبة الدهون باستخدام قياسات creamatocrit 11 النوعي والكمي لتركيز البروتين الكلي باستخدام فحص البروتين القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل جامعة كالجاري جنة رعاية الحيوان ومطابقة للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. سد منفصلة من النسل
- فصل السد من نسلها مدة لا تقل عن 5 دقائق قبل الحلب 12.
ملاحظة: يمكن تحلب السد تصل إلى 5-6 ساعة بعد الانفصال 1،6،13، لكن فترات الانفصال أطول من 4 ساعات قد يغير تركيبة حليب 14. في حين لا يظهر الوقت الفاصل للتأثير حليب حجم جمع 12، وينصح أن الوقت الفاصل ثابت أن يستمر طوال فترة الدراسة. مكونات اللبن قد تتغير طوال الرضاعة 15، ولذلك ينبغي بذل المحاولات للحفاظ على يوم جمع الحليب ثابت. ويقترح إنتاج الحليب الأقصى أن يحدث في يوم الرضاعة 14 12. - باستخدام غرفة الاحتباس الحراري، وضمان الجراء هي قادرة على الحفاظ على الجسم السليم من درجات الحرارةإعادة دون وجود أمهم لمدة الإجراء حلب.
ملاحظة: في دراسة قدمت أدناه، تم تنفيذ حلب عند الفطام، عندما كانت السدود حوالي 22 أسابيع من العمر والنسل 21 يوما من العمر، وكان يستخدم لذلك لا غرفة الاحتباس الحراري.
2. مجموعة المتابعة والتحضير
- جمع كل المواد المطلوبة لإجراء حلب.
ملاحظة: جميع المواد يمكن العثور عليها في جدول المواد والمعدات. - وضع وسادة التدفئة على مقاعد البدلاء حيث الحلب ستجري وتغطي لوحة مع مقاعد البدلاء ماصة تحت وسادة.
- إعداد نظام مخدر. تأكد من أن النظام لديه الأكسجين والأيزوفلورين قبل بداية كاف. إرفاق قناع التخدير التي سيتم استخدامها لتحريض التخدير الأولي إلى الجهاز. وضع قناع التي سيتم استخدامها لصيانة التخدير قريب إذا كان مختلفا عن القناع مخدر الأولي.
- نعلق إبرة 25 G لحقنة 1 مل لالأوكسيتوسينالحقن باستخدام تقنية العقيم.
- بدوره على وسادة التدفئة بحيث يتم الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأمهات أثناء إجراء حلب. ملاحظة: رصد درجات الحرارة لوحة التدفئة لضمان لوحة لا تصبح ساخنة جدا ويسبب حروقا. بدلا من ذلك، استخدام مصدر الحرارة، مثل طاولة الجراحة ساخنة، التي يمكن تعيينها إلى درجة حرارة معينة.
3. تخدير السد عن طريق الأيزوفلورين
- فتح خزان الأوكسجين وتحويل تدفق إلى 1 L (1000 سم مكعب) لكل دقيقة. بدوره على تدفق الأيزوفلورين وتعيين إلى 5٪. تنبيه: تجنب استنشاق المباشر للمخدر ومنع تراكم أبخرة مخدر.
- تخدير السد.
- التحول إلى قناع الصيانة إذا لزم الأمر، ووضع مستلق سد على وسادة مقعد ماصة. تأكيد تخدير بسبب نقص دواسة المنعكس.
- الحد من تدفق الأيزوفلورين إلى 2-3٪ للصيانة من التخدير. باستمرار مراقبة السد في جميع أنحاء الداخلي لضمان المساواةلا يحدث الضغط والتنفس. ملاحظة: مرة واحدة تحت التخدير، وينبغي حماية العينين السد باستخدام مواد التشحيم العين عقيمة لمنع العينين من الجفاف أو أن تصبح خدش.
4. حقن الأوكسيتوسين
- ضمان الأوكسيتوسين (20 USP وحدة / مل) لم يجتز تاريخ انتهائها. تطهير القارورة من الأوكسيتوسين مع الكحول المعقم مسح / الكحول وسادة التطهير.
- باستخدام تقنية العقيم، ووضع 2 وحدة دولية (0.1 مل) من الأوكسيتوسين في حقنة. استخدام إبرة جديدة والمحاقن لكل السد التي سيتم تحلب.
ملاحظة: الأوكسيتوسين جرعات تتراوح عادة من الحقن واحدة من 1-5 وحدة دولية 1،6،12،16. بدلا من ذلك، جرعة من 4 وحدة دولية / كجم من وزن الجسم يمكن استخدام 12. جرعة واحدة من 2 وحدة دولية يمكن أن يتكرر مرة واحدة إذا واجهت صعوبة في حلب. - حقن الأوكسيتوسين البريتونى. ادخال الإبرة في الربع السفلي الأيمن من البطن، حيث يشير الإبرة نحو الرأس، في زاويةمن 15-30 درجة مئوية، حوالي 0.5 سم عمق.
- سحب على المكبس لضمان الضغط السلبي قبل الحقن. إذا كان يستنشق أي السائل (الدم والبول، ومحتويات الأمعاء، وما إلى ذلك) في حقنة، وإزالة الإبرة ومحاولة حقن بإبرة جديدة والمحاقن. إذا كان يستنشق أي سائل حقن الأوكسيتوسين والتخلص من الإبر والمحاقن مباشرة في وعاء واقية.
- انتظر حوالي 5-15 دقائق لالأوكسيتوسين لتحفيز الحليب خيبة أمل.
5. إعداد مواقع حلب
- اختيار المواقع / الحلمات التي سيتم جمع الحليب. الحليب يمكن جمعها من أي حلمة 12.
- بلطف إزالة الفراء حول الحلمات أن تحلب مع قادين، والفراء قد يسبب صعوبة في جمع العينات بسبب فتل من الحليب. أن يكون لطيف - الجلد حول الحلمات حساسة للغاية ويمكن أن تكون جافة وبالتالي هو عرضة للخدوش والدموع.
- تعقيم ط حلمةليس ضروريا، ولكن بشكل اختياري، وتنظيف حلمة بماء فاتر بعد إزالة الفراء. إعداد موقعين على الأقل كما قد تكون هناك حاجة لجمع الحليب أكثر من موقع.
ملاحظة: إذا كان تحليل الحليب ويشمل التنميط الميكروبية، قد تتطلب منطقة حلمة التعقيم مع اليود 5.
6. جمع الحليب
- الضغط بلطف على قاعدة حلمة، وطرد الحليب لجمع يدويا.
ملاحظة: إذا كان تحليل الحليب ويشمل التنميط الميكروبي، ينبغي التخلص منها قطرات القليلة الأولى من الحليب. - جمع قطرات الحليب في أنبوب شعري، وملء الأنبوب الشعري. الأنابيب الشعرية التي تستوعب كميات أكبر (على سبيل المثال، 50 ميكرولتر) تسهيل عملية.
ملاحظة: إذا واجهت صعوبة في جمع الحليب، يمكن أن تدار جرعة ثانية من الأوكسيتوسين. فمن المستحسن جرعة لا يتجاوز 4 وحدة دولية المجموع. - الاستغناء عن الحليب من الأنابيب الشعرية إلى أنبوب microcentrifuge العقيمة التي كتبهالمس نهاية الأنبوب الذي تم استخدامه لرسم الحليب من حلمة إلى جانب أنبوب microcentrifuge - مراقبة الحليب يسحبها من الأنابيب الشعرية عبر العمل الشعري.
ملاحظة: 'ضربة من "الحليب التي لم يتم رسمها في أنبوب باستخدام إبرة 18 G تعلق على حقنة 1 مل. - باستمرار مراقبة السد لعلامات الألم أو صعوبة التنفس وضبط تدفق الأيزوفلورين وفقا لذلك.
- مواصلة جمع الحليب كما هو موضح في هذا القسم حتى تم جمع كمية كافية من الحليب لتحليل الحليب الذي تم اختياره. لcreamatocrit والبروتين تقرير تركيز هو موضح أدناه، وجمع 0.25 مل من الحليب.
ملاحظة: استخدم موقع حلب مختلف إذا حليب خيبة أمل تبطئ أو الموقع المختار لا تطرد الحليب بما فيه الكفاية. A أقصى ما يقرب من 2.5 مل من الحليب لكل حيوان يمكن جمع 17، أو ما يصل إلى 0.5 مل لكل حلمة. يوصي الباحثون إلى أن إجمالي الوقت تحت التخدير أن يقتصر على ما يقرب من 45-60 دقيقة، سص 45 دقيقة من حلب. - جمع الحليب في أنبوب مكداس مكروي لقياس creamatocrit من عينات الحليب الطازج، وختم نهاية الأنبوب مع الطين تسرب. تسمية أنبوب مكداس مكروي مع ID السد وتخزين عينة الحليب في وضع مستقيم.
- عندما الحلب غير الكامل، وإيقاف تدفق الأيزوفلورين والأكسجين. إزالة القناع من السد ومواصلة رصد السد حتى مستيقظا. فمن المستحسن أن لم يكن واعيا تماما، يجب وضع سد على وسادة مقعد ماصة خلال فترة النقاهة، وليس مباشرة على الفراش القفص لمنع الفراش من أن يستنشق أو الخدش عيون السد خلال الانتعاش.
ملاحظة: لا تترك السد غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الإستلقاء القصية. - إذا ليس هناك حاجة لمزيد من التحليلات، وتجميد الحليب في -80 ° C. واقترح آخرون أن الحليب يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3 ساعات في 4 درجات مئوية أو 5 أشهر في -20 ° C 18.
7. Creamatocrit القياس
- تقدير نسبة الدهون في الحليب عن طريق حساب creamatocrit الحليب (النسبة المئوية للكريم في عينة حليب) 19.
ملاحظة: وقد أثبتت القياسات مع الحليب البشري أن الحليب سواء الطازجة أو المجمدة يمكن استخدامها لقياس creamatocrit، ومع ذلك يرتبط ارتباطا أكثر شدة الحليب الطازج (ص = 0.92 مقابل ص = 0.90) مع تركيز الدهون 11. يجب أن تبقى استخدام الحليب الطازج أو المجمد لقياس creamatocrit متناسقة عبر الدراسة، كما يرتبط الحليب المذوبة مع انخفاض طفيف في creamatocrit تقدر 11. - للحصول على الحليب الطازج، وجمع عينة من الحليب من حلمة في أنبوب مكداس مكروي. ملء ما لا يقل عن ¾ الكامل (حوالي 15-20 ميكرولتر). بدلا من ذلك، رسم الحليب الطازج من العينة التي تم جمعها في أنبوب شعري بعد يمزج جيدا. ختم نهاية بالطين تسرب.
- وضع أنبوب شعري في الدوار الهيماتوكريت، معنهاية مختومة لافتا نحو الخارج، وضمان أجهزة الطرد المركزي غير متوازنة.
- بدء تدور الهيماتوكريت (120 ثانية في 13700 x ج).
ملاحظة: الوقت سبين أو السرعة قد تتغير اعتمادا على نموذج من أجهزة الطرد المركزي المستخدمة. - إزالة أنبوب من أجهزة الطرد المركزي بعد زيادة ونقصان اكتمال وإجراء القياسات لحساب creamatocrit. مراقبة فصل العينة إلى طبقة كريم وطبقة واضحة.
- قياس وتسجيل ويبلغ طول السائل في الأنبوب وطول الدهون (كريم) طبقة باستخدام الفرجار أو مسطرة.
ملاحظة: يتم التعبير عن creamatocrit كنسبة مئوية من طبقة كريم ضمن عينة الحليب 19، المحسوبة على النحو (طول طبقة كريم / يبلغ طول العمود الحليب) × 100 (الشكل 1A). حساب التركيز والطاقة القيم الدهون من قياس creamatocrit كما يلي: تركيز الدهون (ز / L) = (creamatocrit (٪) - 0.59) /0.146 (1B الشكل) 19. قيمة الطاقة (KCآل / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (٪) (الشكل 1C) 19.
8. البروتين تركيز تقرير
- باستخدام مصل بقري الزلال كمعيار البروتين، وتحديد تركيز البروتين الكلي الحليب باستخدام فحص البروتين القياسية، مثل لوري فحص البروتين 6.
ملاحظة: التخفيف من الحليب قد يكون من الضروري للقياسات بروتين الحليب لتسقط داخل المنحنى القياسي للفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم جمع الحليب كما هو موضح في الفطام من السدود ويستار (حوالي 22 أسابيع من العمر، وزنها 350-400 ز) أن تستهلك التحكم (AIN-93g و، ن = 5)، نسبة عالية من البروتين (40٪ الكازين وزن / وزن، ن = 5) ، أو الألياف تسبق التكوين الجنيني عالية (21.6٪ وزن / وزن، 1: 1 نسبة oligofructose وحبوب، ن = 4) النظام الغذائي طوال فترة الحمل والرضاعة. وكانت جرعة الأوكسيتوسين 2 وحدة دولية. وقد تم جمع الحليب باستخدام الأنابيب الشعرية، ونسج أنبوب واحد باستخدام الدوار الهيماتوكريت لتحديد creamatocrit (الشكل 1A)، الذي كان آنذاك المستخدمة لتقدير تركيز الدهون وقيمة الطاقة وفقا ل: تركيز الدهون (ز / L) = (creamatocrit (٪ ) -0،59) /0.146 (الشكل 1B). قيمة الطاقة (كيلو كالوري / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (٪) (الشكل 1C) 19. تم تحديد تركيز البروتين الحليب باستخدام بيو راد DC فحص البروتين (الشكل 2). كانت هناك اختلافات في creamatocrit (ع = 0.674)، وتركيز الدهون (ع = 0.674)، قيمة الطاقة (ع = 0.674)، سص تركيز بروتين (P = 0.127) على أساس النظام الغذائي للأم (في اتجاه واحد ANOVA).
الشكل 1. الحليب creamatocrit، وتركيز الدهون، وقيمة الطاقة. تم جمع عينات الحليب عند الفطام من السدود ويستار بشأن مكافحة (ن = 5)، نسبة عالية من البروتين (ن = 5)، أو ثانوية تسبق التكوين الجنيني ليفية (ن = 4) الوجبات الغذائية طوال فترة الحمل والرضاعة. واستخدمت القياسات Creamatocrit (A) لحساب تركيز الدهون الحليب (B) وقيمة الطاقة (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مجموع تركيز بروتين الحليب. وكانت عينات الحليب جمعإد في الفطام من السدود ويستار بشأن مكافحة (ن = 5)، نسبة عالية من البروتين (ن = 5)، أو ثانوية تسبق التكوين الجنيني ليفية (ن = 4) الوجبات الغذائية طوال فترة الحمل والرضاعة. تم تحديد تركيز البروتين الكلي باستخدام بيو راد DC فحص البروتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها. وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للبروتوكولات CCAC المعتمدة.
Acknowledgments
وأيد هذا يعمل من خلال المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (RGPIN 238٬382-2011) والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (MOP115076). وأيد هيذر بول من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا للمنح الدراسية للدراسات العليا والمنح ألبرتا ابتكارات حلول الصحة. وأيد ميغان هالام من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث الدراسات العليا للمنح الدراسية، على منحة فريدريك بانتينغ وتشارلز أفضل كندا العليا، وجائزة لألبرتا للأطفال معهد بحوث مستشفى التدريب في علم الوراثة، تنمية الطفل، والصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
