Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro transkripsjon og mRNA Purification
- Linearisere H2B-PSmOrange inneholder pCS2 + plasmid med NotI restriksjonsenzymet i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Utfør de neste trinnene ved hjelp passende beskyttelse som hansker og frakk for å hindre mRNA forurensning og degradering. - Rense linearisert DNA ved hjelp av PCR Purification kit eller fenol-kloroform baserte metoder i henhold til produsentens protokoller.
- Bruk en ug linearisert templat-DNA for Sp6-mRNA transkripsjon i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fjerne DNA ved tilsetning av 1,0 U RNase fri DNaseI i 10-20 minutter ved 37 ° C.
- Rydd opp mRNA ved hjelp av en RNA rydde opp kit i henhold til produsentens protokoll.
- For å øke mRNA renhet og konsentrasjon, utfelling av mRNA ved tilsetning av 6 pl natriumacetat (3,0 M, pH 5,2) og 150 ul 96% etanol. Inkuber mimplisitte løsning ved -20 ° C i minst 30 minutter og opp til 24 timer.
- Samle mRNA ved å spinne løsningen ved 18,407 xg i 45 min ved 4 ° C. Kast væske og resuspender mRNA i 150 ul 70% etanol. Bland og sentrifuger løsningen i ytterligere 15 min ved 4 ° C. Kast væske, tørke pellet i 5 min på is og resuspender mRNA i 20 ul RNase-fritt ultrarent vann.
- Bedømme konsentrasjonen og renheten av mRNA ved fotometrisk måling av en 1: 100 fortynning mRNA (1 ul mRNA i 99 ul RNase-fritt ultrarent vann).
- For kortvarig lagring, holde mRNA løsning ved -20 ° C. For langtidslagring, holde mRNA ved -80 ° C.
2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroinjeksjon inn Sebrafisk embryo
- Sett opp parring par natten før injeksjon ved bruk av tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) dobbel transgen fisk (eller andre GFP transgen fisk). La fisken separert ved å plassere en avstandsmellom dem for å styre tidspunktet for parring.
- Fjern avstandsstykket i morgen for injeksjon og la fisken kompis for 20 min.
- Under parring tid, fortynne H2B-PSmOrange mRNA til den endelige konsentrasjon på 130 pg / nl (i RNase fritt vann) og overføre 6 ul injeksjonsoppløsning i en mikroinjeksjon ved anvendelse av en kapillær microloader spiss. Sjekk injeksjonsvolumet med et kalibrert glass lysbilde. Juster injeksjon press for å injisere 2 nl mRNA-løsning (260 pg).
- Samle eggene i en sterilisert plast petriskål som inneholder 1x Embryo (E3) medium.
- Overfør 20 til 30 Embryoene som en injeksjon tallerken ved hjelp av en plast pasteur pipette.
- Injiser 2 nl mRNA inneholdende oppløsning i cellen, eller bare under cellen inn i eggeplomme ved en-celletrinnet 11.
- Overfør injisert embryo i en petriskål som inneholder 1x E3 medium, fjerne ubefruktede eller ikke normalt utviklings embryo og dyrke dem ved 28 ° C.
Merk: Lys beskyttelse of embryoene er ikke nødvendig i løpet av eksperimentet. - Hev sebrafisk embryo i 1x E3 medium og tilsett 0,2 mM PTU (1-fenyl-2 tiourea) etter gastrulation å hemme pigmentering. Skift medium to ganger per dag for å minimere faren for bakterielle forurensninger.
3. Embryo Inkludering
- Velg GFP (grønt) og PSmOrange (oransje / rød) co-uttrykke embryoer ved hjelp av en kikkert mikroskop utstyrt med en fluorescens lampe og aktuelle emisjonsfiltre. Overfør de positive embryoene i en steril petriskål som inneholdt 1 x E3 medium.
- Dechorionate embryoer under ett stereo bruker tang 12.
- Overføre en embryo i et 1,5 ml rør inneholdende 1,0 ml forvarmet 1,0% lavtsmeltende agarose (LMA) fremstilt i ultrarent vann ved hjelp av en cut-spiss pipette (P200). Merk: Varm LMA-tillatelsen til 80 ° C og avkjøles i 3-5 min ved romtemperatur før innstøping embryo.
- Overfør embryoet i 150 ul LMA inn i enkamret coverglass og juster embryo orientering, for eksempel med ryggsiden ned i eksperimentet som er beskrevet for den inverterte konfokal laser scanning mikroskop A1R + (eller hvilken som helst annen passende mikroskop), ved hjelp av en fin plastspiss. Når LMA er polymerisert, fylle kammeret med fisk vann inneholdende 0,2 mM PTU og 0,02% etyl-3-aminobenzoat metansulfonat (Tricaine) for anestesi.
- Før bildedannelse av prøven, vent i 15 minutter for å fastslå virkningen av Tricaine. Anestesi hindrer fosteret bevegelser, som kan overvåkes ved hjelp av en stereomikroskop utstyrt med lysfelt belysning.
Merk: Kamrene kan gjenbrukes to ganger.
4. PSmOrange Photoconversion
- Plasser prøven under konfokal mikroskop og skanne prøven for å identifisere området til photoconvert bruker 488 nm og 561 nm lasere for bildebehandling henholdsvis GFP og PSmOrange.
Merk: Bruk den omvendte konfokal laser scanning mikroskop A1R + på den omvendte stage TiEcontrolled av mikroskop bildebehandling og utstyrt med 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere for photoconversion og bildebehandling. Imidlertid er søknaden absolutt ikke begrenset til denne mikroskop så lenge laserlinjer for konvertering og avbildning er tilgjengelig.- Sett 20X luft objektiv på plass (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Bruk følgende mikroskop innstillinger for å oppdage PSmOrange protein før photoconversion: 561 nm laser, 0,74 mW målt i fokus planet over målet.
Merk: Dette tilsvarer 40% av dette system (måling i fokusplanet er den eneste måten for å bestemme den effektive kraft). Juster laser kraft i henhold til eksperimentelle behov som effektiviteten i H2B-PSmOrange injeksjoner kan variere. - Legg zoom faktorer for å markere området av interesse. Høyere forstørrelse redusere bildeinnhentingstiden og dermed fototoksisitet.
- Erverve en z-stack dekker strukturens av interesse å bruke 488 nm og 561 nm lasere i sekvensiell modus (linje-modus 1-> 4). Fest z-trinn mellom 1,0 og 2,0 mikrometer. Linje gjennomsnitt og frekvensen kan brukes for å optimalisere bildekvaliteten.
- Skann prøven og velg region av interesse (ROI) verktøy for å utheve området photoconvert. Fest ROI som stimulering området. Velg Photo Aktivering / Bleking modul, aktivere 488 nm laser ved å merke den aktuelle boksen og setter 488 nm laser til 80% (1 mW laser effekt målt på objektiv). Sett skannehastighet til 0,5 sek / ramme.
- Åpne photoconversion verktøyet (ND Stimulering) og angi photoconversion innstillinger.
- Klikk på "Legg til" kommandoen til å angi photoconversion protokollen.
- Sett "Phase" en i "Acquisition / Stimulering" -menyen til "Erverv" og angi antall bilder som kan erverves før photoconversion i "Loops" -menyen.
- Sett "Phase" to til "Stimulation "og skriv antall stimulerings hendelser som skal utføres.
- Juster "Phase" 3 som beskrevet for "Phase" 1. Eventuelt sette inn en ventende "Phase" etter "Phase" 2 ved å legge inn tid til å vente før den siste runden av bildet oppkjøpet.
- Når alle parametere er satt, gjelder stimulering innstillingen og kjøre photoconversion.
Merk: Laser makt, hyppighet av skanning og antall gjentakelser for hver runde av photoconversion kan variere og avvike fra embryo til foster. En innstilling til å begynne med, er vist i tabell 1.
- Erverve en endelig z-stack bruker 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere som gjelder innstillingene som ovenfor. Sett 640 nm laser for å visualisere den konverterte PSmOrange ved hjelp av høy lasereffekt (opp til 4,5 mW).
5. Demonter Embryo fra LMA
- Fjern embryoet kammeret som inneholder fra mikroskopet. Fjern forsiktig embryo fra agarose usynge tang.
- Overfør embryoet inn i en ny sterilisert plast petriskål eller i en sterilisert 6-brønn-plate inneholdende 1 x E3 og 0,2 mM PTU. Inkuber embryoet ved 28 ° C inntil det ønskede utviklingstrinn.
6. Analysere Fate of Photoconverted PSmOrange Protein uttrykke celler
- Re-legge embryoet som beskrevet under punktene 3.3 og 3.4.
- Plasser prøven under konfokal mikroskop og skanne prøven for å identifisere photoconverted celler (640 nm) i GFP transgene strukturen av interesse (488 nm).
- Erverve en z-stack dekker strukturer av interesse å bruke 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere i sekvensiell modus (linje-modus 1-> 4). Fest z-trinn mellom 1,0 og 2,0 mikrometer. Linje gjennomsnitt og frekvensen kan brukes for å optimalisere bildekvaliteten.
- Bruk en av følgende metoder for å identifisere celler, som co-express GFP og photoconverted protein.
- Skreddersydde automatisk Fiji bildeJ Macro 3
- Slør bunken med originaler ved hjelp av "GaussianBlur" plugin (→ Prosess → Filter → GaussianBlur) og trekke den glatte stabler fra den opprinnelige hjelp av "Image Calculator" plugin (→ Process → Bilde kalkulator). Bruk av dette trinnet for å visualisere de strukturer av interesse og redusere beregningstiden for analysen.
- Påfør bestemte terskler til de grønne og vidt røde kanaler for å markere de photoconverted celler (→ Bilde → Juster → Terskel). Bruk "Analyze partikler" verktøy for å oppdage terskel områder med en innstilling (→ Analyze → Analyser Particles).
- Åpne "Image Calculator" plugin og vise de overlapp Rois i det grønne og vidt røde kanalen i gult (→ Process → Bilde kalkulator).
- Mikroskop bildebehandling programvare for 3D dataanalyse
- Vis stabelen i3D ved hjelp av visningsalternativ showet volum (→ 3D Visualisering Meny → Vis volum View). Bruk grafisk grensesnitt for å velge de grønne, røde og vidt røde kanaler, justere lysstyrken og kontrasten og beskjære 3D bunken for å markere photoconverted området (figur 1).
Merk: Lignende metoder for å analysere dataene er tilgjengelig i de fleste av felles programvare for bildeanalyse.
- Vis stabelen i3D ved hjelp av visningsalternativ showet volum (→ 3D Visualisering Meny → Vis volum View). Bruk grafisk grensesnitt for å velge de grønne, røde og vidt røde kanaler, justere lysstyrken og kontrasten og beskjære 3D bunken for å markere photoconverted området (figur 1).
- Skreddersydde automatisk Fiji bildeJ Macro 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer et eksempel på PSmOrange photoconversion system. Pineal komplekset er en fredet struktur i virveldyr rygg diencephalon. Som i mange andre virveldyr, dette komplekset består av pineal organ i midten av diencephalon og venstre-sidede parapineal celler. Elegante men tidkrevende uncaging eksperimenter viste at parapineal celler stammer i fremre del av pineal orgel 13. I tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgene embryoer, er begge pineal og parapineal celler merket under utvikling. For å vurdere hensiktsmessigheten av PSmOrange systemet vi brukte disse embryoene til å reprodusere den rapporterte pineal kompleks utvikling. 260 pg mRNA som koder for det nukleære form av PSmOrange, H2B-PSmOrange, ble injisert i en celle-trinns doble transgene embryoer for å uttrykke proteinet i alle cellekjerner. Injiserte embryoer ble inkubert ved 28 ° C inntil 24 timer etter fertilization (HPF), valgt for GFP og sterk H2B-PSmOrange ekspresjon og innleiret i LMA i et kammer, dekkglass system med dorsalsiden orientert mot bunnen. Prøven ble plassert under en invertert confocal laser scanning mikroskop styrt av mikroskop bildebehandling og utstyrt med 488 nm, 561 nm og 640 nm lasere og en 20X luft mål for photoconversion og sporing. To cellegruppene i fremre del av pineal ble photoconverted og umiddelbart avbildes (figur 1A - F). De photoconverted Cellene kan bli visualisert ved bruk av 640 nm laser (langt rød - figur 1C), men ikke med den 561 nm laser (orange / rød - figur 1B). GFP-ekspresjon i disse cellene først ble også redusert på grunn av fotobleking (figur 1A, 1D, 1F). På 52 HPF GFP og H2B-PSmOrange ble oppdaget i photoconverted H2B-PSmOrange protein uttrykke celler (Figur 1A '- F'). Faktisk kan noen av disse cellene dannet parapineal på venstre side av hjernen (pilspisser i Figur 1A '- F'). Dette resultatet er i overensstemmelse med tidligere rapporter om den parapineal celleopprinnelse, og viser anvendbarheten av PSmOrange teknikk i den levende virveldyr embryo.
. Figur 1. Identifisere parapineal celle opprinnelse bruker PSmOrange photoconversion system i levende sebrafisk embryoer (A - F ') Rygg synspunkter med anterior til toppen fokusert på rygg diencephalon av en tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) transgene embryo fremhever pineal (P) og parapineal celler (pp) på (A - F) 26 HPF umiddelbart etter photoconversion og (A '- F & # 39;) 26 timer senere ved 52 HPF. Embryoet ble injisert med mRNA som koder H2B-PSmOrange. Bildene viser 3D rekonstruksjoner. Ekspresjon av (A, A ') transgen GFP, (B, B') ikke omdannes H2B-PSmOrange (rød kanal) og (C, C ') etter photoconversion (far-rød kanal). Hvite stiplede sirkler markere det området photoconversion, som er blottet for orange / rød fluorescens. (D, D ') Merge av alle tre kanaler (grønn, rød, langt-rød), (E, E') rød og vidt røde kanaler og (F, F '), grønne og røde langt-kanaler. (A'-F ') Hvite pilspisser markere plasseringen av parapineal celler, som viser grønt, oransje / rød og langt rødt fluorescens. (AF ') Målestokk vises på høyre hjørne på hvert bilde.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Fase | Antall Loop | aktive Lasere |
| Kjøps | en syklus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Stimulering | 15 til 30 sykluser | 488 nm |
| modning | 1 min | # |
| Kjøps | en syklus | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabell 1: Vilkår for H2B-PSmOrange photoconversion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transgene embryoer bærer fluorescerende reportere har hjulpet fundamentalt for å forstå embryonal utvikling. Det er imidlertid fremdeles vesentlig behovet for promotorer for å lette den spesifikke visualisering av bestemte strukturer. I deres fravær, forskere avhengige av teknikker som photoconversion av fluorescerende proteiner for å finne ut om opprinnelsen og utviklingen av deres struktur av interesse. Dette i sin tur er en avgjørende forutsetning for å identifisere de molekylære mekanismene som er involvert i utviklingen. Tekniske fremskritt i sebrafisk feltet nå tillater å erstatte FP i transgene linjer med, for eksempel, photoconvertible proteiner ved hjelp av en CRISPR-Cas9 mediert knock i tilnærmingen 14,15. Imidlertid er denne teknikk forholdsvis tidkrevende og ikke alltid vellykket. I motsetning til anvendelsen av ubikvitært uttrykt H2B-PSmOrange i GFP og eventuelt andre transgene bakgrunn er en rett-frem teknikk for å følge celler gjennom embryonic utvikling.
For eksempel, opprinnelsen av sebrafisk ventrale habenulae, en del av en konservert neural ledningssystemet i dorsal diencephalon av virveldyr, har vært unnvikende inntil nylig, og følgelig ingen genetisk kaskade underliggende utviklingen ble avdekket. Bruke PSmOrange system og langsiktig time-lapse-analyse for å følge migrerende celler, kunne vi vise at i motsetning til rygg habenular kjerner, som stammer venstre og høyre ved siden av epifysen, ventral habenular nevroner utvikle posterior til denne regionen i thalamus tre. Denne kunnskapen tillot oss deretter å identifisere avgjørende funksjon av den kanoniske Wnt signale nedstrøms genet Tcf7l2 for ventral habenular neuron utvikling.
Anvendelsen av photoconvertible PSmOrange Systemet er enkelt, raskt og har den fordelen over photoactivatible proteiner som embryoer kan velges for sterk protein uttrykk før belysning. syntetisk mRNA som koder for H2B-PSmOrange injiseres i GFP-transgene embryo til overalt å uttrykke den oransje fluorescerende protein i alle kjerner. Vi har ikke støtt på noen bivirkninger ved injeksjons og proteinet er stabil i minst 96 timer. Proteinet blir deretter photoconverted i GFP-transgene celler i avkastningen ved bruk av en 488 nm eksitasjon laser og embryoet kan analyseres for den nå langt-rød fluorescerende protein inneholdende celler i den etterfølgende ca 48 timer. Det er viktig å overvåke vellykket photoconversion som betingelser kan variere avhengig av utviklingsstadiet av embryoet og det vevet som er objekt. Mikroskopet bildebehandling får et bilde av hver kanal (grønn, rød og langt rødt) før og etter photoconversion. Den photoconversion effektivitet kan evalueres måle gjennomsnittlig intensitet fluorescens i avkastningen mellom de ulike kanalene før og etter photoconversion. Hvis ingen vidt rød fluorescens oppdages umiddelbart etter photoconversion annonsesjonelle runder med photoconversion må brukes. GFP bleking er vanlig etter photoconversion. Men den kontinuerlige translasjon av transgene fluorescerende protein overvinner dette problemet innen omtrent 2 timer.
En skreddersydde makro for Fiji ImageJ å lette identifikasjon av celler co-uttrykker photoconverted protein og det transgene GFP er tilgjengelig tre. Future etablering av stabile transgene linjer som uttrykker H2B-PSmOrange vil ytterligere forenkle denne prosedyren. Det vil også legge til rette for analyse av utviklings hendelser etter 4 dager etter befruktning, som kan ha spennende verdi å undersøke områder som vev gjenfødelse. I tillegg vil en kombinasjon av mordyret uttrykker PSmOrange transgene og time-lapse imaging 16 være et kraftig verktøy for å undersøke celle trekkende hendelser som starter før gastrulation på en enkelt celle nivå. Andre applikasjoner kan omfatte utveksling av H2B atom tag med, feller forekomst, GAP43 å visualisere cellemembraner og potensielt axoner i utvikling av embryo.
En begrensning med denne teknikken er at den bare zygotiske proteinet begynner å bli uttrykt etter gastrulation, og er derfor ikke anvendelig for analyse av gastrulation prosesser. Det må også tas i betraktning at det er ganske vanskelig å photoconvert proteinet i celler som ligger dypt i embryo. Photoconversion innstillingene må tilpasses den høye laser makt og relativt lang stimulering tiden som er nødvendig for photoconversion kan føre til vevsskade, som krever nøye overvåking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
