Abstract
Imaging de sustratos hiperpolarizados por resonancia magnética muestra una gran promesa clínica para la evaluación de los procesos bioquímicos críticos en tiempo real. Debido a las limitaciones fundamentales impuestas por el estado hiperpolarizado, se utilizan comúnmente las técnicas de imagen y de reconstrucción exóticos. Se necesita con urgencia un sistema práctico para la caracterización de los métodos de imagen, multiespectrales dinámicas. Dicho sistema deberá referirse de forma reproducible la dinámica químicos correspondientes de los tejidos normales y patológicos. El sustrato más ampliamente utilizado hasta la fecha se hiperpolarizado [1- 13 C] piruvato para la evaluación del metabolismo del cáncer. Se describe un sistema de espectro a base de enzimas que media la conversión de piruvato a lactato. La reacción se inicia por la inyección del agente hiperpolarizado en múltiples cámaras dentro del fantasma, cada uno de los cuales contiene concentraciones de los reactivos que controlan la velocidad de reacción que varían. Múltiples compartimentos son necesarios para asegurar que imasecuencias ging fielmente capturar la heterogeneidad espacial y metabólica de los tejidos. Este sistema ayudará al desarrollo y la validación de estrategias avanzadas de imagen, proporcionando dinámica química que no están disponibles a partir de fantasmas convencionales, así como el control y la reproducibilidad de que no es posible en vivo.
Introduction
El impacto clínico de la resonancia magnética hiperpolarizado (IRM) de 13 compuestos marcados-C es críticamente dependiente de su capacidad para medir las tasas de conversión química a través del tiempo real de la espectroscopia de resonancia magnética y espectroscopia de imagen 1-5. Durante el desarrollo de la secuencia y de verificación, la conversión dinámica química se consigue generalmente a través de in vivo o en modelos in vitro de 6-9 que ofrecen un control limitado y reproducibilidad. Para la prueba robusta y garantía de calidad, se prefiere un sistema más controlado que preserva la conversión química endémica de esta medición. Describimos un método para lograr esta conversión de manera reproducible usando un fantasma dinámica sola enzima.
La mayoría de los estudios con 13 agentes de C hiperpolarizados se centran en la obtención de imágenes sustratos hiperpolarizados en un entorno biológico de funcionar. Esta es la opción obvia si el objetivo es el estudio biológicoAl procesa o determinar el potencial de impacto en la atención clínica. Sin embargo, si se desea caracterización de algún sistema de medición o de datos algoritmo de procesamiento, los modelos biológicos tienen numerosos inconvenientes tales como la variabilidad espacial y temporal inherente 10. Sin embargo, fantasmas estáticos convencionales carecen de la conversión química que impulsa el interés clínico primario en MRI de sustratos hiperpolarizados, y no se pueden utilizar para caracterizar la detección de tipos de conversión o de otros parámetros dinámicos 11. El uso de un sistema enzimático único que podemos proporcionar conversión química controlable y reproducible, lo que permite un examen riguroso de las estrategias de formación de imágenes dinámicas.
Este sistema está dirigido a los investigadores que están desarrollando estrategias de imagen para sustratos hiperpolarizados y desean para caracterizar el rendimiento de comparación con enfoques alternativos. Si las mediciones estáticas son el punto final deseado y estática 13 metabolito C-labled fantasmas will suficiente 11. En el otro extremo, si caracterización biológica más compleja es crítica para el método (entrega, la densidad celular, etc.), entonces se necesitan modelos biológicos reales 12-14. Este sistema es ideal para la evaluación de estrategias de imagen que tienen como objetivo proporcionar una medida cuantitativa de las tasas de conversión química aparentes.
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Protocol
NOTA: (Phantom Diseño) Dos cámaras de 3 ml fueron mecanizadas de Ultem y equipados con tubo de PEEK (1,5875 mm de diámetro exterior y 0,762 mm de diámetro) para inyección y escape. Las cámaras se colocan en un tubo de centrífuga de 50 ml llena de agua (Figura 1). Para evitar vacíos de señal creados por las burbujas, las cámaras y las líneas fueron precargada con agua desionizada (dH2O).
1. Preparación de la solución
- Preparar la solución tampón 1 L (81,3 mM Tris pH 7,6, NaCl 203,3 mM). Pesar 11,38 g de cristales de Trizma preestablecidos pH 7,6 y 11,88 g de NaCl y se disuelven en 1 l de dH2O
- Preparar la solución de 50 mM de NADH. Pesar 17,8 mg de la sal de dipotasio β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), reducida y disolver en 280 l de la solución tampón que se preparó en el paso uno.
- Preparar 250 solución U / ml de enzima. Pesar 78,75 unidades de actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) y disolver en 315 l de tampón de sTEP uno.
- Preparar la mezcla de ácido pirúvico. Pesar 21,4 mg Ox063 radical tritilo y se disuelven en 1,26 g (~ 1 ml) [1- 13 C] de ácido pirúvico.
- Preparar medios de disolución (40 mM Tris pH 7,6, NaOH 40 mM, EDTA 0,27 mM y NaCl 50 mM). Pesar 5,96 g de Trizma cristales preestablecidos pH 7,6, 1,6 g de NaOH, 0,1 g de ácido etilendiaminotetraacético deshidratado sal disódica (EDTA) y 2,9 g de NaCl y se disuelven en 1 L de dH 2 O.
- Preparar 1:10 solución gadoteridol (50 mM). Mezclar 1 l de gadoteridol en 9 l de dH2O Preparación de 8 M [13 C] urea. Pesar 1,465 5 [13C] urea y se disuelven en 3 ml de dH2O
2. Preparación de piruvato hiperpolarizado
- En una copa de muestra para un sistema dinámico Nuclear de polarización (DNP), pipeta 0,3 l de la solución gadoteridol y 13 mg (~ 10 l) de la solución de ácido pirúvico.
- Brevemente agitar esta mezcla en el vaso de muestra con la punta de la pipeta. </ Li>
- Insertar la muestra en el sistema de DNP.
- Asegúrese de que la puerta para el sistema de DNP está cerrada. Comience el proceso de inserción de muestra haciendo clic en el botón de muestra de inserción en la consola del sistema DNP. En el asistente muestra selecta muestra normal y pulse siguiente.
- Mantener la copa de muestra vertical, coloque suavemente la varilla de inserción sobre la parte superior de la copa de muestra. Cuando se le solicite, abra el sistema DNP e insertar la copa en el inserto de temperatura variable (IVT), utilizando la varilla de inserción.
- Tire del émbolo en el extremo de la varilla de inserción de la muestra para liberar la muestra en el índice de temperatura variable. Retire la varilla de inserción de muestra del sistema y haga clic en el siguiente botón de la consola del sistema DNP.
- Iniciar la polarización.
- Haga clic en el botón de inicio de polarización en la consola del sistema DNP. En el RINMR tipo de software .HYPERSENSENMR para poner en marcha un software de control de polarización. Establecer la acumulación de configuración a 1 y pulse Enter. A continuación, haga clic en construcción sólida up.
- Establecer la ubicación y el nombre del archivo de salvar. Seleccione el perfil para el 13-C en la pestaña desplegable en la consola del sistema DNP abajo y haga clic en siguiente. Marque la casilla para degustar durante la preparación, establecer el tiempo de la muestra a 300 segundos y haga clic en Finalizar.
- Medir 3,85 g (~ 4 ml) de los medios de disolución ya sea por volumen con una jeringa de 5 ml o en peso utilizando una escala.
3. Preparación de la enzima Phantom
- Llenar un tubo de microcentrífuga con ~ 3 ml de solución de urea [13C] y lo coloca en el tubo de centrífuga de 50 ml. Llenar el tubo de centrífuga de 50 ml con dH2O
- Pre-llenar las dos cámaras de la enzima y las líneas con dH 2 O mediante la inyección de ~ 3 ml dH 2 O en las líneas de inyección del fantasma, teniendo cuidado de eliminar cualquier burbuja de formados.
- Coloque el fantasma en el centro del imán con fácil acceso a las líneas de inyección. Asegúrese de que hay algún recipiente para recoger el líquido que va a ventilar en t que la línea de escape.
- Preparar la mezcla de enzimas de alta actividad (mM NADH 17.14, 44.57 U / ml LDH). Mezclar 240 l solución de NADH, solución de LDH 125 ly 335 l de tampón y mantenerse en una jeringa de 3 ml que se puede conectar a la línea de inyección.
NOTA: una vez en combinación con los 500 l de piruvato 40 mM del sistema de DNP, el volumen fantasma final será de 1,2 ml con concentraciones de piruvato 16,7 mM, NADH 10, y 26 U / L LDH en una solución tris tamponada con pH ~ 7.5. - Preparar la mezcla de enzimas baja actividad (17,14 mM NADH 26.79 U / ml LDH) Mezclar 240 l solución de NADH, solución de LDH 75 ly 385 l de tampón y guardar en un separada jeringa de 3 ml que se puede conectar a la línea de inyección.
NOTA: una vez en combinación con los 500 l de piruvato 40 mM del sistema DNP el volumen fantasma final será de 1,2 ml con concentraciones de piruvato mM 16,7 mM, NADH 10, y 15.625 U / L LDH en una solución tris tamponada con pH ~ 7,5 .
- posicionamiento inicial.
- Cargar una nueva búsqueda de posicionamiento flash en modo de operación [1H] modo de volumen TX / RX. Cambiar creados dimensiones a 2: Herramienta de control Espectrómetro -> Editar GS -> Configuración - Dimensiones> 2. Pulse SGP sobre el control del espectrómetro y mover fantasma hasta centrada en el imán. Presione STOP y luego pulse GOP sobre el control del espectrómetro.
- Scan piloto.
- Cargar una nueva búsqueda de posicionamiento TriPiolt en el modo de operación [1H] modo de volumen TX / RX. Posición de la rebanada: Scan Control -> División Herramientas-> mover las rebanadas (mantenga M pulsación de la tecla y arrastre; Seleccionar sector para moverse con el deslizador paquete rebanada).
- Bobina bamboleo 1H: Herramienta Espectrómetro de control -> Acq -> bamboleo. Tune y el partido 1 bobina H detrás del imán y pulse STOP. Mientras mantiene la tecla de mayúsculas pulse el semáforo de la ventana de control de análisis.
- Cargar una imagen espectroscópica ecoplanares nueva radial (radEPSI) escanear en modo de funcionamiento [13C] modo de volumen TX / RX. Posición de la rebanada: Herramienta de la rebanada en el control de exploración y mover las rebanadas (M sostienen clic y arrastre clave; Seleccionar sector para moverse con el deslizador paquete rebanada).
- Wobble 13 C bobina haciendo clic en la herramienta de control Espectrómetro -> Acq -> bamboleo. Ajuste la ganancia del receptor a 1.000-2.000 en el espectrómetro.
- Realizar la comprobación final del sistema. Dependiendo de la secuencia, observar la señal de carbono 13 de la cámara de urea en un protocolo de explorador.
NOTA: Esto asegura que el sistema está configurado correctamente antes de comenzar el proceso de disolución irreversible.
6. Ejecutar Disolución
- Cuando el piruvato ha alcanzado> 90% de polarización (~ 1 h), las soluciones y fantasma están listos, y la exploración está configurado haga clic en el botón de ejecución de disolución en el sy DNPtallo consola.
- Cuando se le solicite mover el palo de la disolución en su posición de trabajo e inyectar medios de disolución. Cierre el sistema DNP y haga clic en el botón terminada en la consola del sistema DNP. Mueva palo de la disolución de nuevo a su posición de reposo cuando se le pida a continuación, haga clic en Finalizar.
- Cuando el sistema DNP ofrece la piruvato hiperpolarizado (~ 2 minutos después de comenzar la calefacción) retirar 500 l de la solución de piruvato en cada una de las jeringas de soluciones de alta y baja concentración de la enzima. Lentamente (~ 10 seg) inyectar cada jeringa en una línea de inyección.
NOTA: El análisis podría haberse iniciado antes de la inyección o en cualquier momento hasta 3 min después de la inyección en función del protocolo de análisis utilizado.
Procesamiento 7. Imagen
NOTA: Este fantasma fue diseñado para su uso con muchas estrategias de imagen. Véase la Figura 2, como un ejemplo de cómo las imágenes rad-EPSI se procesaron utilizando Matlab.
- Cargar los datos en bruto a partir del archivo FID. reshape los datos para que coincida con el número de proyecciones, dio lectura a los puntos, ecos y dar cuenta de los datos almacenados como pares reales e imaginarios. Separar los puntos de eco pares e impares.
- Transformada de Fourier, ya sea los ecos pares o impares a lo largo de las dimensiones de eco. identificar visualmente las bandas de frecuencias para piruvato y lactato. Por simplicidad se utilizó el valor absoluto del espectro.
- Separar cada banda metabolito y la transformada de Fourier largo de la dirección de codificación de frecuencia para producir sinogrammes aislados para cada metabolito. radón transformada inversa de los sinogrammes separadas para producir una imagen de cualquiera de lactato o piruvato.
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Representative Results
imágenes 2D rebanada selectivos fueron adquiridos utilizando una secuencia de instantáneas radEPSI. imágenes de metabolitos fueron reconstruidas usando retroproyección filtrada. Las imágenes de metabolitos estaban bien alineados con las imágenes de protones, como se ve en la Figura 2. En esta señal de lactato hiperpolarizado sistema sólo puede ser generado a partir de la conversión enzimática de piruvato hiperpolarizado. En la Figura 4, la cámara inferior, con mayor concentración de LDH, tiene un lactato más fuerte y más débil señal de piruvato en comparación con la cámara superior. El uso de las señales de metabolitos relativos como una estimación de la concentración de enzima lactato a piruvato es 1,47 veces mayor en la cámara inferior. La relación de concentración de la enzima real entre los compartimentos inferiores y superiores era 1,66 veces que está de acuerdo en bruto con las relaciones de señal (Figura 4).
por supuesto, imágenes en tiempo eran gennominal con una secuencia de IDEAL (Figura 3). se observó de nuevo acuerdo fuerte entre las imágenes de metabolitos y la referencia de protones. Tenga en cuenta que no es un fantasma de urea estuvo presente para este estudio. En la cámara alta de la enzima a la derecha, se observa una muy fuerte señal de lactato inicial. La reacción fue casi completamente catalizada por el tiempo que se entregó en (entrega sec 9, 12 sec pico lactato) de cámara. La reacción progresó más lentamente en la cámara baja concentración de enzima (izquierda). Es también notable que se observa con menor señal de piruvato en la cámara alta de la enzima a medida que más de la señal se convierte en lactato.
Figura 1. Esquema Fantasma: (A) Diagrama que muestra el diseño de la cámara. Cámaras A y B equipados para inyecciones y líneas de escape. La cámara de urea está sellado, ya que no necesita ser inyectared durante la adquisición. (B) Foto del fantasma desmontada que muestra las cámaras, líneas de inyección y tubo de 50 ml. El sistema fantasma ensamblado con las líneas de inyección envueltas alrededor de lo que los conectores de jeringa al final de las líneas están en el bastidor (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes de metabolitos utilizando rad-EPSI. Coronales imágenes generadas a partir de dos bandas espectrales separadas, piruvato (centro) y lactato (a la derecha). La cámara superior tiene señal notablemente más piruvato y lactato menor señal de que la cámara inferior. Una imagen de protones (izquierda) se adquirió después de la formación de imágenes agentes hiperpolarizados. Por favor, clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes de curso temporal de metabolitos utilizando una secuencia ideal. Axial imágenes de esta serie fueron adquiridos en 3-sec intervalos. Piruvato (arriba) y lactato (abajo) se muestran en la imagen en escala de grises de protones más. las señales más débiles piruvato lactato Strong y se observan en la cámara de la derecha que contiene la concentración de enzima más alta. La cámara izquierda, con la concentración de la enzima inferior, presenta una menor lactato y piruvato señal más fuerte. Las cámaras están vacías de señal hiperpolarizado por primera 9 seg porque la exploración se inició antes de la inyección. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. Las imágenes procesadas: Las magnitudes de señal promedio para cada cámara se muestra en las imágenes de metabolitos combinados (izquierda). La diferencia de lactato a piruvato proporciones para las cámaras superior e inferior coincide cualitativamente la diferencia en la actividad de las enzimas utilizadas, que se muestran como gráficos de barras (derecha).
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Discussion
formación de imágenes en tiempo real de los metabolitos hiperpolarizados tiene muchos desafíos únicos para el diseño de secuencias, validación y control de calidad. La capacidad para resolver la heterogeneidad espacio-temporal y espectral ofrece un potencial clínico sustancial, pero se opone a control de calidad y validación de métodos asociados con la RM convencional. las secuencias de imágenes complejas o algoritmos de reconstrucción pueden tener dependencias sutiles que las hacen difíciles de caracterizar o validan fuera del experimento de imágenes. Heterogeneidad biológica y otras preocupaciones prácticas limitan el uso de in vivo y en modelos in vitro para caracterizar o validar secuencias, hardware o algoritmos de procesamiento de datos.
Con múltiples compartimentos espaciales y la evolución química dinámica, es posible para recapitular las características críticas asociadas con sustratos hiperpolarizados de formación de imágenes in vivo, pero de una manera controlada. Las regiones de alta y baja actividad enzimática proporcionan reproducicontraste dinámico ble para la evaluación de los biomarcadores de imagen cualitativos y cuantitativos. Las variaciones espaciales aseguran distorsiones geométricas, desajustes y otras fuentes comunes de error se contabilizan correctamente.
Mientras más controlable que los sistemas vivos las velocidades de reacción catalizada por la LDH son todavía condiciones experimentales muy sensibles y son una fuente importante de incertidumbre. Críticamente, LDH es sensible a la temperatura. Si las mediciones posteriores se van a comparar el gran cuidado debe ser tomado que el ambiente y las temperaturas del líquido se mantienen constantes en todas las mediciones. Además las altas concentraciones de piruvato asociado con estudios hiperpolarizados fuerza el uso de altas concentraciones de la coenzima NADH y la LDH enzima. Estas concentraciones altas generalmente no permiten que los supuestos de poca o ninguna inhibición de la enzima o un sustrato particular, estar en exceso de concentración. Si se deseaba probable caracterización riguroso de la cinética químicaSe necesitarían concentraciones de diferencia de reactivos para recuperar estos supuestos. Sin embargo, esta formulación resultará en la producción de lactato hiperpolarizado a tasas variables en cada compartimiento que debe ser suficiente para la mayoría de validación de imágenes.
Si se observa una primera lugar para comprobar que sería la actividad de la enzima, que puede necesitar ser reemplazado poca o ninguna señal de lactato. Además variación en la entrega en los compartimentos fantasmas provoca incertidumbre en la cantidad de señal hiperpolarizado. Para reducir estas fuentes de variabilidad es fundamental que la cantidad de piruvato hiperpolarizado añadido a cada cámara se mide con precisión y se añade sin problemas. La caída de la señal inherente de piruvato hiperpolarizado complica esta tarea mediante la colocación de límites estrictos de tiempo en la inyección. El trabajo futuro se centrará en la implementación de un mecanismo de inyección automatizado que permitirá que el proceso de introducción piruvato hiperpolarizado a la mezcla de enzimasy la posterior inyección en el fantasma que se controla la máquina. Este sistema se eliminará el error humano en la medición de la cantidad de piruvato añadido a cada cámara, así como aumentar la velocidad de entrega en el escáner. Cabe destacar que el piruvato hiperpolarizado se retiró en las jeringas que contienen la mezcla de enzimas antes de que se inyecta todo el volumen dentro de las cámaras. Esto se hizo para permitir que el proceso de inyección para ayudar en la mezcla de la piruvato con la mezcla de enzimas. Una limitación de este método es que la reacción de piruvato a lactato se inicia antes de la mezcla está en el escáner y por lo tanto la primera parte de la reacción no se mide. refinamiento futuro del diseño de la cámara tendrá como objetivo permitir que las cámaras a ser pre lleno de la mezcla de enzimas y sólo el piruvato hiperpolarizado inyectado sin dejar de garantizar una mezcla suficiente de los contenidos de la cámara como llega piruvato.
En comparación con los fantasmas estáticos este sistema tiene algunas limitaciones. el dependencia en alguna reacción química dinámica limita a estos fantasmas un solo uso. Después de la inyección tendrán que ser limpiados y tendrán que ser utilizado, o descongelado a partir de alícuotas soluciones de reactivos frescos las líneas y las cámaras. Mientras que el fantasma de la enzima sola captura algunos de comportamiento químico dinámico que no recapitula fielmente un sistema biológico real. En los sistemas vivos piruvato está implicada en múltiples rutas bioquímicas complejas y el simple conversión de piruvato a lactato en presencia de co-enzima con una única isoforma enzimática es una simplificación sustancial. Además, si vascular o alguna otra forma de entrega, así como cualquier tipo de captación celular son críticos para la medición de este sistema es probable que sea un modelo insuficiente. El fantasma enzima sola es un compromiso que se centra en una reacción química, que no es tan repetible o práctico como un fantasma estática, pero todavía es más repetible que los sistemas vivos. La reproducibilidad de este sistema se caracteriza by la variación en la medición repetida de 15 a 20 por ciento en comparación con los estudios con animales que tienen entre 25 a 40 por ciento grupo intra Variabilidad 10. Además no modela cada aspecto de células o tejido vivos, pero mantiene el comportamiento crítico dinámico que se pierde cuando se utiliza un fantasma estática.
Este sistema fantasma fue diseñado para operar con una amplia gama de técnicas de imagen. Con una plataforma flexible de las exploraciones de control de calidad y adquisiciones hiperpolarizados efectuadas anteriormente son intercambiables con la secuencia o protocolos utilizados por otra institución. Para ilustrar esto se realizó un estudio similar en un escáner GE 3T usando una secuencia de encargo ideal, con resultados similares.
Hiperpolarizado MRI de [1- 13 C] piruvato muestra una gran promesa debido a su capacidad para investigar el metabolismo de cáncer in vivo en tiempo real. Curiosamente, la sensibilidad de esta técnica plantea un gran desafío para la formulación o la validación de measuremtécnicas ENT. El uso de un solo fantasma enzima que es posible recrear la dinámica espacial y temporal que son críticos para la medición de agentes hiperpolarizados por resonancia magnética de una manera práctica, controlable y repetible necesaria para ser útil para el desarrollo y verificación.
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Disclosures
La publicación de este video-artículo es apoyado por la corporación de Bruker.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el subsidio CPRIT (RP140021-P5) y un premio Julia Jones Investigación del Cáncer Matthews Académico CPRIT formación en investigación (RP140106, CMW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpect 7T | Bruker | BioSpec 70/30 USR | 7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner |
| HyperSense | Oxford Instruments | Hypersense DNP Polarizer | Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents |
| 1-13C-Pyrvic Acid | Sigma Aldrich | 677175 | Carbon 13 labled neat pyruvic acid |
| Trityl Radical | GE Healthcare | OX063 | Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| LDH | Worthingthon | LS002755 | Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle |
| NADH | Sigma Aldrich | N4505 | β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt |
| Trizma | Sigma Aldrich | T7943 | Trizma Pre-set crystals |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 |
References
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