Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA의 시험 관내 전사 및 mRNA의 정제
- 제조업체의 지시에 따라를 NotI 제한 효소를 사용 PCS2 + 플라스미드를 함유-H2B PSmOrange 선형화.
참고 : mRNA의 오염 및 열화를 방지하기 위해 같은 장갑, 실험실 코트 등의 적절한 보호를 사용하여 다음 단계를 수행합니다. - 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 페놀 - 클로로포름 계 방법을 사용하여 선형화 된 DNA를 정제.
- 제조업체의 지침에 따라 SP6-mRNA의 전사를위한 선형화 템플릿 DNA 1 μg의를 사용합니다.
- 37 ° C에서 10 ~ 20 분 동안 1.0 U의 RNase 무료 DNaseI을 추가하여 DNA를 제거합니다.
- RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 키트를 정리하여 mRNA의 정리.
- mRNA의 순도 및 농도를 증가 6 μL 아세트산 나트륨 (3.0 M, pH를 5.2), 150 ㎕의 96 % 에탄올을 첨가하여 mRNA의 석출. m을 품어최소 30 분에서 24 시간까지 -20 ° C에서 ixed 솔루션입니다.
- 4 ° C에서 45 분 18.407 XG에 솔루션을 회전시켜 mRNA를 수집합니다. 액체를 버리고, 150 μL의 70 % 에탄올의 mRNA를 재현 탁. 믹스와 4 ℃에서 추가로 15 분 동안 솔루션을 원심 분리기. 액체를 폐기 얼음에 5 분 동안 펠렛을 건조하고 20 μl를 초순수의 RNase 무료 물에의 mRNA를 재현 탁.
- (100) mRNA의 희석 (99 μL의 초순수의 RNase없는 물 1 μl의 mRNA의) : 1 광도 측정에 의해 mRNA의 농도와 순도를 평가합니다.
- 단기 저장을 위해, -20 ° C에서의 mRNA 용액을 유지한다. 장기간 저장을 위해, -80 ° C에서의 mRNA를 유지한다.
Zebrafish의 배아에 2 H2B-PSmOrange mRNA의 미세 주입
- TG 사용하여 주입하기 전에 쌍에게 밤에 짝짓기 설정 (foxD3 : GFP)를; TG (FLH : GFP)을 두 번 형질 전환 어류 (또는 다른 GFP 형질 전환 어류). 스페이서를 배치하여 분리 물고기를 남겨주세요그들 사이의 상대 시간을 제어한다.
- 주입 아침에 스페이서를 제거하고 20 분 동안 물고기 짝을 할 수 있습니다.
- 짝짓기 시간 동안, 130 페이지의 최종 농도-H2B PSmOrange mRNA의 희석 / NL 및 microloader 팁을 사용하여, 마이크로 인젝션 모세관에 전사 6 μL 주입 용액 (물에의 RNase 무료). 보정 된 유리 슬라이드와 주입량을 확인합니다. NL이 mRNA의 용액 (260 페이지)를 주입하는 주입 압력을 조정한다.
- 1 배 배아 (E3) 매체를 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 계란을 수집합니다.
- 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 주입 접시에 20 ~ 30 배아를 전송합니다.
- 한 세포 단계 (11)에서 노른자로 전지 셀에 또는 아래 사항 솔루션을 포함하는 2 NL의 mRNA를 주입한다.
- 1 배 E3 매체를 포함하는 페트리 접시에 전송 주입 된 배아는, 미 수정 여부를 일반적으로 개발 배아를 제거하고 28 ° C에서 그들을 성장.
참고 : 가벼운 보호 O를배아 f를 실험을하는 동안 필요하지 않습니다. - 1 배 E3 매체에 제브라 피쉬의 배아를 올리고 색소 침착을 억제하는 낭 배기 후 0.2 mM의 PTU (1- 페닐 -2- 티오)를 추가합니다. 세균 오염의 위험을 최소화하기 위해 하루에 두 번 배지를 변경합니다.
3. 배아 퍼가기
- GFP (녹색) 및 PSmOrange 형광 램프와 적절한 방출 필터가 장착 쌍안 현미경을 사용하여 (레드 / 오렌지)의 공동 발현 배아를 선택합니다. 1 배 E3 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 긍정적 인 배아를 전송합니다.
- 겸자 (12)를 사용하여 실체 현미경 Dechorionate 배아.
- 1.0 ml를 포함하는 1.5 ML 튜브에 전송 한 배아 컷 팁 피펫 (P200)를 사용하여 초순수 제조 1.0 % 낮은 용융 아가로 오스 (LMA)를 미리은 예열. 참고 : 80 ° C에 LMA를 따뜻하게하고 배아를 삽입하기 전에 실온에서 3 ~ 5 분 동안 냉각.
- 에 150 ㎕의 LMA에서 배아를 이동커브 글라스를 챔버 및 미세 플라스틱 팁을 사용, 아래로 반전 공 초점 레이저 주사 현미경 A1R + (또는 다른 적절한 현미경)에 기술 된 실험에서 배아의 방향, 예를 들어 지느러미 측면을 조정합니다. LMA가 중합되면, 마취 0.2 mM의 PTU 0.02 % 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트 methansulfonate (Tricaine)를 함유하는 생선 물 챔버를 채운다.
- 샘플을 이미징하기 전에 Tricaine의 효과를 확인하기 위해 15 분을 기다립니다. 마취는 브라이트 조명이 장착 된 실체 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있는 배아의 움직임을 방지 할 수 있습니다.
주 : 챔버 회 재사용 될 수있다.
4. PSmOrange 광
- 공 초점 현미경으로 시료를 넣고 488 nm의 각각 GFP 및 PSmOrange 촬상 561 nm의 레이저에 의한 photoconvert하는 영역을 식별하기 위해 표본을 검사한다.
주 : 반전 STA에 반전 촛점 레이저 주사 현미경을 사용 A1R +GE의 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 TiEcontrolled 및 488 nm의, 561 nm의 광 및 이미징 640 nm의 레이저를 장착. 그러나, 애플리케이션이 확실히만큼 변환 이미징 레이저 라인이 가능한 현미경으로 한정되지 않는다.- 제자리에 20X 공기 목적을 넣어 (NA : 0.75, WD를 : 1.0 mm, FOV : 0.64 X 0.64 mm)를.
- 광 전에 PSmOrange 단백질을 검출하기 위해 다음과 같은 현미경 설정을 사용하여 561 nm의 레이저, 목적 위의 초점면에서 측정 된 0.74 mW의합니다.
주 :이 시스템이 40 %에 해당한다 (초점 평면에서 측정하는 유효 전력을 결정하기위한 유일한 방법이다). 변할 수-H2B PSmOrange 주사의 효율성 실험 필요에 따라 레이저 전력을 조정한다. - 관심 영역을 강조하기 위해 줌 요소를 추가합니다. 높은 배율 이미지 획득 시간 때문에 광독성을 감소시킨다.
- 구조를 포함하는 Z 스택 획득488 nm의 연속 모드 (라인 모드 1> 4)에서 561 nm의 레이저를 사용하여 관심의. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다.
- 샘플을 스캔하고 photoconvert 할 영역을 강조하기 위해 관심 (ROI) 도구의 지역을 선택합니다. 자극 곳은 투자 수익 (ROI)을 수정합니다. 사진 활성화 / 표백 모듈을 선택, 각 박스를 선택하여 488 nm의 레이저를 활성화하고 80 % (목적에서 측정 한 mW의 레이저 파워)로 488 nm의 레이저를 설정합니다. 0.5 초 / 프레임의 스캔 속도를 설정합니다.
- 광 변환 유틸리티 (ND 자극)을 열고 광 설정을 지정합니다.
- 광 프로토콜을 지정하려면 "추가"명령을 클릭합니다.
- "취득 / 자극"메뉴의 "취득"에서 "단계"한 설정과 이미지의 개수는 "루프"메뉴의 광 전에 취득 할 나타냅니다.
- 세인트 "로 설정"단계 "2imulation "자극 이벤트의 수를 입력을 수행한다.
- 조정 "단계"3 "상"1 선택적으로 기술 한 바와 같이, 이미지 수집의 마지막 라운드 전에 대기하는 시간을 입력하여 "상"이 후 대기 "단계"를 삽입합니다.
- 모든 매개 변수가 설정되면, 자극 설정을 적용하고 광을 실행합니다.
레이저 전원 다를 수 있습니다 광 각 라운드에 대한 검사 및 반복 수의 주파수 및 배아로 배아 다릅니다 있습니다. 설정은 표 1에 나타내었다 시작합니다.
- 488 내지 561 nm이고, 상기와 같이 설정을 적용 640 nm의 레이저를 이용하여 마지막 Z 스택 획득. (mW의 4.5까지) 고 레이저 전력을 사용하여 변환 PSmOrange 시각화 640 nm의 레이저를 설정한다.
LMA 5. 마운트 해제 배아
- 현미경에서 챔버를 포함하는 배아를 제거합니다. 조심스럽게 아가로 오스 유에서 배아를 제거집게를 노래.
- 새로운 멸균 플라스틱 페트리 접시로 또는 1 배 E3 0.2 mM의 PTU를 포함하는 멸균 6 웰 플레이트에 배아를 전송합니다. 개발의 원하는 단계까지 28 ° C에서 배아를 품어.
6. Photoconverted PSmOrange 단백질 발현하는 세포의 운명을 분석
- 점 3.3 3.4에 기재된 바와 같이 배아를 다시 삽입.
- 공 초점 현미경으로 시료를 놓고 관심 (488 ㎚)의 GFP 유전자 변형 구조 photoconverted 세포 (640 나노 미터)을 식별하기 위해 표본을 검사합니다.
- 488 nm의, 561 nm의 연속 모드 (라인 모드 1> 4)에서 640 nm의 레이저를 사용하여 관심의 구조를 다루는 Z 스택 획득. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다.
- 어느 공동 특급 GFP와 photoconverted 단백질을 세포를 식별하기 위해 다음 방법 중 하나를 사용하십시오.
- 사용자 정의 만든 자동 피지 이미지J 매크로 3
- 에서 Convolve "GaussianBlur"플러그인을 사용하여 원래 스택 (→ 과정 → GaussianBlur → 필터) 및 "이미지 계산기"플러그인 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)를 사용하여 원래의 부드러운 스택을 뺍니다. 관심있는 구조를 시각화하고 분석 연산 시간을 줄이기 위해이 공정을 사용한다.
- photoconverted 세포를 강조하기 위해 녹색과 원적외선 채널에 특정 임계 값을 적용 (→ 이미지 → → 임계 값을 조정합니다). 적절한 설정으로 임계 영역을 검출하기 위해 "입자를 분석"도구를 사용하여 (→ 입자를 분석 → 분석).
- "이미지 계산기"플러그인을 열고 노란색 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)에 녹색과 원적외선 채널의 중복의 ROI를 표시됩니다.
- 3D 데이터 평가 현미경 이미징 소프트웨어
- 의 스택을 표시(3D 시각화 메뉴 →보기 볼륨보기 →) 쇼 볼륨보기 옵션을 사용하여 3D. , 녹색, 빨간색과 원적외선 채널을 선택 밝기와 대비를 조정하고 photoconverted 영역 (그림 1)을 강조 3D 스택을자를 그래픽 인터페이스를 사용합니다.
참고 : 데이터가 이미지 분석을위한 일반적인 대부분의 소프트웨어에서 사용할 수있는 분석 비슷한 방법.
- 의 스택을 표시(3D 시각화 메뉴 →보기 볼륨보기 →) 쇼 볼륨보기 옵션을 사용하여 3D. , 녹색, 빨간색과 원적외선 채널을 선택 밝기와 대비를 조정하고 photoconverted 영역 (그림 1)을 강조 3D 스택을자를 그래픽 인터페이스를 사용합니다.
- 사용자 정의 만든 자동 피지 이미지J 매크로 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1은 PSmOrange 광 변환 시스템의 일례를 도시한다. 뇌의 복잡한은 척추 동물의 등쪽 간뇌의 보존 구조입니다. 많은 다른 척추 동물에서와 마찬가지로,이 단지는 간뇌 왼쪽 양면 parapineal 세포의 중앙에 뇌의 기관으로 구성되어 있습니다. 우아한하지만 시간이 많이 소요되는 uncaging 실험은 parapineal 세포가 뇌의 기관 (13)의 앞쪽 부분에 발생한 것으로 나타났다. TG에서 (foxD3 : GFP); TG (FLH : GFP) 유전자 변형 배아는, 뇌의 및 parapineal 모두 세포를 개발하는 동안 표시되어 있습니다. PSmOrange 시스템의 적합성을 평가하기 위해, 우리는보고 된 솔방울 복잡한 현상 재현이 배아를 사용 하였다. PSmOrange, H2B-PSmOrange의 핵 형태를 인코딩 260 페이지의 mRNA의 모든 세포의 핵에서 단백질을 발현 한 세포 단계 이중 유전자 변형 배아에 주입 하였다. 주입 된 배아는 24 시간 후 fertilizat 때까지 28 ° C에서 배양 하였다이온 (HPF), GFP 강한 H2B-PSmOrange 식으로 선택하고 아래 지향 등의면 챔버 커버 슬립 시스템에서 LMA에 포함. 시편은 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 제어되는 488 내지 561 nm 내지 640 nm의 레이저 광과 추적을위한 공기 20X 대물 구비 반전 공 초점 레이저 주사 현미경으로 배치 하였다. 송과선의 앞쪽 부분에 두 개의 세포 클러스터는 photoconverted 즉시 (그림 1A - F) 몇 군데 있었다. photoconverted 세포는 640 nm의 레이저 (까지 적색 -도 1C)을 이용하여 가시화 할 수 있지만 561 나노 레이저 (적색 / 주황색 -도 1b). 이들 세포에서 GFP 발현이 초기 인해 (도 1A, 1D, 1F)를 photobleaching에 감소되었다. 52 HPF에서 GFP 및 H2B-PSmOrange이 photoconverted H2B-PSmOrange 단백질 발현하는 세포에서 발견되었다 (그림 1A '- F'). 실제로, 이들 세포의 몇 가지 뇌의 왼쪽 parapineal 형성 (도 1a에 화살표 머리 '- F'). 이 결과 parapineal 세포 기원 이전보고와 일치하고 살아있는 척추 배아 PSmOrange 기술의 적용을 도시한다.
. 제브라 피쉬 배아 생활에 PSmOrange 광 변환 시스템을 사용하여 parapineal 세포의 출처를 식별 그림 1. (A - F ') TG의 등 간뇌에 초점을 맞춘 가기 앞쪽과 등쪽 조회수 (foxD3 : GFP); TG (FLH : GFP) 유전자 변형 배아에서 뇌의 (P)과 parapineal 세포 (PP) 강조 (A를 - F) 26 HPF 직후 광 및 (A '- F & # 39) 26 시간 후 52 HPF에서. 배아는 mRNA를-H2B PSmOrange 인코딩을 주입 하였다. 사진 표시 3D 재구성. (A, A ') 형질 전환 GFP (B, B')의 발현되지 광 (원적외선 채널) 후 H2B-PSmOrange (적색 채널) 및 (C, C ')를 변환. 흰색 점선 원은 레드 / 오렌지 형광없는 것입니다 광의 영역을 강조 표시합니다. (D, D ') 세 채널의 병합 (녹색, 원적외선, 적색), (E, E') 빨간색과 원적외선 채널 (F, F ') 녹색과 원적외선 채널. (A'-F ') 화이트 화살촉은 그린, 오렌지 / 빨간색과 멀리 붉은 형광을 보여 parapineal 세포의 위치를 강조 표시합니다. (AF ') 스케일 바는 각 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 표시됩니다.PLOAD / 53604 / 53604fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 | 루프의 수 | 활성 레이저 |
| 취득 방식 | 1주기 | 488 nm의, 561 nm의, 640 nm의 |
| 자극 | 15~30 회 | 488 nm의 |
| 성숙 | 1 분 | # |
| 취득 방식 | 1주기 | 488 nm의, 561 nm의, 640 nm의 |
표 1 : H2B-PSmOrange의 광 조건.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
형광 기자를 운반하는 형질 전환 배아는 배아 발달을 이해하는 것이 근본적으로 도왔다. 그러나, 특정 구조의 특정 시각화를 용이하게하기위한 촉진제 중요한 필요성은 여전히 존재한다. 자신의 부재에서 연구자들은 관심의 그 구조의 기원과 발전에 대해 알고 형광 단백질의 광과 같은 기술에 의존하고 있습니다. 이것은 차례로 개발에 관련된 분자 메커니즘을 식별하는 중요한 조건이다. 제브라 피쉬 분야의 기술 진보는 지금 접근 14,15에 CRISPR-Cas9 매개 노크를 사용하여 예를 들어와 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질의 FP를 교체 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 비교적 시간 소모적 항상 성공적이지. 대조적으로, 보편적으로의 응용 프로그램이 GFP에 H2B-PSmOrange 및 가능한 다른 유전자 변형 배경 표현은 그들을 통해 세포를 수행하는 직선 앞으로 기술이다bryonic 개발.
예를 들어, 제브라 피쉬 복부 habenulae의 기원, 척추 동물의 등 간뇌의 보존 신경 전도 시스템의 한 부분은, 최근에 따라서 개발의 기초가 어떤 유전 폭포가 발견되지 않을 때까지 애매하고있다. 마이그레이션 세포를 따라 PSmOrange 시스템과 장기적인 시간 경과 분석을 사용하여, 우리는 왼쪽과 골단에 바로 인접 유래 등의 habenular 핵 달리, 복부 habenular 뉴런은 시상 (3)에이 지역에 후방을 개발하는 것을 보여 수 있습니다. 이 지식은 우리가 다음 복부 habenular 뉴런 개발을위한 다운 스트림 유전자 Tcf7l2 신호 표준의 Wnt의 중요한 기능을 식별 할 수 있었다.
photoconvertible PSmOrange 시스템의 애플리케이션은 빠르고 간단하며 배아 조명 전에 강한 단백질 발현을 위해 선택 될 수 photoactivatible 단백질상에서 장점을 갖는다. 합성 MR을H2B-NA PSmOrange위한 인코딩은 보편적으로 모든 핵의 오렌지 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 배아 GFP 주입된다. 우리는 주입시 어떤 부작용이 발생하지 않은 단백질은 적어도 96 시간 동안 안정하다. 단백질은 488 nm의 여기 용 레이저를 이용하여 ROI의 GFP 형질 전환 세포 photoconverted되고 배아 이후 약 48 시간 이내에 세포를 포함하는 지금까지 적색 형광 단백질을 분석 할 수있다. 이 조건이 배아의 발달 단계와 대상 조직에 따라 달라질 수있는 성공적인 광을 모니터링하는 것이 중요합니다. 현미경 이미징 소프트웨어 전과 후에 광 (적색 및 원거리 적색, 녹색) 각 채널의 화상을 취득한다. 광 변환 효율은 광 전과 후 다른 채널 사이의 ROI의 평균 형광 강도를 측정 평가할 수있다. 더 원적외선 형광 광 등록 직후에 검출되지 않으면광 ditional의 발사가 적용되어야한다. GFP 표백은 광 변환 후 일반적이다. 그러나, 형광 단백질 유전자의 연속적인 번역이 약 2 시간 내에이 문제를 극복한다.
피지 ImageJ에 대한 사용자 정의 만든 매크로 셀 photoconverted 단백질을 공동 발현과 유전자 변형 GFP 3 사용할 수의 식별을 용이하게합니다. 또한이 절차를 단순화 H2B-PSmOrange을 표현 안정적인 유전자 변형 라인의 미래 설립. 또한 조직 재생과 같은 분야를 연구하는 흥미로운 값을 가질 수 있습니다 사일 게시물 수정 후 발달 이벤트의 분석을 용이하게합니다. 또한, 모체 표현 PSmOrange의 형질 전환 및 시간 경과 영상 (16)의 조합은 단일 세포 수준에서 낭 배기 전에 시작 셀 철새 사건을 조사하기위한 강력한 도구가 될 것입니다. 또한 애플리케이션은 F와 H2B 핵 태그의 교환을 포함 할 수있다또는 인스턴스, GAP43는 개발 배아에서 세포막과 잠재적으로 축삭을 시각화합니다.
이 기술의 한 가지 제한은 단백질 접합체만을 낭배 후 발현되기 시작하므로 낭배 프로세스의 분석에 적용될 수 없다는 것이다. 그것은 또한 배아 깊은있는 세포 단백질 photoconvert 오히려 어려운 것으로 생각되어야한다. 광 설정이 높은 레이저 파워 세심한 모니터링을 필요로 조직 손상을 초래할 수 광 필요한 자극 비교적 긴 시간으로서 채택되어야한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
