Abstract
Un metodo di coltura tridimensionale è descritta in cui le cellule adenoma ipofisario primarie sono coltivate in perline alginato. Alginato è un polimero derivato da alghe brune mare. Brevemente, il tessuto tumorale è tagliato in piccoli pezzi e sottoposto ad una digestione enzimatica con collagenasi e tripsina. Successivamente, una sospensione cellulare viene ottenuta. La sospensione delle cellule tumorali viene miscelato con alginato di sodio 1,2% e rilasciato in una soluzione 2 CaCl, e la sospensione alginato / cellulare è gelificata a contatto con il CaCl 2 per formare perle sferiche. Le cellule incorporati nelle perle alginato sono forniti con nutrienti forniti dai terreni di coltura arricchito con 20% FBS. cultura tridimensionale in perline alginato mantiene la vitalità delle cellule adenoma per lunghi periodi di tempo, fino a quattro mesi. Inoltre, le cellule possono essere liberati dal alginato lavando le perline con citrato di sodio e seminate su vetrini per ulteriori analisi immunocitochimica. L'uso di un celModello L cultura consente il fissaggio e la visualizzazione del citoscheletro di actina con il minimo disorganizzazione. In sintesi, perline alginato forniscono un sistema di coltura affidabile per il mantenimento delle cellule adenoma pituitario.
Introduction
Scaffold tridimensionali sono stati ampiamente utilizzati in coltura cellulare perché forniscono un sostegno strutturale tridimensionale per colture cellulari e la manutenzione di comunicazione 1 cellula-cellula. materiali polimerici Naturalmente derivati sono stati utilizzati per fare impalcature tridimensionali contenenti collagene di tipo I, chitosano e alginato. Alginato è un polimero naturale derivato dalle alghe Macrocystispyrifera mare marrone (Kelp). Questo polimero è composto di unità ripetute di acido β-D-mannuronico (M) e α-L-guluronico acido (G) 2 e forma gel stabili in presenza di alcuni cationi bivalenti, come calcio e bario. (CaCl 2) soluzioni di cloruro di calcio vengono comunemente usati come reagente di reticolazione per formare perline alginato. Le soluzioni di alginato è sceso in CaCl 2 formare immediatamente gel sferici tridimensionali. Quando la soluzione di alginato viene miscelato con cellule, le cellule sono incapsulati in alginato bEADS 3.
Alginato ha proprietà che hanno permesso di essere utilizzato come matrice per l'incapsulamento di una varietà di cellule, comprese condrociti 4, mioblasti scheletrici 5 e cellule staminali neuronali 6. È un materiale inerte e permette la diffusione di nutrienti, ossigeno e prodotti metabolici che mantengono la sopravvivenza cellulare e la funzione; Inoltre, a differenza di altri sistemi di coltura a base di gel, cellule coltivate all'interno perline alginato possono essere liberati dal scaffold usando chelanti del calcio, come citrato di sodio, e le cellule possono essere raccolte per ulteriori accertamenti 7.
adenomi ipofisari sono in genere tumori benigni con tassi di proliferazione bassi. Linee cellulari adenoma pituitario di ratto sono state correttamente coltivate in un sistema a due dimensioni 8. Tuttavia, questa cultura di tumori a cellule dell'ipofisi umane secrezione non è uno sviluppo efficiente; Le cellule tumorali ipofisarie disperse crescono poconella cultura, le cellule mostrano attaccamento limitata e la diffusione, e le cellule tipicamente formano aggregati galleggianti nel piatto cultura 9,10.
Diversi tentativi sono stati fatti per ottenere una sospensione di cellule tumorali dell'ipofisi, compreso un approccio enzimatica e dispersione meccanica 11, un approccio dispersione esclusivamente meccanica 12 e la coltura di espianti tumorali 10. Con questi approcci, diversi autori hanno ottenuto culture aderenti vitali per diversi periodi di tempo. Le capacità delle cellule tumorali secretorie di sopravvivere in questi sistemi bidimensionali dipendono dal tipo di tumore e loro tassi di proliferazione 9. Tuttavia, nelle culture a lungo termine, le cellule con fenotipo di fibroblasti predominano 11,13. Questo documento descrive un metodo per ottenere una coltura primaria di cellule d'adenoma pituitario incapsulate in perline di alginato che li libera lontano dalla scaffold alginato che consente analisi dettagliateaspetti della loro biologia cellulare, ad esempio, le loro disposizioni del citoscheletro.
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Protocol
Questo studio è stato approvato per l'uso di materiale umano da parte dei comitati etici locali dell'istituto di cura e il Centro ricerche e studi di avanzamento del Politecnico Nazionale.
1. Acquisizione tumore del campione
- Ottenere la biopsia del tessuto adenoma pituitario da un paziente attraverso una procedura chirurgica trans-sfenoidale 14.
- Raccogliere il campione adenoma pituitario e metterlo in una bottiglia di vetro sterile contenente 50 ml di fresco 199 terreno di coltura (M199) arricchito con siero 10% fetale bovino (FBS), 0,6 mg / bicarbonato di sodio ml, 2,4 mg / ml di HEPES e l'1% antibiotici (penicillina / streptomicina) a pH 7.4. Mantenere il campione in una bottiglia di vetro su ghiaccio.
Nota: Il tessuto tumorale può essere elaborato diverse ore dopo l'intervento chirurgico. - Trasportare il campione del tumore al laboratorio in bottiglia di vetro su ghiaccio.
2. Preparazione dei enzimatici Tissue dissociazione Solutions,Soluzione inibitore della tripsina e le soluzioni di alginato
Nota: Prima della procedura di coltura cellulare Preparare le seguenti soluzioni. Filtrare tutte le soluzioni usando un filtro di 0,22 micron a membrana, prima dell'uso.
- Preparare collagenasi soluzione all'1% sciogliendo 5 mg di collagenasi (tipo I) in 5 ml di connessione M199-siero.
- Preparare tripsina soluzione 0,01% sciogliendo 0,01 g di tripsina in 10 ml di PBS-EDTA 0,3%.
- Preparare 0,1% soluzione di inibitore della tripsina sciogliendo 2 mg di inibitore di soia tripsina in 20 ml di libera M199-siero.
- Preparare la soluzione DNAsi sciogliendo 20 ml di DNAsi I 134 U / ml in 4 ml di soluzione di inibitore della tripsina.
- Preparare la soluzione EGTA (1.2 M) sciogliendo 22,8 mg di EGTA in 40 ml di 155 mM NaCl. Regolare il pH a 7,4. Continuare ad un volume finale di 50 ml.
- Preparare la soluzione HEPES (20 mM) sciogliendo 238 mg HEPES in 50 ml di 155 mM NaCl.
- Preparare la soluzione di alginato 1,2% sciogliendo 1.2g di sodio alginato in 100 ml di soluzione di HEPES. Autoclave la soluzione di alginato.
- Preparare la soluzione di calcio (102 mm), sciogliendo 750 mg di CaCl 2 in 50 ml di soluzione HEPES, aggiustare il pH a 7,4
3. cellulare primaria, Cultura e alginato incapsulamento
- All'interno di una cappa a flusso laminare, posizionare il tessuto tumorale in una capsula di Petri 35 millimetri contenente circa 20 ml di PBS Ca 2+ e Mg 2+ libero, pH 7,4 (PBS *).
- Prendere il tessuto con una pinzetta chirurgica e metterlo in un altro piatto di Petri contenente PBS fresco *, lavare delicatamente il tessuto. Ripetere questa operazione fino a quando i globuli rossi e detriti sono stati rimossi.
- Utilizzando una pinzetta chirurgica, tenere il tessuto adenoma pituitario, e con una piccola forbice chirurgica, tagliato in piccoli pezzi. Con una pipetta Pasteur con bordi arrotondati, trasferire i frammenti di tessuto e il PBS * in una provetta da 15 ml, Centrifugare a 68 xg per 10 min a RT.
Nota: per arrotondare i bordi di una Pasteurpipetta, scarsamente fiamma la punta della pipetta in un becco Bunsen. - Rimuovere il PBS * usando una pipetta Pasteur e aggiungere 3-5 ml della soluzione di collagenasi (circa 5 ml il 65 mm 3 di tessuto), mescolare due o tre volte per inversione. Incubare il tessuto in collagenasi per 30 min a 37 ° C in rotazione costante.
- Centrifugare la provetta a 68 xg per 10 min a RT e rimuovere la collagenasi con una pipetta Pasteur.
- Aggiungere 5 ml di DNAsi e mescolare due o tre volte invertendo, quindi centrifugare la provetta a 68 xg per 10 min a RT.
Nota: Se il tessuto non è completamente dissociato, eseguire un secondo digestione enzimatica con tripsina per 3 minuti a 37 ° C. Arrestare la digestione con l'aggiunta di 2 volumi di soluzione inibitore della tripsina. - Aspirare il surnatante con una pipetta Pasteur e scartare. Risospendere il pellet in 1 volume di soluzione EGTA e mescolare con 2 volumi di soluzione di alginato.
- Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e alginatopipettando con una pipetta Pasteur. Prendere una siringa sterile con un ago G 21, togliere il pistone; utilizzare una pipetta per caricare la siringa con la soluzione di alginato e cellule.
- Inserire delicatamente lo stantuffo nella siringa e accuratamente erogare goccia a goccia la soluzione di alginato di cellule in un bicchiere di vetro contenente circa 30 ml di soluzione ricca di calcio.
- Inserire l'ago della siringa circa 5 cm fino alla soluzione di CaCl 2. I gel sospensione alginato cellule a contatto con il CaCl 2 per formare perle sferiche. Conservare le perline alginato di calcio nella soluzione per 5 min.
Nota: Mescolare il bicchiere di vetro in cui sono sceso le perle. Spostare lentamente con la mano in movimenti circolari, per evitare che aderiscano l'uno all'altro. - Rimuovere con attenzione la soluzione di calcio con una pipetta Pasteur, e lavare le perle due volte con 3-5 ml di M199 arricchito con il 20% di FBS.
- Trasferire le perline alginato in una cultura normale tessuto T25pallone di utilizzando una spatola sterile, aggiungere 4-5 ml di M199 arricchito con 20% FBS e incubati a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2. Modificare il terreno di coltura ogni tre giorni.
4. Liberate cellule dal alginato
Nota: Prima di liberare le cellule dalle perline alginato, cappotto 13 coprioggetto mm di diametro con poli-D-lisina.
ATTENZIONE: ACIDO SOLFORICO è un acido altamente corrosivo, and Apts PUÒ CAUSARE OCCHI E DELLA CUTE. Utilizzare guanti in lattice per maneggiare i reagenti.
- In una cappa aspirante, con un punto pinzetta immergere i coprioggetti in un piatto di vetro Petri contenente il 20% acquosa di acido solforico per 1 ora a RT.
- Decantare l'acido solforico, e lavare i coprioggetti cinque volte con acqua distillata per 5 minuti ciascuna. Utilizzando un luogo punto pinzetta i coprioggetti puliti in una capsula di Petri contenente 0,1 M NaOH per 5 minuti a temperatura ambiente 15.
- Decantare il NaOH e lavare una volta con distillareacqua ha portato, aspirare l'acqua e asciugare i coprioggetti.
- Utilizzare una micropipetta per rivestire i coprioggetti con APTS (amminopropil-trietossisilano) per 4 minuti (usare 500 microlitri per 6 lamelle) inondare la piastra di Petri con acqua distillata. aspirare rapidamente l'acqua e continuare a lavare con acqua distillata, spostando i coprioggetti con una pinzetta point per permettere all'acqua di penetrare al di sotto.
- Aspirare l'acqua e asciugare i coprioggetti, utilizzando un luogo punto pinzetta i coprioggetti in un piatto pulito Petri e sterilizzarli all'interno del forno a microonde per 3 volte, 45 secondi ciascuno. Aggiungere 1,000 ml di acqua sterile e 100 mg di poli-D-lisina (0,1 mg / ml).
- Incubare le coprioggetto con circa 50 ml di poli-D-lisina per 5 minuti a RT. Aspirare completamente i poli-D-lisina.
Nota: Questo è importante perché solubile in poli-D-lisina nel mezzo di coltura può inibire la proliferazione cellulare. - Lavare i coprioggetti cinque volte con acqua sterile per 5 minuti ciascuno. Aspirare la stacqua e lasciare erile coprioggetto ad asciugare all'interno di una cappa a flusso laminare.
- Per analizzare il citoscheletro di actina, liberare le cellule ipofisarie dal alginato. Prendete un po 'delle perline alginato dal pallone di coltura usando un puntale 1 ml e metterli in un tubo da 15 ml.
- Aggiungere 5 ml di citrato di sodio 55 mM (sciogliere 323,6 mg di Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O in 20 ml di soluzione HEPES) e centrifugare a 68 xg per 10 min a RT. Aspirare il surnatante e scartare.
- Risospendere il pellet in 1 ml di caldo M199 arricchito con il 20% FSB; mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta Pasteur.
ATTENZIONE: falloidina E DAPI sono tossici. Usare i guanti per maneggiare i reagenti. - Per contare le cellule, trasferire 125 ml di 0,4% soluzione blu Trypan in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 75 ml di M199 e 50 ml di sospensione cellulare ottenuta nell'ultimo passaggio (fattore di diluizione = 5). Mescolare accuratamente.
- Utilizzare una punta micropipetta per place circa 10 microlitri della sospensione blue-cell Trypan nella camera emocitometro.
- Contare le cellule nel contatore emocitometro utilizzando un microscopio invertito con illuminazione a contrasto di fase. Contare tutte le cellule nel centro della piazza 1 mm e quattro piazze d'angolo 1 mm. Ottenere la densità delle cellule per millilitro moltiplicando il numero medio per quadrato per il fattore di diluizione -. 10 4 Per esempio, se i conteggi medi per quadrato è di 45 cellule x 5 x 104 = 2,25 x 106 cellule / ml.
Nota: Contare le cellule in dieci piazze della camera di emocitometro. Non contare le cellule che toccano la linea mediana in basso e destra. - Seed 35.000 cellule su vetrini diametro di 13 mm rivestiti con poli-D-lisina.
5. Disposizione citoscheletro di actina
- Dopo 48 ore di cultura, rimuovere il terreno di coltura con una pipetta Pasteur e rapidamente aggiungere 500 microlitri per coprioggetto di PBS, immediatamente rimuovere la PBS.
- Fissare e permeabilize tlui cellule con 500 microlitri per coprioggetto di tampone di fissaggio (0.1 M TUBI, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 0,5% Triton X-100 e 2% formaldeide) per 10 min a 37 ° C
- Rimuovere il buffer fissazione e aggiungere 500 microlitri per coprioggetto del 3,5% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a RT. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide.
- Lavare i coprioggetti per tre volte con l'aggiunta di 500 microlitri per coprioggetto di PBS per 5 minuti ciascuna. Sciacquare i vetrini a temperatura ambiente, in costante agitazione.
- Incubare le cellule con cloruro di ammonio 50 mM per 10 minuti, aspirare la soluzione di cloruro di ammonio e ripetere il punto 5.4.
- Incubare le cellule con 1% di BSA (IgG-libera, proteasi-free) in PBS per 30 minuti, rimuovere la soluzione di BSA e ripetere il punto 5.4.
- Incubare le cellule con 50 um di falloidina rodamina coniugato per 7 minuti a temperatura ambiente, ripetere il punto 5.4.
- Incubare le cellule con 255 micron di DAPI diluito in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente, ripetere il punto 5.4. Infine montare tegli coprioggetto con un mezzo di montaggio e di sigillare con smalto.
- Acquisire le immagini delle disposizioni actina citoscheletro usando un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo 63x, a 541 nm di eccitazione lunghezza d'onda.
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Representative Results
Questo protocollo è stato applicato con successo nella cultura e nella manutenzione delle cellule adenoma pituitario in perle di alginato per diversi periodi di tempo figura 1 mostra cellule incorporati in perline alginato dopo tre mesi.; queste cellule mostrano forme arrotondate bi-rifrazione sotto un microscopio ottico invertito (Figura 1). La Figura 2 mostra la localizzazione di N-caderina in cellule d'adenoma pituitario di ratto incorporato in alginato. La N-caderina è localizzata a contatti cellula-cellula (Figura 2A e 2C) e il nucleo ha mostrato la cromatina estesa (Figura 2B e 2C).
Le cellule tumorali in perline alginato rimangono vitali per un massimo di 4 mesi nella cultura; di conseguenza, le cellule possono essere liberati dalle perline alginato in tempi diversi, che permette per le analisi di diversi aspetti dellabiologia cellulare nella stessa coltura cellulare. Ad esempio, l'indice di proliferazione è stato ottenuto da dieci non funzionanti adenomi ipofisari umani usando l'immuno-reattività Ki-67 ed un indice di etichettatura media di 19,2 ± 1,5% (media ± SEM) è stato ottenuto. Figura 3 mostra colta pituitaria umana cellule adenoma immunostained per Ki-67.
I citoscheletro di actina delle cellule di un non-invasiva sono state colorate secondo il protocollo immunocitochimica descritto sopra. Cellule di coltura esposte forme allungate con piccole fibre di stress di actina (figura 4a) .Le morfologie e le modalità filamento di actina variava con l'adenoma ipofisario indipendente dal sistema di coltura; per esempio, in un adenoma invasivo non funzionante, la forma predominante tra queste cellule è stato completato con una disposizione dei filamenti di actina in anelli corticali discontinui. (Figura 4B).
Figura 1. Celle incapsulate in perline alginato per 3 mesi. Cellule presentano forme arrotondate bi-rifrazione sotto un microscopio ottico invertito. Nel pannello di destra cellule macroadenoma invasiva incorporato in alginato sono mostrati, e nel pannello di sinistra sono mostrati cellule macroadenoma non invasive. Barra di scala = 15 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi Immuno-citochimica di N-caderina nelle cellule adenoma pituitario di ratto (GH3) cultura in perline alginato. Cellule GH3 sono state coltivate in alginato, fisso incorporato nel sistema di alginato macchiato per N-caderina (rosso) e il nucleo (blu ). Le cellule sono organizzare in una cumUlus mostrando N-caderina alle frontiere cellula-cellula (A e C). Il nucleo (B e C) sono presenti con cromatina estesa. Barra di scala = 15 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immunocolorazione di Ki-67 cellule adenoma pituitario umane in coltura antigene nucleare. Dopo 2,5 mesi nella cultura perline alginato, le cellule adenoma invasivo non funzionanti sono stati fissati e poi immunostained per Ki-67 (rosso) e il nucleo (blu). Alcune cellule adenoma mostrano immunocolorazione positiva per Ki-67. Barra di scala = 15 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Le modalità del citoscheletro delle cellule adenoma pituitario liberati da perline alginato. Le cellule sono state fissate e colorate per actina filamenti con TRITC-falloidina. Le cellule da un macroadenoma non invasiva sono state estese sul substrato, mostrando piccole stress fibers di actina (A). Le cellule di un macroadenoma invasivo hanno mostrato una forma arrotondata con anelli di actina discontinui (B). Barra di scala = 15 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo ha diversi passaggi critici. Il primo è l'omogeneità formato del branello, che è necessario per mantenere le stesse condizioni di diffusione dei nutrienti e gas in tutta la coltura cellulare. Nella nostra esperienza, l'uso di un ago 21 G per rendere le perline alginato consente l'acquisizione di una cultura efficace di formato del branello uniforme. Il secondo fattore importante è la distanza tra l'ago; questa distanza deve essere non più di 5 cm dalla soluzione di calcio per evitare perle deformi e cellule morte a causa della collisione del flusso della soluzione di alginato / cella con la superficie della soluzione di calcio. Un terzo passo critico è l'agitazione vetro in cui le perline vengono eliminati per evitare che aderiscano l'uno all'altro. Attaccando risultati in incapsulamento delle cellule irregolare.
Alcune modifiche a questo protocollo possono essere eseguite a seconda della domanda di ricerca, ad esempio, nella nostra esperienza la soluzione di alginato di sodio può essere miscelato with una proteina di membrana basale come collagene di tipo IV e seguendo il protocollo precedentemente descritto, ottenere una impalcatura alginato tridimensionale. Un'altra possibilità è quella di rendere cuscini alginato in pozzi di diametro 15 mm flottante; all'interno di questi gel, le cellule possono essere seminati sopra o al loro interno. Risoluzione dei problemi quando si lavora con l'alginato potrebbe essere necessario se qualsiasi esperimento particolare ha bisogno di modifiche nelle loro Ca 2+ o Mg 2+ concentrazioni. Questo perché la stabilità idrogel può essere modificato. Ba 2+ -e Cu 2+ -crosslinked gel di alginato sono relativamente stabili in soluzione acquosa, purtroppo, questi cationi sono spesso citotossica 3.
Quando si lavora con tessuti tumorali come tessuti adenoma pituitario, una limitazione di questa tecnica è il piccolo campione di tessuto disponibile. Pertanto, il numero di perle alginato ottenuti dipende dalle dimensioni del campione di tessuto.
In precedenza, un sistema permantenere le cellule adenoma ipofisario in una cultura tridimensionale è stato descritto. Gli autori hanno presentato le celle rotanti agitando per formare aggregati e mantenuti le cellule in questa condizione per diversi periodi 16. L'uso di questa cultura sospensione cellulare richiede attrezzature rotanti all'interno della camera di coltura. Un vantaggio del protocollo qui descritto è che permette di coltura delle cellule in un sistema tridimensionale senza la necessità di attrezzature di laboratorio supplementari. Le cellule incorporati nel sistema di alginato tridimensionale sono mantenute in un incubatore regolare all'interno un pallone regolare. Un altro vantaggio è che l'impalcatura alginato, in contrasto con altri sistemi tridimensionali, permette alle cellule di essere liberate dal idrogel per ulteriori indagini 7. Inoltre, un aspetto importante della coltura di cellule in perline di alginato è che le cellule incorporate in questo sistema sono in grado di sintetizzare matrice extracellulare de novo. Un'alternativametodo per lo studio delle cellule incorporate in alginato è la fissazione delle perline alginato seguita dalla loro disidratazione con concentrazioni crescenti di glicole polietilene per il successivo sezionamento e Immuno-istochimica analisi 17.
Siamo interessati al futuro di applicare il sistema tridimensionale perline alginato di cellule normali ipofisi di ratto coltura primaria incorporati per analizzare le loro interazioni in un ambiente tridimensionale, e anche alla cultura altro tipo di adenomi ipofisari.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
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