Abstract
Imagiologia de substratos hiperpolarizados por ressonância magnética mostra uma grande promessa clínica para avaliação de processos bioquímicos críticos em tempo real. Devido a restrições fundamentais impostas pelo estado hiperpolarizado, técnicas de imagem e reconstrução exóticas são comumente usados. Um sistema prático para a caracterização de, métodos de imagem multi-espectral dinâmicos é extremamente necessárias. Este sistema deve reproducibly recapitular a dinâmica químicos relevantes dos tecidos normais e patológicos. O substrato mais amplamente utilizado para data é hyperpolarized [1- 13 C] -pyruvate para avaliação do metabolismo do câncer. Descreve-se um sistema de fantasma à base de enzima que medeia a conversão de piruvato em lactato. A reacção é iniciada pela injecção do agente de hiperpolarizado em câmaras múltiplas dentro do fantasma, cada um dos quais contém diferentes concentrações de reagentes que controlam a velocidade de reacção. Vários compartimentos são necessárias para garantir que imasequências ging fielmente capturar a heterogeneidade espacial e metabólica do tecido. Este sistema vai ajudar o desenvolvimento ea validação de estratégias avançadas de imagem, fornecendo dinâmica química que não estão disponíveis a partir de fantasmas convencionais, bem como controle e reprodutibilidade que não é possível in vivo.
Introduction
O impacto clínico da ressonância magnética hyperpolarized (MRI) de 13 compostos C-rotulados é criticamente dependente da sua capacidade de medir as taxas de conversão química através de tempo real de ressonância magnética e espectroscopia espectroscopia de imagem 1-5. Durante o desenvolvimento e sequência de verificação, de conversão química dinâmica é geralmente conseguida através do in vivo ou in vitro modelos 6-9 que oferecem controlo limitado e reprodutibilidade. Para o ensaio robusto e de garantia de qualidade, um sistema mais controlado que preserva a conversão química endémica para esta medição seria preferido. Nós descrevem um método para alcançar essa conversão de uma forma reproduzível usando um único fantasma enzima dinâmico.
A maioria dos estudos com agentes hiperpolarizados 13 C concentrar em imagiologia de substratos hiperpolarizados num ambiente biológico em funcionamento. Esta é a escolha óbvia se o objetivo é estudar biológicaal processa ou determinar o potencial de impacto sobre cuidados clínicos. No entanto, se a caracterização de algum algoritmo de processamento de sistema de medição ou de dados é desejada, modelos biológicos têm inúmeras desvantagens, tais como variabilidade espacial e temporal inerente 10. No entanto, fantasmas estáticos convencionais não têm a conversão química que conduz o interesse clínico primário em MRI de substratos hiperpolarizados, e não pode ser utilizado para caracterizar a detecção das taxas de conversão e outros parâmetros dinâmicos 11. Usando um único sistema enzimático que possamos fornecer conversão química controlável e reprodutível, permitindo uma análise rigorosa das estratégias de imagem dinâmicos.
Este sistema é dirigido aos investigadores que estão a desenvolver estratégias de imagem para substratos hiperpolarizados e desejam para caracterizar o desempenho para comparação com abordagens alternativas. Se as medições estáticas são o ponto final desejado, em seguida, estático 13 metabólito labled-C fantasmas wivai bastar 11. Na outra extremidade se mais caracterização biológica complexa é crítico para o método (a entrega, a densidade celular, etc), então os modelos biológicos reais será necessário 14/12. Este sistema é ideal para a avaliação das estratégias de imagem que visam fornecer uma medida quantitativa das taxas de conversão química aparentes.
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Protocol
NOTA: (Fantasma de Design) Dois 3 ml câmaras foram usinadas fora de Ultem e equipado com um tubo de PEEK (1,5875 milímetros OD e 0,762 mm de diâmetro) para injecção e de escape. As câmaras foram colocados num tubo de centrífuga de 50 ml cheia de água (Figura 1). Para evitar espaços vazios criados pelo sinal bolhas, as câmaras e as linhas foram pré cheia com água desionizada (dH2O).
1. Preparação de Soluções
- Prepare 1 litro solução tampão (Tris 81,3 mM pH 7,6, NaCl 203,3 mM). Pesar 11,38 g de Trizma cristais predefinidos pH 7,6 e 11,88 g de NaCl e dissolvem-se em 1 L de dH2O
- Preparar solução de 50 mM de NADH. Pesar 17,8 mg de sal de dipotássio β-nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADH), reduzida e dissolve-se em 280 ul de solução tampão que foi preparado no passo um.
- Preparar solução de 250 U / ml de enzima. Pesar 78,75 unidades de actividade de lactato desidrogenase (LDH) e dissolve-se em 315 ul de tampão de step uma.
- Prepare mistura de ácido pirúvico. Pesar 21,4 mg Ox063 radical tritilo e dissolve-se em 1,26 g (~ 1 ml) [1- 13 C] ácido pirúvico.
- Prepare meio de dissolução (40 mM Tris pH 7,6, NaOH 40 mM, EDTA 0,27 mM e NaCl 50 mM). Pesar 5,96 g de Trizma cristais predefinidos pH 7,6, 1,6 g de NaOH, 0,1 g de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado sal dissódico (EDTA) e 2,9 g de NaCl e dissolvem-se em 1 L de dH2O
- Preparar solução 1:10 gadoteridol (50 mM). Misture 1 ml de gadoteridol em 9 mL de dH 2 O. Preparação de 8 M de [13 C] ureia. Pesar 1,465 5 [13 C] ureia e dissolvem-se em 3 ml de dH 2 O.
2. Preparação de hyperpolarized Piruvato
- Em um copo de amostra de um sistema dinâmico de polarização Nuclear (DNP), pipeta de 0,3 ul da solução gadoteridol e 13 mg (~ 10 ul) da solução de ácido pirúvico.
- Resumidamente agitar esta mistura no copo de amostra com a ponta da pipeta. </ Li>
- Insira amostras para o sistema DNP.
- Assegurar a porta do sistema de DNP é fechada. Iniciar o processo de inserção de amostra clicando no botão amostra inserção no console do sistema DNP. No assistente de amostra selecionar amostra normal e pressione próximo.
- Mantendo o copo de amostra vertical, coloque delicadamente a haste de inserção sobre o topo do copo de amostra. Quando solicitado, abra o sistema DNP e inserir o copo na inserção de temperatura variável (VTI) com a cavilha de inserção.
- Puxar o êmbolo na extremidade da vareta de inserção da amostra para libertar a amostra do índice de temperatura variável. Retire a vareta de inserção amostra do sistema e clique no botão junto no console do sistema DNP.
- Inicia-se a polarização.
- Clique no botão Iniciar polarização no console do sistema DNP. No RINMR tipo de software .HYPERSENSENMR para lançar polarização software de monitoramento. Definir construir configuração para 1 e pressione enter. Em seguida, clique construção sólida up.
- Definir o local eo nome do arquivo salvo. Selecione o perfil de 13-C na queda de guia no console do sistema DNP para baixo e clique em Avançar. Marque a caixa para provar durante a preparação, tempo de amostra definida para 300 segundos e clique em Concluir.
- Medir-se 3,85 g (~ 4 ml) do meio de dissolução, quer por volume com uma seringa de 5 ml ou em peso, utilizando uma balança.
3. Preparação da Enzima Fantasma
- Encher um tubo de microcentrífuga com ~ 3 ml de [13 C] a solução de ureia e colocá-lo no tubo de centrífuga de 50 ml. Encha o tubo de centrífuga de 50 ml com dH 2 O.
- Pré-preencher as duas câmaras de enzimas e as linhas com dH2O, injetando ~ 3 ml de dH2O para as linhas de injeção do fantasma, tendo o cuidado de lavar quaisquer bolhas formadas.
- Coloque o fantasma no centro do magneto, com fácil acesso às linhas de injeção. Verifique se há algum recipiente para pegar o líquido que vai exalar para fora para t ele linha de escape.
- Prepare mistura de enzimas de alta atividade (NADH 17,14 mM, 44.57 U / ml LDH). Misture a solução NADH 240 ul, 125 ul de solução de LDH e 335 ul de tampão e manter-se em uma seringa de 3 ml, que pode ser ligado à linha de injecção.
Observação: Uma vez combinados com os 500 ul de piruvato de 40 mm a partir do sistema de DNP, o volume fantasma final será de 1,2 ml com concentrações de piruvato 16,7 mM, NADH 10 mM, e 26 U L LDH de / em uma solução tamponada com Tris com pH ~ 7.5. - Prepare baixo mistura actividade enzima (17,14 mM de NADH 26,79 U / ml LDH) Misturar 240 ul de solução de NADH, 75 ul de solução de LDH e 385 ul de tampão e manter-se em separado uma seringa de 3 ml, que pode ser ligado à linha de injecção.
Observação: Uma vez combinados com os 500 ul de piruvato 40 mM a partir do sistema de DNP o volume fantasma final será de 1,2 ml com concentrações de piruvato 16,7 mM, NADH 10 mM, e 15.625 U L LDH de / em uma solução tamponada com Tris com pH ~ 7,5 .
- posicionamento inicial.
- Carregar uma nova varredura posicionamento FLASH no modo de operação [1 H] TX / RX modo de Volume. Alterar criados dimensões a 2: Ferramenta de Controle Spectrometer -> Editar GS -> Configuração Dimensões -> 2. Pressione GSP no Controle Spectrometer e mover phantom até centrado no ímã. Prima STOP, em seguida, pressione GOP sobre o Controle Spectrometer.
- Piloto Scan.
- Carregar uma nova varredura posicionamento TriPiolt no modo de operação [1 H] TX / RX modo de Volume. Posição Slice: Controle de Digitalização -> Slice Tool-> mover as fatias (segure M clique de tecla e arrasto; selecione fatia para mover-se com o controle deslizante pacote de fatia).
- Wobble H bobina 1: Ferramenta de Controle Spectrometer -> Acq -> Wobble. Tune and match 1 H bobina atrás do ímã e pressione STOP. Enquanto mantém a tecla Shift pressione o semáforo na janela de controle de digitalização.
- Carregar um planar echo imagens espectroscópicas nova radial (radEPSI) digitalizar no modo de operação [13 C] TX / RX modo de Volume. Posição Slice: Slice Tool no controlo de digitalização e mover as fatias (segure M clique de tecla e arrasto; selecione fatia para mover-se com o controle deslizante pacote de fatia).
- Wobble 13 C bobina clicando Ferramenta de Controle Spectrometer -> Acq -> Wobble. Defina o ganho do receptor para 1000-2000 na Spectrometer.
- Realizar a verificação final do sistema. Dependendo da sequência, observar o sinal de carbono 13 da câmara de ureia num protocolo de batedor.
NOTA: Isso garante que o sistema está configurado corretamente antes de iniciar o processo de dissolução irreversível.
6. Run Dissolução
- Quando o piruvato alcançou> 90% de polarização (~ 1 hora), as soluções e phantom estão prontos, ea digitalização é configurado clique no botão de execução dissolução na sy DNP-tronco console.
- Quando solicitado mover a alavanca de dissolução em posição de funcionamento e injetar meios de dissolução. Feche o sistema de DNP e clique no botão acabado no console do sistema DNP. Mova vara dissolução de volta à posição de repouso quando solicitado, em seguida, clique em Concluir.
- Quando o sistema proporciona o DNP piruvato hiperpolarizado (~ 2 min após o início do aquecimento) retirar a 500 ul da solução de piruvato para cada uma das seringas solução de alta e baixa concentração de enzima. Lentamente (~ 10 seg) injectar cada seringa para uma linha de injecção.
Nota: A digitalização pode ter sido iniciada antes da injecção ou a qualquer momento se a injecção de pós 3 minutos, dependendo do protocolo de verificação utilizado.
Processamento 7. Imagem
NOTA: Este simulador foi projetado para uso com muitas estratégias de imagem. Ver Figura 2, como um exemplo de como as imagens Rad-Epsi foram processados usando Matlab.
- Carregar dados brutos a partir do arquivo FID. Reshape os dados para coincidir com o número de projeções, leu pontos, ecos e conta para os dados armazenados como pares reais e imaginários. Separar os pontos de eco pares e ímpares.
- Transformada de Fourier, quer os ecos pares ou ímpares ao longo das dimensões de eco. identificar visualmente as faixas de frequências para piruvato e lactato. Para simplicidade foi utilizado o valor absoluto do espectro.
- Separe cada banda metabólito e transformada de Fourier ao longo da direção de codificação de frequência para produzir sinograms isoladas para cada metabólito. radon inversa transformar as sinograms separadas para produzir uma imagem de lactato ou piruvato.
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Representative Results
imagens 2D fatia selectivos foram adquiridos utilizando uma sequência instantâneo radEPSI. imagens de metabólitos foram reconstruídos usando filtrada volta projeção. As imagens metabolito foram bem alinhados com as imagens de protões, como se vê na Figura 2. Nesta sinal lactato hyperpolarized sistema só pode ser gerado a partir da conversão enzimática de piruvato hiperpolarizado. Na Figura 4, a câmara de fundo, com a maior concentração de LDH, tem uma forte lactato e piruvato de sinal mais fraco, em comparação com a câmara superior. Utilizando os sinais relativos metabolitos como uma estimativa da concentração de enzima do lactato para piruvato proporção é de 1,47 vezes mais elevada na câmara inferior. A proporção da concentração de enzima real entre os compartimentos inferior e superior foi de 1,66 vezes o que está de acordo com os rácios áspera de sinal (Figura 4).
imagens curso de tempo foram geneclassificado utilizando uma sequência ideais (Figura 3). foi novamente observada concordância forte entre as imagens de metabólitos e a referência de protões. Observe que nenhum fantasma ureia estava presente para este estudo. Na câmara alta enzima à direita, um sinal muito forte de lactato inicial é observado. A reacção foi catalisada quase completamente no momento em que foi entregue no interior da câmara (9 entrega seg, 12 seg pico de lactato). A reacção progrediu mais lentamente na câmara de baixa concentração de enzima (à esquerda). É também notável que menos sinal de piruvato foi observada na câmara de enzima elevada como mais do que o sinal foi convertida em lactato.
Figura 1. Fantasma esquemática: (A) Diagrama mostrando o desenho da câmara. Câmaras A e B equipado para injectáveis e linhas de escape. A câmara é selada ureia, uma vez que não necessita de ser injectared durante a aquisição. (B) Foto de phantom desmontada mostrando as câmaras, linhas de injeção e tubo de 50 ml. O sistema fantasma montado com as linhas de injeção envolvidos em torno de modo que os conectores de seringa no final das linhas está no frame (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens metabolitos usando rad-EPSI. Imagens coronais geradas a partir de duas bandas espectrais separadas, piruvato (centro) e lactato (direita). A câmara superior tem sinal visivelmente mais piruvato e menos sinal de lactato do que a câmara inferior. Uma imagem de protões (à esquerda) foi adquirida após imagiologia agentes hiperpolarizados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Curso de imagens em tempo metabolito usando uma sequência IDEAL. Axial imagens desta série foram adquiridos em 3-sec intervalos. Piruvato (parte superior) e lactato (em baixo) são exibidos sobre a imagem de prótons em tons de cinza. lactato forte e sinais mais fracos piruvato são observados na câmara direita que contém a concentração de enzima mais elevada. A câmara de esquerda, com concentração de enzima inferior, mostrou menos lactato e piruvato de sinal mais forte. As câmaras são nulas de sinal hyperpolarized pela primeira 9 seg porque a verificação foi iniciada antes da injeção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 4 "src =" / files / ftp_upload / 53607 / 53607fig4.jpg "/>
Figura 4. imagens processadas: as magnitudes médias de sinal para cada câmara mostrado sobre as imagens de metabólitos combinados (à esquerda). A diferença na concentração de lactato para piruvato proporções para as câmaras superior e inferior qualitativamente coincidir com a diferença de actividades enzimáticas usadas, mostrados como gráficos de barras (direita).
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Discussion
imagens em tempo real de metabólitos hiperpolarizados tem muitos desafios únicos para o projeto de sequência, validação e controle de qualidade. A capacidade de resolver a heterogeneidade espaço-temporal e espectral oferece potencial clínico substancial, mas opõe-se a métodos de controle de qualidade e validação associados com a RM convencional. sequências de imagens complexas ou algoritmos de reconstrução pode ter dependências sutis que os tornam difíceis de caracterizar ou validar fora da experiência de imagem. Heterogeneidade biológica e outras preocupações práticas limitar o uso de in vivo e modelos in vitro para caracterizar ou validar sequências, hardware ou algoritmos de processamento de dados.
Com múltiplos compartimentos espaciais e evolução química dinâmica, é possível recapitulam as características críticas associadas com substratos hiperpolarizados imagiologia in vivo, mas de uma maneira controlada. Regiões de alta e baixa atividade da enzima fornecer reproducicontraste dinâmico ble para a avaliação de biomarcadores de imagem qualitativos e quantitativos. As variações espaciais garantir distorções geométricas, desalinhamentos e outras fontes comuns de erro são contabilizados corretamente.
Enquanto mais controlável do que os sistemas vivos as taxas de reação catalisada pela LDH ainda são condições experimentais muito sensíveis e são uma importante fonte de incerteza. Criticamente, LDH é sensível à temperatura. Se as medições posteriores devem ser comparadas grande cuidado deve ser tomado para que o quarto e temperaturas líquidas permanecem constantes em todas as medições. Além disso, as elevadas concentrações de piruvato associada com estudos hiperpolarizados obriga a utilização de concentrações elevadas do coenzima NADH e a enzima LDH. Estas concentrações elevadas geralmente não permitem que os pressupostos de pouca ou nenhuma inibição da enzima ou um substrato particular, estar em excesso de concentração. Se a caracterização rigorosa das cinética química foi desejado provávelAs concentrações de diferença de reagentes seriam necessárias para recuperar esses pressupostos. No entanto, esta formulação irá resultar na produção de lactato hiperpolarizado a taxas variáveis em cada compartimento que deverá ser suficiente para a validação de mais imagens.
Se pouco ou nenhum sinal de lactato é observado um primeiro lugar para verificar seria a actividade da enzima, que podem precisar de ser substituído. Adicionalmente variação na distribuição nos compartimentos fantasmas provoca incerteza no valor de sinal de hiperpolarizado. Para reduzir estas fontes de variabilidade que é crítico que a quantidade de piruvato hiperpolarizado adicionados a cada câmara é medido com precisão e é adicionado suavemente. O decaimento do sinal inerente de piruvato hyperpolarized complica essa tarefa, colocando prazos rigorosos na injeção. O trabalho futuro incidirá sobre a implementação de um mecanismo de injecção automatizado que permitirá que o processo de introdução piruvato hyperpolarized à mistura enzimáticae injeção subseqüente no fantasma para ser máquina controlada. Este sistema irá remover o erro humano na medição da quantidade de piruvato adicionado a cada câmara, bem como aumentar a velocidade de entrega para o scanner. Nomeadamente, o piruvato hiperpolarizado foi retirada para as seringas contendo a mistura de enzima antes de todo o volume foi injectada para dentro das câmaras. Isto foi feito para permitir que o processo de injecção, para auxiliar na mistura do piruvato com a mistura de enzima. Uma limitação deste método é que a reacção de piruvato em lactato é iniciado antes da mistura está no scanner e, por conseguinte, a parte inicial da reacção não é medido. Futuro refinamento da concepção da câmara terá como objectivo permitir que as câmaras de ser pré preenchido com a mistura de enzimas e apenas a piruvato hiperpolarizado injectado enquanto ainda assegurar uma mistura suficiente dos conteúdos da câmara como piruvato chega.
Em comparação com fantasmas estáticos este sistema tem algumas limitações. a dependence em alguma reação química dinâmica limita esses fantasmas para uso individual. Após a injecção as linhas e as câmaras terão de ser limpo e soluções de reagentes frescos terá de ser utilizada, ou a partir de alíquotas descongelados. Enquanto o único fantasma enzima captura alguns de comportamento químico dinâmico não fielmente recapitular um sistema biológico real. Em sistemas vivos piruvato está envolvido em várias vias bioquímicas complexas e simples a conversão de piruvato em lactato, na presença de co-enzima com um único isoforma enzimática é uma simplificação substancial. Além disso, se vascular ou alguma outra forma de entrega, bem como qualquer tipo de absorção celular são críticos para a medição de este sistema será provavelmente um modelo insuficiente. O único fantasma enzima é um compromisso que se concentra em alguma reação química, não é tão repetitivo ou prático como um fantasma estática, mas ainda é mais repetível que os sistemas vivos. A reprodutibilidade deste sistema é caracterizado bY variação na medição repetida, de 15 a 20 por cento, em comparação com os estudos em animais que têm entre 25 a 40 por cento grupo Variabilidade intra 10. Além disso, ele não modelar cada aspecto de células ou tecidos vivos, mas mantém o comportamento dinâmico crítico que é perdida quando se utiliza um fantasma estática.
Este sistema fantasma foi concebido para funcionar com uma variedade de técnicas de imagiologia. Com uma plataforma tão flexível os exames de controle de qualidade e aquisições hiperpolarizados desempenho acima são intercambiáveis com a sequência ou protocolos utilizados por outra instituição. Para ilustrar isso foi realizado um estudo semelhante sobre um scanner GE 3T utilizando uma sequência personalizada IDEAL com resultados semelhantes.
Hiperpolarizado MRI de [1- 13 C] -pyruvate mostra uma grande promessa devido à sua capacidade para investigar in vivo metabolismo do câncer em tempo real. Curiosamente, a sensibilidade desta técnica é um grande desafio ao desenvolver ou validar measuremtécnicas ENT. Utilizando uma única enzima fantasma é possível recriar as dinâmicas temporais e espaciais que são críticos para a medição de agentes hiperpolarizados por ressonância magnética de uma maneira prática, controlável e reproduzível necessário para ser útil para o desenvolvimento e verificação.
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Disclosures
A publicação deste vídeo-artigo é apoiado por Bruker corporação.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão CPRIT (RP140021-P5) e um prêmio Julia Jones Cancer Research Scholar Matthews CPRIT formação em investigação (RP140106, CMW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpect 7T | Bruker | BioSpec 70/30 USR | 7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner |
| HyperSense | Oxford Instruments | Hypersense DNP Polarizer | Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents |
| 1-13C-Pyrvic Acid | Sigma Aldrich | 677175 | Carbon 13 labled neat pyruvic acid |
| Trityl Radical | GE Healthcare | OX063 | Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| LDH | Worthingthon | LS002755 | Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle |
| NADH | Sigma Aldrich | N4505 | β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt |
| Trizma | Sigma Aldrich | T7943 | Trizma Pre-set crystals |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 |
References
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