過分極磁気共鳴剤の研究のための多区画動的単一酵素ファントムの使用

Abstract

磁気共鳴による過分極基質のイメージングは​​、リアルタイムでの重要な生化学的プロセスの評価のための偉大な臨床約束を示しています。過分極状態によって課される基本的な制約のために、エキゾチックなイメージングおよび再建技術が一般的に使用されています。ダイナミック、マルチスペクトルイメージング法の特性評価のための実用的なシステムは、批判的に必要とされています。このようなシステムは、再現性正常および病的な組織の関連する化学ダイナミクスを再現する必要があります。これまでで最も広く利用されている基板は、がん代謝の評価のための[1- ¹³ C]ピルビン酸を過分極されています。私たちは、乳酸へのピルビン酸への変換を媒介する酵素ベースファントムシステムを説明します。反応は、反応速度を制​​御する試薬の濃度を変え含ま各々が、ファントム内の複数の室に過分極剤の注入によって開始されます。複数の区画は、IMAを確保するために必要です銀杏の配列は、忠実に組織の空間的および代謝不均一性をキャプチャします。このシステムは、 生体内では不可能である化学従来のファントムからは入手できませんダイナミクスだけでなく、制御と再現性を提供することにより、高度なイメージング戦略の開発と検証を支援します。

Introduction

¹³ C標識化合物の過分極磁気共鳴画像（MRI）の臨床的影響は、リアルタイム磁気共鳴分光法及び分光イメージング^1-5を介して化学変換率を測定する能力に決定的に依存します。配列開発および検証中に、動的な化学変換は、一般に、 インビボまたは制限された制御および再現性を提供するin vitroモデル^6-9 にすることによって達成されます。堅牢なテストと品質保証のために、この測定に流行して化学変換を維持し、より制御システムが好ましいであろう。我々は、動的単一の酵素のファントムを用いて、再現可能な方法で、この変換を達成するための方法を概説します。

過分極¹³ C剤とほとんどの研究は、機能生物学的環境で、超偏極基板を画像化に焦点を当てます。目標は、生物学を研究することである場合、これは当然の選択でありますアル・プロセスまたは臨床ケアへの影響の可能性を決定します。いくつかの測定システムまたはデータ処理アルゴリズムの特性が所望される場合には、生物学的モデルは、固有の空間的および時間的可変¹⁰のような多数の欠点を有します。しかしながら、従来の静的なファントムは、過分極基質のMRIの主要な臨床的関心を駆動化学変換を欠き、かつ変換率または他の動的パラメータ¹¹の検出を特徴付けるために使用することができません。単一酵素系を使用して、我々は、動的画像化戦略の厳密な検査を可能にする、制御可能かつ再現可能な化学変換を提供することができます。

このシステムは、超偏極基板用のイメージング戦略を開発し、代替的なアプローチとの比較のための性能を特徴づけるために希望している研究者を対象としています。静的測定は、所望の終点である場合には、静的な¹³ C-標識さ代謝物ファントムのwi^11で十分でしょう。もう一方の端に、より複雑な生物学的特徴付けは、実際の生物学的モデルは^{12月14日を}必要とされる方法（配達、細胞密度、 など ）にとって重要である場合。このシステムは、見かけ上の化学的変換率の定量的尺度を提供することを目的とイメージング戦略の評価のために理想的です。

Protocol

注：（ファントムデザイン）2 3ミリリットル室はウルテムから機械加工、射出と排気用のPEEKチューブ（1.5875ミリメートル外径および0.762ミリメートルのID）を装着しました。チャンバは水（ 図1）を充填した50mLの遠心分離管に入れました。気泡によって作成された信号の空隙を回避するために、チャンバおよびラインは、脱イオン水（のdH ₂ O）を充填した事前ました。

1.溶液の調製

1. 1 L緩衝液（81.3 mMトリスpHは7.6、203.3のNaCl）を準備します。うち11.38グラムのTrizmaプリセット結晶pHは7.6と11.88グラムのNaClを計り、 _の dH ₂ Oの1 Lに溶解します
2. 50 mMのNADH溶液を調製します。 β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、還元ジカリウム塩の17.8ミリグラムを秤量し、ステップ1で調製した緩衝液の280μlの溶解。
3. 250 U / mlの酵素溶液を調製します。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の78.75活性単位を秤量およびSから315μlの緩衝液中に溶解TEP 1。
4. ピルビン酸ミックスを調製します。 21.4 mgのOx063トリチルラジカルを秤量し、1.26グラム（〜1ミリリットル）[1- ¹³ C]ピルビン酸に溶解します。
5. 溶解媒体を準備します（40 mMトリスpHは7.6、40mMのNaOHを、0.27 mMのEDTAおよび50mMのNaCl）。トリズマプリセット結晶性pH 7.6の5.96グラム、NaOHを1.6グラム、0.1グラムエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩の水和物（EDTA）および2.9グラムのNaClを秤量し、1 LののdH ₂ Oに溶解します
6. 1時10ガドテリドール溶液（50 mm）を準備します。 dH ₂ Oの9μlのガドテリドール1μlのミックス8 M ^[13 C]尿素の調製。 1.465 5 ^[13 C]尿素を秤量し、3ミリリットルのdH ₂ Oに溶解します

過分極ピルビン酸の調製

1. 動的核分極（DNP）システム、ピペットガドテリドール液の0.3μlのピルビン酸溶液の13ミリグラム（〜10μl）をするためのサンプルカップで。
2. 簡単に言うとピペットチップでサンプルカップにこの混合物を攪拌。</李>
3. DNPシステムにサンプルを挿入します。
   1. DNPシステムへの扉を確認してください閉じています。 DNPシステム・コンソールに挿入サンプルボタンをクリックすることにより、サンプルの挿入プロセスを開始します。サンプル・ウィザードでは次の通常のサンプルを選択し、を押します。
   2. サンプルカップを維持する垂直優しくサンプルカップの上に挿入ロッドを配置します。プロンプトが表示されたら、DNPシステムを開き、挿入ロッドを使用して、温度可変インサート（VTI）にカップを挿入します。
   3. 温度可変インデックスにサンプルを解放するために、サンプル挿入ロッドの終わりにプランジャーに引き出します。システムからのサンプル挿入ロッドを取り外し、DNPシステム・コンソールに次のボタンをクリックします。
4. 偏光を開始します。
   1. DNPシステムのコンソール上でスタート分極ボタンをクリックします。偏光監視ソフトウェアを起動するRINMRソフトウェアで型.HYPERSENSENMR。 1に設定を構築し、Enterキーを押します設定します。次に、固体のビルド]をクリックしますuのP。
   2. 保存ファイルの場所と名前を設定します。 DNPシステムのコンソール上のタブのドロップダウンで13-C用のプロファイルを選択し、次へ]をクリックします。 300秒に、ビルドアップ時に設定サンプル時間をサンプリングし、[完了]をクリックするチェックボックスをオンにします。
5. 3.85グラムを測定する（〜4ミリリットル）溶解媒体のいずれかの5ミリリットルの注射器との体積やスケールを使用して重量。

酵素ファントムの調製

1. 〜3ミリリットル^[13 C]尿素水溶液でマイクロ遠心チューブを記入し、50ミリリットルの遠心分離管に入れてください。 dH ₂ Oで50mlの遠心分離管を埋めます
2. 形成された泡を洗い流すように注意しながら、ファントムの注入ラインへ〜3ミリリットルのdH ₂ Oを注入することによって、2つの酵素室とのdH ₂ Oを持つ行を事前に記入してください。
3. 注入ラインに簡単にアクセス磁石の中心にファントムを置きます。トンに出ベントます液体をキャッチするためにいくつかのコンテナがあることを確認してください排気ラインを彼。
4. 高活性の酵素混合物（17.14 mMのNADH、44.57 U / mLのLDH）を準備します。一緒に240μlのNADH溶液を、125μlのLDH溶液および335μlの緩衝液を混合し、注入ラインに結合させることができる3ミリリットル注射器に保ちます。
   注：DNPシステムからの40mMピルビン酸500μlのと合わせたら、最終的なファントム量は16.7 mMのピルビン酸、10 mMのNADHの​​濃度が1.2ミリリットルであること、およびpHを有するトリス緩衝溶液中で26 U / LのLDHます〜 7.5。
5. 低活性酵素混合物（17.14 mMのNADH 26.79 U / mLのLDH）を一緒に240μlのNADH溶液を、75μlのLDH溶液および385μlの緩衝液を混合し、注入ラインに取り付けることができる別個の3ミリリットル注射器に保管を準備します。
   注：DNPシステムからの40mMピルビン酸500μlのと合わせたら、最終的なファントムのボリュームは16.7 mMのピルビン酸、10 mMのNADHの​​濃度が1.2ミリリットルであること、およびpH約7.5でトリス緩衝溶液中で15.625 U / LのLDHます。

jove_title "> 4。任意の品質保証（QA）とポジショニングスキャンを実行します。

1. 最初のポジショニング。
   1. 動作モード^[1 H] TX / RXボリュームモードで新規FLASH位置決めスキャンをロードします。 2に設定さ寸法を変更します。分光計コントロールツールを - >編集GS - >セットアップ寸法 - > 2.分光器制御に関するGSPと磁石の中央までのファントムを移動します。分光器制御上を押してSTOPを押しGOP。
2. パイロットスキャン。
   1. 動作モード^[1 H] TX / RXボリュームモードで新規TriPiolt位置決めスキャンをロードします。位置スライス：スキャン制御 - >スライス工具類 - >は（;スライスパッケージスライダーで移動するには、スライスを選択し、Mキーをクリックしてドラッグを保持）スライスを移動します。
   2. ウォブル¹ Hコイル：分光計コントロールツール- > ACQ - >ぐらつき。磁石と押してSTOP背後にある¹ Hコイルをチューニングし、一致します。シフトキーを押しにスキャンコントロールウィンドウ上のトラフィックの光を保持したまま。

1. 動作モードの^[13 C] TX / RXボリュームモードをスキャンし、新しいラジアルエコープラナー分光イメージング（radEPSI）をロードします。位置スライス：スライスツールスキャン制御上のスライスを移動（Mキークリックとドラッグを保持し、スライスパッケージスライダーで移動するには、スライスを選択します）。
2. 分光計コントロールツールをクリックしてウォブル¹³ Cコイル- > ACQ - >ぐらつき。スペクトロメーター上で1,000〜2,000に受信ゲインを設定します。
3. 最終的なシステムチェックを実行します。配列に依存して、スカウトプロトコルにおける尿素室から炭素13の信号を観察します。
   注：これは、システムが不可逆的な溶解プロセスを開始する前に適切に設定されることを保証します。

6.ファイル名を指定して実行解散

1. ピルビン酸は、> 90％の偏光（〜1時間）を達成した場合には、ソリューションおよびファントムは準備ができている、とスキャンがDNP SY上で実行溶解ボタンをクリックして構成されていますコンソールを食い止めます。
2. その動作位置への溶解スティックを移動し、溶解媒体を注入するプロンプトが表示されたら。 DNPシステムを閉じ、DNPシステム・コンソールに完成したボタンをクリックします。 [完了]をクリックし、プロンプトが表示されたら休止位置に戻す溶解スティックを移動します。
3. （加熱開始後〜2分）DNPシステムは、過分極ピルビン酸を配信する場合、それぞれ高いおよび低い酵素濃度溶液をシリンジにピルビン酸溶液500μlを撤回。ゆっくりと（〜10秒）注​​入ラインにそれぞれ注射器を注入します。
   注：スキャンは、注射前に、またはいつでも使用するスキャンプロトコルに応じて3分後に注射まで開始されている可能性があります。

7.画像処理

注：このファントムは、多くのイメージング戦略で使用するために設計されました。 RAD-EPSIの画像はMATLABを使用して処理した方法の例として、 図2を参照してください。

1. FIDファイルから生データをロードします。 Resha実部と虚ペアとして格納されたデータのためのポイント、エコーやアカウントを読み出し、突起の数と一致するデータをPE。偶数と奇数エコーポイントを分離。
2. フーリエ変換は、エコー次元に沿って偶数か奇数エコーのいずれかを変換します。視覚ピルビン酸および乳酸のための周波数帯域を特定します。簡単にするために、スペクトルの絶対値を用いました。
3. 各代謝産物のバンドを分離し、フーリエ変換は、各代謝物のために孤立したサイノグラムを生成する周波数エンコード方向に沿って変換します。逆ラドンは、乳酸やピルビン酸のいずれかの画像を生成するために別個のサイノグラムを変換します。

Representative Results

スライス選択2D画像は、スナップショットradEPSIシーケンスを用いて取得しました。代謝物の画像はフィルタ逆投影を使用して再構築しました。代謝産物の画像が良く、図2に見られるように、プロトン画像と整列させた。このシステムでは過分極乳酸塩の信号のみが過分極ピルビン酸塩の酵素的変換から生成することができます。 図4は 、下部チャンバにおいて、より高いLDH濃度で上部チャンバーに比べて強い乳酸弱いピルビン酸塩信号を有しています。酵素濃度の推定値として相対的代謝産物の信号を使用するピルベート比乳酸は、下部チャンバ内の1.47倍です。下部と上部区画との間の実際の酵素濃度比は、信号比（ 図4）を有する粗い一致する1.66倍でした。

時間経過の画像は、遺伝子ましたIDEALシーケンス（ 図3）を使用して評価しました。代謝物の画像およびプロトン参照との間の強力な合意が再び観察されました。何尿素ファントムは、この研究のために存在しないことに注意してください。右の高い酵素チャンバ内で、非常に強い初期乳酸シグナルが観察されます。この反応は、ほぼ完全にそれがチャンバー（9秒の配信、12秒のピーク乳酸）に配信された時間によって触媒されました。反応は、低酵素濃度室（左）に、よりゆっくりと進行しました。乳酸塩に変換した少ないピルビン酸信号は、信号のよりような高い酵素チャンバ内に観察されたことにも注目すべきです。

図1のファントム図は、（A）図は、チャンバの設計を示 ​​します。チェンバースAとBは、注射や排気ラインに適合しました。尿素チャンバは、注入する必要がないように密閉されています取得中に編。 （B）チャンバ、注入ライン50 mlチューブを示す分解ファントムの写真。 （C）ラインの最後に注射器コネクタがフレーム内にあるように巻き付け注入ラインで組み立てられたファントムシステムが。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

RAD-EPSIを使用して、図2代謝産物の画像。冠状二つの別々のスペクトル帯域から生成された画像、ピルビン酸（中央）、乳酸（右）。上部チャンバーは著しくよりピルビン酸信号とボトム室未満の乳酸の信号を持っています。プロトン画像は（左）過分極薬剤を撮影した後に取得された。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3.代謝産物の時間経過の画像をIDEALシーケンスを使用して。アキシャル このシリーズのイメージは、3秒間隔で取得しました。ピルビン酸（上）と乳酸（下）は、グレースケール、プロトン画像の上に表示されます。強い乳酸弱いピルビン酸塩信号は、より高い酵素濃度を含有する右室で観察されます。低い酵素濃度と左室は、より少ない乳酸と強いピルビン酸シグナルを示しました。スキャンが注射前に開始されたため、チャンバーは、最初の9秒間過分極信号の空隙である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4「SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 53607 / 53607fig4.jpg" />
図4.処理された画像：複合代謝物の画像（左）上に示された各チャンバーのための平均信号の大きさ。トップとボトム室のためのピルビン酸比の乳酸の差は質的に棒グラフ（右）として示す使用酵素活性の差と一致しています。

Discussion

過分極代謝産物のリアルタイムイメージングシーケンスの設計、検証、および品質管理のための多くの固有の課題を有しています。時空間およびスペクトル不均一性を解決する能力はかなりの臨床的可能性を提供していますが、従来のMRIに関連したQAおよび検証方法を排除します。複雑な撮像シーケンスまたは再構成アルゴリズムは、撮像実験の外側を特徴付けるか検証するためにそれらが困難に微妙な依存関係を持つことができます。生物学的な不均一性および他の実用的な問題は、特徴付ける、または配列、ハードウェアまたはデータ処理アルゴリズムを検証するためのin vivoおよびin vitroモデルでの使用を制限します。

複数の空間の区画及び動的化学進化とは、 生体内ではなく、制御された方法で撮像過分極基質と関連した重要な機能を再現することが可能です。ハイとローの酵素活性の領域はreproduciを提供します定性的および定量的イメージングバイオマーカーの評価のためのBLEダイナミックコントラスト。空間的な変動は、幾何学的な歪み、ミスアライメント、およびエラーの他の一般的なソースが適切に計上されていることを確認します。

生きているシステムよりもより制御しながら、LDHによって触媒反応速度は依然として非常に敏感な実験条件であり、不確実性の主要な源です。批判的に、LDHは、温度に敏感です。その後の測定は、細心の注意を比較する場合は部屋と液体の温度は、すべての測定にわたって一定のままであることに注意しなければなりません。さらに、過分極の研究に関連したピルビン酸の高濃度は、補酵素NADHおよび酵素LDHの高濃度の使用を強制します。これらの高濃度は、一般的に無酵素阻害または過剰濃度にある特定の基板にはほとんどの仮定することはできません。化学反応速度論の厳密な特徴付けは、おそらく希望された場合試薬の差分濃度はこれらの仮定を回復するために必要とされるであろう。しかし、この製剤は、ほとんどのイメージングの検証のために十分なものでなければならない各区画内の可変レートでの過分極乳酸の産生をもたらすであろう。

ほとんど、あるいはまったく乳酸信号が観測されているかどうかを確認するための最初の場所を交換する必要がありますする、酵素の活性であろう。さらに、ファントムの区画への送達の変動は、過分極信号の量の不確実性の原因となります。変動のこれらの源を減少させるためには、各チャンバーに添加し、過分極ピルビン酸塩の量を正確に測定し、それを円滑に添加することが重要です。過分極ピルビン酸の固有の信号減衰は注入に厳しい時間制限を置くことによって、このタスクを複雑にしています。今後の課題は、酵素混合物に過分極ピルビン酸導入のプロセスを可能にする自動注入機構の実装に焦点を当てますファントムへの次の噴射は、機械を制御することができます。このシステムは、各チャンバーに加え、ピルビン酸の量を測定することでヒューマンエラーを取り除くだけでなく、スキャナへの配信の速度が向上します。全体積がチャンバに注入される前に、特に過分極ピルビン酸は、酵素混合物を含有する注射器に取り出しました。これは、注入プロセスは、酵素混合物とピルビン酸の混合を補助できるように行われました。この方法の限界は、混合物はスキャナであり、したがって、反応の初めの部分が測定されない前に、乳酸のピルビン酸の反応が開始されることです。チャンバ設計の今後の改良は、チャンバは事前酵素混合物とピルビン酸が到着したとして、まだチャンバ内容の十分な混合を確保しながら注入だけ過分極ピルビン酸を充填することができるようにすることを目指します。

静的ファントムと比較して、このシステムは、いくつかの制限を有します。 Dいくつかの動的な化学反応にependenceは、単一の使用にこれらのファントムを制限します。注入後の線とチャンバーを洗浄する必要がありますし、新鮮な試薬溶液を使用し、または一定分量から解凍する必要があります。単一の酵素ファントムは、動的化学的挙動の一部を取り込みながら、それが忠実に実際の生物学的システムを再現しません。生体系でピルビン酸は、単一の酵素アイソフォームで補酵素の存在下で乳酸に複数の複雑な生化学的経路およびピルビン酸の単純な変換に関与している実質的な単純化です。血管や配達のいくつかの他の形だけでなく、細胞内への取り込みのいずれかのタイプを測定するために重要である場合に加えて、このシステムは、おそらく不十分なモデルになります。単一の酵素ファントムは、いくつかの化学反応に焦点を当てて妥協である、それは静的なファントムのように、反復または実用的ではないが、生体系ということが更に反復可能です。このシステムの再現性は、Bを特徴としています25〜40％のイントラグループは^10を可変との間で持っている動物の研究と比較して15％から20％の繰り返し測定におけるyの変動。さらに、それは生きた細胞や組織のあらゆる側面をモデル化するのは静的なファントムを用いたときに失われた重要な動的挙動を維持しません。

この仮想システムは、イメージング技術の範囲内で動作するように設計しました。このような柔軟なプラットフォームでは、上記行わQAスキャンおよび過分極買収は、他の施設で使用されるシーケンスまたはプロトコルと互換性があります。これを説明するために、我々は、同様の結果でカスタムIDEALシーケンスを使用してGE 3Tスキャナで同様の研究を行いました。

[1- ¹³ C]ピルビン酸の過分極MRIが原因で、リアルタイムでの生体内癌代謝を調査する能力に大きな期待を示しています。 measuremを開発または検証時に興味深いことに、この技術の感度は大きな課題となって耳鼻咽喉科技術。単一酵素ファントムを使用することは、開発と検証のために有用であるために必要な、実用的に制御可能で反復可能な方法でMRIによる過分極物質の測定に不可欠な空間的、時間的ダイナミクスを再現することが可能です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamic Nuclear Polarizer for MRI agents
1-13C-Pyrvic Acid	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 labled neat pyruvic acid
Trityl Radical	GE Healthcare	OX063	Free radical used in Dynamic Nuclear Polarization
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethylenediaminetetraacetic acid
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactate Dehydrogenase from rabbit muscle
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced dipotassium salt
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma Pre-set crystals
NaCl	Sigma Aldrich	S7653