Introduction
Melk er den eneste næringskilde for nyfødte pattedyr, som gir energi og næringsstoffer for barnets vekst og utvikling 1,2. Mens melk består hovedsakelig av celler, lipider og proteiner 1, inneholder den også en mengde av bioaktive forbindelser som modulerer tidlig i livet utvikle avkom, inkludert enzymer, karbohydrater, hormoner, antistoffer, vekstfaktorer, cytokiner, exosomes, mikrovesikler og små RNA slike som mikroRNA 1,2. Den grunnleggende rolle morsmelk i etableringen av avkom immun og tarmhelse tre, kombinert med bevis på at barn som ammes er mindre utsatt for sykdom 2, understreker viktigheten av å identifisere de melkebestanddeler i forbindelse med sykdomsprosesser tidlig i livet og de molekylære mekanismene som er involvert i sine handlinger. Utviklings rotte er en populær modell for å undersøke effekten av ulike ernæringsmessige, fysiologiske og kjemiske intervensjoner på tidlig-Life utvikling 4. Analysen av rotte melk kan derfor gi romanen innsikt i mødre- og avkom helse.
Gjeldende vitenskapelige fremskritt gir nå økende muligheter for grundige undersøkelser av effekten av spesifikke melkebestanddeler på helse og sykdom. For eksempel har sekvensering av melke bakterielle profiler belyses deres rolle tidlig i tarmkolonisering av spedbarn tarmen 5, har massespektrometri-analyse av melk oligosakkarider gitt innsikt i endring av melken oligo profilene med mors diett 6, og dype sekvensering av mikroRNA utskilt i fettkulene av morsmelk belyser mulige roller i gentranskripsjon, metabolisme og immunforsvar 7.
Rottemodeller representerer en av de mest populære modellorganismer som brukes i mors studier 8,9. En fordel er deres korte svangerskap og amming perioder, varige bare omtrenteligEly 21 dager hver; derfor den totale tid fra begynnelsen av svangerskapet til amming er en kort periode, hvor verdifull informasjon kan genereres. Jo større størrelsen hos rotter sammenlignet med mus, i sammenheng med melk samling, kan gi en betydelig fordel med hensyn til volum av melk og enkel melk samling; melkeproduksjon i mus, for eksempel, ser ut til å være avhengig av den totale kroppsvekten med tyngre mus produserer mer melk 10.
Her er en generell beskrivelse for manuell innsamling av melk fra ammende rotter gitt. Denne protokollen krever minimalt utstyr, er ikke-invasiv, billig, og kan brukes til å samle inn tilstrekkelige volumer av melk for videre nedstrøms analyser. I korte trekk, blir demningen bedøvet med isofluran, melkenedgivingen stimuleres av oxytocin, og melken blir oppsamlet i kapillarrør via manuell ekspresjon av melken. Til slutt, som to hovedkomponenter i melk er fett og protein, en kort description estimere melkefettinnhold ved hjelp av creamatocrit målinger 11 og kvantifisering av total proteinkonsentrasjon ved hjelp av en standard proteinanalyse er presentert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av University of Calgary Animal Care komité og likedannet Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Separat Dam fra Avkom
- Separer demningen fra hennes avkom i minst 5 min før melking 12.
MERK: Demningen kan bli melket opp til 5-6 timer etter separasjon 1,6,13, men perioder med separasjon lengre enn fire timer kan endre melk sammensetning 14. Mens separasjon tid ikke ut til å påvirke melk samling volum 12, er det anbefales at en konsekvent separasjon tid opprettholdes gjennom hele studien. Melk sammensetning kan endre hele laktasjonen 15, derfor forsøk bør gjøres for å holde den dagen melk samling konsekvent. Maksimal melkeproduksjon er foreslått å skje på amming dag 14 12. - Ved hjelp av en oppvarming kammer, sikre ungene er i stand til å opprettholde riktig kropps temperare uten tilstedeværelse av deres mor for varigheten av melkingen.
MERK: I studien presenteres nedenfor, ble melke utført ved avvenning, når dammene var ca 22 uker gammel og avkommet 21 dager gammel, derfor ingen oppvarming kammer ble brukt.
2. Set-up og klargjøring
- Samle alle materialer som kreves for melke prosedyren.
MERK: Alle materialer kan bli funnet på materialer og utstyr tabellen. - Plasser en varmepute på benken der melke vil finne sted og dekker puten med et absorberende benk under-pad.
- Sett opp narkosen system. Sikre at systemet har tilstrekkelig oksygen og isofluran før begynnelsen. Fest bedøvelse maske som skal brukes til innledende anestesi induksjon til maskinen. Plasser masken som skal brukes til anestesi vedlikehold nærheten hvis annerledes enn den opprinnelige bedøvelse maske.
- Fest en 25 G nål til en 1 ml sprøyte for oxytocininjeksjon ved bruk av aseptisk teknikk.
- Slå på varmeputen slik at mors kroppstemperaturen opprettholdes under melking prosedyren. MERK: Overvåk temperaturen på varmeputen for å sikre puten ikke blir for varmt og forårsake brannskader. Alternativt kan du bruke en varmekilde, for eksempel en oppvarmet kirurgisk bord, som kan settes til en bestemt temperatur.
3. Anesthetize Dam Bruke Isofluran
- Åpne oksygen tank og slå strømmen til en L (1000 cc) per min. Slå på strømmen av isofluran og satt til 5%. FORSIKTIG: Unngå direkte innånding av bedøvelse og hindre opphopning av anestesi damper.
- Bedøve demningen.
- Bytte over til vedlikeholdsmaske hvis nødvendig, plassere demningen liggende på absorberende benk pad. Bekreft anesthetization av mangel på pedal refleks.
- Redusere strømmen av isofluran til 2-3% for opprettholdelse av anestesi. Kontinuerlig overvåke demningen hele prosedyren for å sikre depression av respirasjon forekommer ikke. MERK: Når under narkose, bør dammens øynene beskyttes ved hjelp av en steril øye smøremiddel for å unngå at øynene tørker ut eller blir ripete.
4. Oxytocin Injection
- Sørg for at oxytocin (20 USP enheter / ml) har ikke gått sin utløpsdato. Desinfiser hetteglass med oxytocin med en steril alkohol tørk / alkohol rensing pad.
- Bruk aseptisk teknikk, utarbeide to IE (0,1 ml) av oxytocin i sprøyten. Bruk en ny nål og sprøyte for hver dam som vil bli melket.
MERK: Oxytocin doser generelt spenner fra enkle injeksjoner på 1 til 5 IU 1,6,12,16. Alternativt, kan en dose på 4 IU / kg kroppsvekt anvendes 12. En enkelt dose på 2 IE kan gjentas én gang hvis vanskelighet melking er oppstått. - Injisere oxytocin intraperitonealt. Sett nålen inn i den nedre høyre kvadrant av abdomen med nålen pekende mot hodet, i en vinkelpå 15-30 °, ca 0,5 cm dyp.
- Trekke tilbake på stempelet for å sikre undertrykk før injeksjon. Hvis noe væske (blod, urin tarminnholdet, etc.) suges inn i sprøyten, trekk ut nålen og forsøke injeksjon med en ny nål og sprøyte. Hvis ingen væske suges injisere oxytocin og kast nålen og sprøyten umiddelbart inn i en biologisk container.
- Vent ca 5-15 min for oxytocin for å stimulere melk nedtur.
5. Utarbeidelse av Melking nettsteder
- Velg de nettsteder / spener som melk vil bli samlet inn. Melk kan hentes fra en hvilken som helst smokken 12.
- Fjern forsiktig pels rundt spenene å bli melket med trimmerne, som pels kan føre til vanskeligheter med prøvetaking grunn veke av melken. Vær forsiktig - huden rundt spenene er ekstremt følsom og kan være tørr og som sådan er utsatt for riper og tårer.
- Sterilisering av smokken ier ikke nødvendig, men eventuelt rengjør smokken med lunkent vann etter at pelsen er fjernet. Forbered minst to områder som mer enn ett sted kan være nødvendig for melk samling.
MERK: Hvis melken analysen inkluderer mikrobiell profilering, kan smokken området krever sterilisering med jod 5.
6. Melk Collection
- Klem forsiktig på bunnen av smokken, manuelt utvise melken for samlingen.
MERK: Hvis melken analysen inkluderer mikrobiell profilering, bør de første par dråper melk kastes. - Samle melkedråper inn i et kapillarrør, fylle kapillarrøret. Kapillarrør som rommer større volumer (f.eks 50 mL) lette prosessen.
MERK: Hvis vanskeligheter med å samle melk er oppstått, kan en andre dose oksytocin gis. Det anbefales at dosen ikke overskride 4 IU totalt. - Tilsett melk fra kapillarrøret i en steril mikrosentrifugerør etterberøre enden av røret som ble brukt for å trekke melk fra spenene til siden av den mikrosentrifugerør - observere melken blir trukket ut av kapillarrøret via kapillarvirkning.
NB: "blåse ut" melk som ikke er trukket inn i røret ved hjelp av en 18 G nål festet til en 1 ml sprøyte. - Kontinuerlig overvåker demningen for tegn på smerte eller respiratorisk depresjon og justere strømningen av isofluran tilsvarende.
- Fortsette å samle melk som beskrevet i denne delen før tilstrekkelig melk har blitt samlet for melken analyse valgt. For creamatocrit og proteinkonsentrasjonsbestemmelse som er beskrevet nedenfor, samler 0,25 ml melk.
MERK: Bruk en annen melking området hvis melk nedtur bremser eller det valgte området ikke utvise melk tilstrekkelig. Et maksimum på ca. 2,5 ml melk pr dyr kan samles 17, eller opp til 0,5 ml per spene. Forfatterne anbefalt at den totale tidsforbruk under bedøvelse være begrenset til omtrent 45 til 60 min, or 45 min for melking. - Samle melk i en microhematocrit rør for creamatocrit måling av ferske melkeprøver, og forsegle enden av røret med leire tetningsmiddel. Merke microhematocrit tube med demningen ID og lagre melk prøven oppreist.
- Når melkingen er fullført, slår du av strømmen av isofluran og oksygen. Fjern masken fra demningen og fortsetter å overvåke dam inntil våken. Det anbefales at hvis ikke fullt bevisst, bør dammen være plassert på et absorberende benk pute under utvinning perioden, i stedet for direkte på buret sengetøy, for å hindre at sengetøy blir aspirert eller skrape dammens øynene under utvinning.
MERK: Ikke la dam uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbancy. - Dersom ingen ytterligere analyser er nødvendig, fryse melk ved -80 ° C. Andre har foreslått at melk kan lagres i opp til 3 timer ved 4 ° C eller 5 måneder ved -20 ° C 18.
7. Creamatocrit Måling
- Estimer fettinnholdet i melken ved å beregne melken creamatocrit (prosentandelen av fløte i melkeprøve) 19.
MERK: Målinger med human melk har vist at enten fersk eller frossen melk kan anvendes for et creamatocrit måling, men fersk melk er mer sterkt korrelert (r = 0,92 versus r = 0,90) med lipid-konsentrasjon 11. Bruken av fersk eller frossen melk for creamatocrit målinger bør holdes konsekvent på tvers av studien, som tinte melk er forbundet med en liten reduksjon i creamatocrit verdier 11. - For fersk melk, samle en prøve av melk fra spenene til en microhematocrit rør; fylle minst ¾ full (ca 15-20 mL). Alternativt kan trekke frisk melk fra den innsamlede prøven inn i kapillarrøret etter kraftig omrøring. Enden med leire fugemasse.
- Sett kapillarrør inn i hematokrit spinner, med denforseglede ende som peker mot utsiden, slik at sentrifugen er balansert.
- Begynn hematokrit spinn (120 sek på 13 700 xg).
MERK: Spin tid eller Hastigheten kan variere avhengig av modell av sentrifuger som brukes. - Fjerne røret fra sentrifugen etter at spinningen er fullført og utføre målinger for å beregne creamatocrit. Observere prøvens separasjon i en krem lag og et klart lag.
- Måle og registrere den totale lengden av fluid i røret og lengden av fett (fløte) laget ved hjelp av calipers eller en linjal.
MERK: creamatocrit er uttrykt som prosentandelen av kremlaget inne i den melkeprøve 19, beregnet som (lengde lag av krem / total lengde på melk kolonne) x 100 (figur 1A). Beregn fett konsentrasjon og energiverdiene fra creamatocrit målingen som følger: Fett-konsentrasjon (g / l) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (figur 1B) 19; Energiverdi (kcal / l) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (figur 1C) 19.
8. Protein Konsentrasjon Fastsettelse
- Ved bruk av bovin serum albumin som en standard protein, melke bestemme total proteinkonsentrasjon ved hjelp av en standard proteinanalyse, for eksempel en Lowry-proteinanalyse 6.
MERK: Fortynning av melken kan være nødvendig for å få melk protein målingene faller innenfor standardkurven av analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Melk ble oppsamlet som beskrevet ved avvenning fra Wistar demninger (omtrent 22 uker gamle, som veier 350-400 g) som forbrukes en kontroll (AIN-93 g, n = 5), høy protein (40% kasein vekt / vekt, n = 5) eller høy prebiotisk fiber (21,6% vekt / vekt, 1: 1-forhold av oligofruktose og inulin, n = 4) kosthold under graviditeten og amming. Oxytocin dose var 2 IE. Melk ble oppsamlet under anvendelse av kapillarrør, og ett rør ble spunnet ved anvendelse av en hematokritt spinner for å bestemme creamatocrit (figur 1A), som deretter ble brukt til å estimere fett konsentrasjon og energiverdi i henhold til: Fett-konsentrasjon (g / l) = (creamatocrit (% ) -0,59) /0.146 (figur 1B); Energiverdien (kcal / l) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (figur 1C) 19. Melkeprotein-konsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad DC-proteinanalyse (figur 2). Det var ingen forskjeller i creamatocrit (p = 0,674), fett-konsentrasjon (p = 0,674), energiverdi (p = 0,674), or proteinkonsentrasjon (p = 0,127) basert på mors diett (en-veis ANOVA).
Figur 1. Melk creamatocrit, fett konsentrasjon og energi verdi. Melkeprøver ble innsamlet ved avvenning fra Wistar dammer på Control (n = 5), High Protein (n = 5), eller High prebiotisk Fibre (n = 4) dietter hele graviditet og amming. Creamatocrit målinger (A) ble brukt til å beregne melkefett konsentrasjon (B) og energi verdi (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Totalt melkeproteinkonsentrasjonen. Melkeprøver var collected på avvenning fra Wistar dammer på Control (n = 5), High Protein (n = 5), eller High prebiotisk Fibre (n = 4) dietter hele graviditet og amming. Totale proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Bio-Rad DC protein assay. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med CCAC godkjente protokoller.
Acknowledgments
Dette fungerer ble støttet gjennom tilskudd fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (RGPIN 238382-2011) og kanadiske Institutes of Health Research (MOP115076). Heather Paul ble støttet av en naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada Graduate stipend og en Alberta fornyer Health Solutions stipend. Megan Hallam ble støttet av en naturvitenskap og Engineering Research Council Graduate stipend, en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship, og en Alberta barnesykehus Research Institute Training Award i genetikk, Child Development, and Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders. BioMed Res. Int. , (2015).
- Rogier, E. W., et al. Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring. Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).
- Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery. Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).
- Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring. Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).
- Munch, E. M., et al. Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk. PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).
- Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models. Exp Diabetes Res. 2011, (2011).
- Ellis, P. J. I., et al. Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming. BMC Genomics. 15, 49 (2014).
- Gomez-Gallago, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus). An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).
- Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. Creamatocrit and the nutrient composition of human milk. J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups. J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).
- Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats. J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).
- Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet. Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).
- Azara, C. R. P., et al. Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups. Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).
- Keen, C. L., Lönnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. Effects of milking procedure on rat milk composition. Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).
- Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., Lòpez-Sabater, M. C. Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk. Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).
- Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
- Furtado, K., Andrade, F. Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review. OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).
- Hausman Kedem, M., et al. The effect of advanced maternal age upon human milk fat content. Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).
- Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation. Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).
