Abstract
Um método de cultura tridimensional é descrito em que as células adenoma pituitário primário são cultivadas em drageias de alginato. O alginato é um polímero derivado de algas marinhas castanhas. Resumidamente, o tecido tumoral é cortado em pequenos pedaços e submetidas a uma digestão enzimática com colagenase e tripsina. Em seguida, uma suspensão de células é obtida. A suspensão de células tumorais é misturado com 1,2% de alginato de sódio e vertida numa solução de CaCl 2, e a suspensão de alginato / célula é gelificada em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. As células embebidas nas drageias de alginato são fornecidos com nutrientes fornecidos pelos meios de cultura enriquecido com 20% de FBS. cultura tridimensional em drageias de alginato mantém a viabilidade das células de adenoma por longos períodos de tempo, até quatro meses. Além disso, as células podem ser libertados a partir do alginato por lavagem das pérolas com citrato de sódio e semeadas em lamelas de vidro para posteriores análises imunocitoquímicas. O uso de um celModelo L cultura permite a fixação e a visualização do citoesqueleto de actina com desorganização mínima. Em resumo, as drageias de alginato proporcionam um sistema de cultura de confiança para a manutenção de células de adenoma pituitário.
Introduction
Andaimes tridimensionais têm sido extensivamente utilizados em cultura de células porque proporcionam um suporte estrutural tridimensional de células de cultura e a manutenção de uma comunicação célula-a-célula. materiais poliméricos naturalmente derivados têm sido usados para fazer suportes tridimensionais, incluindo colagénio do tipo I, a quitosana e alginato. O alginato é um polímero natural derivado do Macrocystispyrifera de algas marinhas castanhas (alga marinha). Este polímero é composto por unidades repetidas de ácido D-manurónico β-(M) e L-α-gulurónico ácido (L) 2 e forma geles estáveis na presença de determinados catiões bivalentes, tais como cálcio e bário. Cloreto de cálcio (CaCl2) soluções são vulgarmente utilizados como o reagente de reticulação para formar as drageias de alginato. Soluções de alginato caiu em CaCl2 formar imediatamente géis esféricas tridimensionais. Quando a solução de alginato é misturada com as células, as células são encapsuladas em alginato bEADS 3.
O alginato tem propriedades que permitiram que ele seja utilizado como uma matriz para a encapsulação de uma grande variedade de células, incluindo condrócitos, mioblastos 4 5 esqueléticos e as células estaminais neurais 6. É um material inerte e permite a difusão de nutrientes, oxigénio e produtos metabólicos que manter a sobrevivência e função de células; Além disso, ao contrário de outros sistemas de cultura à base de gel, células cultivadas dentro de drageias de alginato pode também ser libertado a partir do andaime usando quelantes de cálcio, tais como citrato de sódio, e, em seguida, as células podem ser colhidas para investigações adicionais 7.
adenomas hipofisários são tipicamente tumores benignos com taxas de proliferação baixos. Linhas de células de pituitária de rato adenoma foram cultivadas com sucesso num sistema bidimensional de 8. No entanto, esta cultura de células de tumores humanos de secreção pituitária não é um desenvolvimento eficiente; células de pituitária tumor dispersos crescem malem cultura, as células exibem ligação limitada e difusão, e as células formam tipicamente agregados que flutuam na placa de cultura de 9,10.
Várias tentativas têm sido feitas para se obter uma suspensão de células de tumor da pituitária, incluindo uma abordagem enzimática e dispersão mecânica 11, uma abordagem dispersão unicamente mecânica 12 e a cultura de explantes de tumores 10. Com estas abordagens, diferentes autores obtiveram culturas aderentes viáveis para diferentes períodos de tempo. As capacidades das células secretoras do tumor para sobreviver em tais sistemas bidimensionais dependem do tipo de tumor e as suas taxas de proliferação 9. No entanto, em culturas a longo prazo, as células de fibroblastos com fenótipos predominam 11,13. Este artigo descreve um método para a obtenção de uma cultura primária de células de adenoma pituitário encapsuladas em pérolas de alginato que liberta-los ainda mais a partir do alginato de andaime que permite análises detalhadas deaspectos de sua biologia celular, por exemplo, seus arranjos do citoesqueleto.
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Protocol
Este estudo foi aprovado para o uso de material humano pelas comissões éticas locais do estabelecimento de saúde e do Centro de Pesquisa e avançar nos estudos do Instituto Politécnico Nacional.
Aquisição Amostra 1. Tumor
- Obter a biópsia de tecido adenoma pituitário de um paciente através de um procedimento cirúrgico trans-esfenoidal 14.
- Recolha da amostra adenoma pituitário e colocá-lo em um frasco de vidro estéril contendo 50 ml de fresco 199 de meio de cultura (M199) enriquecido com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 0,6 mg / ml de bicarbonato de sódio, 2,4 mg / mL de Hepes e 1% antibióticos (penicilina / estreptomicina) a pH 7,4. Manter a amostra em um frasco de vidro no gelo.
Nota: O tecido tumoral pode ser processado várias horas após a cirurgia. - Transportar a amostra de tumor para o laboratório do frasco de vidro em gelo.
2. Preparação das soluções enzimáticas Tissue dissociação, oSolução de tripsina inibidor e as soluções de alginato
Nota: Antes do processo de cultura celular preparar as seguintes soluções. Filtro de todas as soluções que utilizam um filtro de membrana de 0,22 um, antes do uso.
- Preparar solução de colagenase a 1% por dissolução de 5 mg de colagenase (tipo I), em 5 ml de livre M199-soro.
- Preparar solução de tripsina a 0,01% por dissolução de 0,01 g de tripsina em 10 ml de PBS-EDTA a 0,3%.
- Preparar a solução de inibidor de tripsina a 0,1% por dissolução de 2 mg de inibidor da tripsina de soja em 20 ml de livre M199-soro.
- Preparar a solução de ADNase por dissolução de 20 ul de ADNase I 134 U / ml em 4 ml de solução de inibidor de tripsina.
- Preparar a solução de EGTA (1,2 M) por dissolução de 22,8 mg de EGTA em 40 ml de NaCl 155 mM. Ajustar o pH para 7,4. Continuar a um volume final de 50 ml.
- Preparar a solução de HEPES (20 mM) por dissolução de 238 mg de HEPES em 50 ml de NaCl 155 mM.
- Preparar a solução de alginato a 1,2% por dissolução de 1,2g de alginato de sódio em 100 ml de solução HEPES. Autoclave a solução de alginato.
- Preparar a solução de cálcio (102 mM) dissolvendo 750 mg de CaCl 2 em 50 ml de solução HEPES, ajustar o pH a 7,4
3. célula primária Cultura e alginato Encapsulation
- Dentro de uma câmara de fluxo laminar, colocar o tecido de tumor em 35 milímetros uma placa de Petri contendo aproximadamente 20 ml de PBS Ca 2+ e Mg 2+ livre, pH 7,4 (PBS *).
- Tome o tecido com uma pinça cirúrgica e colocá-lo em outra placa de Petri contendo PBS fresco *, lavar cuidadosamente o tecido. Repita este passo até que as células vermelhas do sangue e detritos são removidos.
- Usando uma pinça cirúrgica, segure o tecido adenoma pituitário, e com uma pequena tesoura cirúrgica, cortá-la em pedaços pequenos. Com uma pipeta de Pasteur com bordas arredondadas, transferir os fragmentos de tecido e o PBS * para um tubo de 15 ml, de centrifugação a 68 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
Nota: Para arredondar as bordas de um Pasteurpipeta, chama ligeiramente a ponta da pipeta em um bico de Bunsen. - Remover o PBS * usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 3-5 mL da solução de colagenase (cerca de 5 ml para 65 milímetros de tecido 3), misturar duas a três vezes através da inversão. Incubar o tecido na colagenase durante 30 minutos a 37 ° C em rotação constante.
- Centrifuga-se o tubo a 68 x g durante 10 min à temperatura ambiente e remover a colagenase, com uma pipeta de Pasteur.
- Adicionar 5 ml de DNase e misturar duas a três vezes por inversão, depois centrifugar o tubo a 68 x g durante 10 min à TA.
Nota: Se o tecido não é completamente dissociada, executar uma segunda digestão enzimática com tripsina durante 3 min a 37 ° C. Parar a digestão através da adição de 2 volumes de solução de inibidor de tripsina. - Aspirar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e descartar. Re-suspender o sedimento em 1 volume de solução de EGTA e misturar-se com 2 volumes de solução de alginato.
- Misture suavemente a suspensão de células e alginatopipetando com uma pipeta de Pasteur. Dê uma seringa estéril com uma agulha G 21, retire o êmbolo; usar uma pipeta para carregar a seringa com a solução de alginato e de células.
- Suavemente inserir o êmbolo para dentro da seringa e dispensar cuidadosamente gota-a-gota a solução de células de alginato em um copo de vidro contendo cerca de 30 ml da solução rica em cálcio.
- Coloque a agulha da seringa de cerca de 5 cm acima da solução de CaCl 2. Os géis de alginato de suspensão de células em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. Manter as drageias de alginato de cálcio na solução durante 5 minutos.
Nota: Misture o copo de vidro em que as contas são descartados. Mova-se lentamente com a mão em movimentos circulares, para evitar que grudem uns aos outros. - Remova cuidadosamente a solução de cálcio com uma pipeta Pasteur, e lavar as contas duas vezes com 3-5 ml de M199 enriquecido com 20% de FBS.
- Transferir as drageias de alginato em uma cultura de tecidos T25 regularesflask usando uma espátula estéril, adicionar 4-5 mL de M199 enriquecido com 20% de FBS e incubou-se a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2. Mudar o meio de cultura a cada terceiro dia.
4. Libere células a partir do alginato
Nota: Antes de libertar as células a partir das pérolas de alginato, revestimento lamelas 13 mm de diâmetro com poli-D-lisina.
CUIDADO: SULPHURIC ACID é um ácido altamente corrosivos, e APTS PODE CAUSAR IRRITAÇÃO NOS OLHOS E PELE. Use luvas de látex para lidar com esses reagentes.
- Numa hotte, com uma pinça ponto de imergir as lamelas numa placa de Petri de vidro contendo ácido sulfúrico aquoso a 20% durante 1 h à TA.
- Decanta-se o ácido sulfúrico, e lava-se as lamelas cinco vezes com água destilada durante 5 minutos cada. Usando um lugar ponto de pinça as lamelas limpos em uma placa de petri contendo NaOH 0,1 M durante 5 min a RT 15.
- Decantar o NaOH e lavar uma vez com destilarágua levou, aspirar a água e seque as lamelas.
- Usar uma micropipeta para revestir as lamelas com APTS (aminopropil-trietoxissilano) durante 4 min (use 500 ul durante 6 lamelas) inundar o prato de Petri com água destilada. aspirar rapidamente a água e continuar a lavar com água destilada, movendo-se as lamelas com uma pinça de ponto para permitir que a água penetre por baixo.
- Aspirar a água e seque as lamelas, usando um lugar ponto de pinça as lamelas em um prato limpo Petri e esterilizá-los dentro do microondas durante 3 vezes, 45 segundos cada. Adicionar 1000 mL de água estéril para 100 ug de poli-D-lisina (0,1 mg / ml).
- Incubam-se as lamelas com aproximadamente 50 ul de poli-D-lisina durante 5 min à TA. Aspirar o poli-D-lisina completamente.
Nota: Isto é importante porque solúvel poli-D-lisina em meio de cultura pode inibir a proliferação celular. - Lavar as lamelas cinco vezes com água estéril durante 5 minutos cada. Aspirar o stágua e deixe erile lamelas para secar dentro de uma câmara de fluxo laminar.
- Para analisar o citoesqueleto de actina, libertar as células de pituitária do alginato. Tomar algumas das drageias de alginato a partir do frasco de cultura utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml e coloca-os em um tubo de 15 ml.
- Adicionar 5 ml de citrato de sódio 55 mM (dissolver-se 323,6 mg de Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H2O em 20 ml de solução HEPES) e centrifugação a 68 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e descartar.
- Re-suspender o sedimento em 1 ml de M199 quente enriquecido com 20% FSB; misturar suavemente a suspensão de células com uma pipeta de Pasteur.
CUIDADO: phalloidin E DAPI são tóxicos. Utilize luvas para manusear estes reagentes. - Para contar as células, transferir 125 ul de 0,4% solução de azul de Trypan a um tubo de 1,5 ml. Adicionar 75 ul de M199 e 50 ul da suspensão de células obtida na última etapa (factor de diluição = 5). Homogeneizar.
- Use uma ponta de micropipeta para place cerca de 10 uL da suspensão de células com azul de Tripano na câmara de hemocitómetro.
- Contar as células no contador hemocitómetro utilizando um microscópio invertido com iluminação de contraste de fase. Contagem de todas as células, na praça central 1 mm e quatro esquinas 1 mm. Obter a densidade de células por mililitro multiplicando a contagem média por metro quadrado por o factor de diluição, -. 10 4 Por exemplo, se as contagens médias por quadrados é de 45 células x 5 x 104 = 2,25 x 106 células / ml.
Nota: Contar as células em dez praças da câmara de hemocitômetro. Não conte células que tocam na linha do meio em lados direito e inferior. - Semente 35.000 células em lamelas de vidro de 13 mm de diâmetro cobertos com poli-D-lisina.
5. citoesqueleto de actina Arranjo
- Após 48 h em cultura, remover o meio de cultura com uma pipeta de Pasteur e adicionar rapidamente 500 ul por lamela de PBS, imediatamente remover o PBS.
- Corrigir e permeabilizar tele células com 500 ul por lamela de tampão de fixação (0,1 M Pipes, pH 6,75, 4% de PEG-6000, EGTA 1 mM, MgSO 1 mM de 4, 0,5% de Triton X-100 e 2% de formaldeído) durante 10 min a 37 ° C
- Remover o tampão de fixação e adicionar 500 ul por lamela de 3,5% de paraformaldeído em PBS durante 30 min à TA. Remover a solução de paraformaldeído.
- Lavam-se as lamelas três vezes por adição de 500 ul por lamela de PBS durante 5 min cada. Lavar as lamelas à temperatura ambiente, com agitação constante.
- Incubam-se as células com cloreto de amónio a 50 mM durante 10 min, aspirar a solução de cloreto de amónio e repetir o passo 5.4.
- Incubam-se as células com 1% de BSA (IgG-livre, livre-proteases) em PBS durante 30 min, remover a solução de BSA e repetir o passo 5.4.
- Incubar as células com 50 mM de phalloidin rodamina conjugada de 7 min a RT, repita o passo 5.4.
- Incubam-se as células com 255 ^ M de DAPI diluído em PBS durante 5 min à temperatura ambiente, repita a etapa 5.4. Finalmente montar tele lamelas com um meio de montagem e selá-los com unha polonês.
- Adquirir imagens dos acordos de actina do citoesqueleto, utilizando um microscópio confocal de varrimento laser com um objetivo 63X, em 541 nm de comprimento de onda de excitação.
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Representative Results
Este protocolo foi aplicado com sucesso na cultura e a manutenção de células de adenoma pituitário em drageias de alginato para diferentes períodos de tempo, A Figura 1 mostra células incorporados em drageias de alginato depois de três meses.; estas células exibem formas arredondadas bi-refracção sob um microscópio de luz invertida (Figura 1). A Figura 2 mostra a localização de N-caderina em células de adenoma pituitária de rato embebidos em alginato. O N-caderina é localizada em contatos célula-célula (Figura 2A e 2C) e o núcleo mostrou cromatina estendida (Figura 2B e 2C).
As células tumorais em gotas de alginato permanecer viáveis por até 4 meses em cultura; Portanto, as células podem ser libertados a partir das drageias de alginato em momentos diferentes, o que permite a análise de diferentes aspectos dabiologia celular na mesma cultura de células. Por exemplo, o Índice de proliferação foi obtida a partir de dez não-funcionamento adenomas pituitários humanos utilizando a imuno-reactividade para o Ki-67, e um índice de marcação média de 19,2 ± 1,5% (média ± SEM) foi obtido. A Figura 3 mostra pituitária humana cultivadas células de adenoma imunomarcadas para Ki-67.
Os citoesqueleto de actina de células de um não-invasivo foram coradas de acordo com o protocolo de imunocitoquímica descrever acima. Células de cultura exibiu formas alongadas com pequenas fibras de stress de actina (Figura 4A) .Os morfologias e arranjos de filamentos de actina variaram com o adenoma pituitário independente do sistema de cultura; Por exemplo, em um adenoma invasiva não-funcionamento, a forma predominante entre estas células foi arredondado com um arranjo dos seus filamentos de actina em anéis corticais descontínuos. (Figura 4B).
Figura 1. Células incorporadas em gotas de alginato por 3 meses. As células apresentam formas arredondadas bi-refração sob um microscópio de luz invertida. Nas células Macroadenoma invasiva painel direito embutidos em alginato são mostradas, e no painel esquerdo células macroadenoma não-invasivos são mostrados. Barra de escala = 15 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A análise imuno-citoquímica de N-caderina nas células de adenoma pituitária de rato (GH3) cultura em drageias de alginato. GH3 células foram cultivadas em alginato, fixa incorporada no sistema de alginato coradas para N-caderina (vermelho) e o núcleo (azul ). As células são organizar em um cumulus mostrando N-caderina nas fronteiras célula-célula (A e C). O núcleo (B e C) são mostrados com a cromatina estendida. Barra de escala = 15 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A imunocoloração de Ki-67-células humanas antígeno nuclear cultivadas adenomas hipofisários. Após 2,5 meses em cultura talão de alginato, células de adenoma não-funcionantes invasivos foram fixados e, em seguida, histoquímica para Ki-67 (vermelho) e o núcleo (azul). Algumas células de adenoma mostrar imunocoloração positiva para Ki-67. Barra de escala = 15 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Modalidades de citoesqueleto de actina de células adenomas hipofisários libertados das pérolas de alginato. As células foram fixadas e coradas para a actina filamentos com TRITC-faloidina. As células a partir de uma Macroadenoma não-invasiva foram estendidas sobre o substrato, que mostra as pequenas fibras de stress de actina (A). As células a partir de uma Macroadenoma invasivo mostraram uma forma arredondada com anéis de actina descontínuas (B). Barra de escala = 15 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo tem várias etapas críticas. A primeira é a homogeneidade do grânulo de tamanho, o que é necessário para manter as mesmas condições de difusão de nutrientes e gases em toda a cultura de células. Na nossa experiência, a utilização de uma agulha de 21 G para fazer as esferas de alginato permite a aquisição de uma cultura eficiente de tamanho uniforme do grânulo. O segundo factor importante é a distância a partir da agulha; esta distância deve ser superior a 5 cm da solução de cálcio para evitar pérolas deformadas e as células mortas devido à colisão do fluxo da solução de alginato / célula com a superfície da solução de cálcio. Um terceiro passo é crítico da agitação de vidro em que as pérolas são eliminadas para evitar que eles se colem uns aos outros. Degola resultado em encapsulamento de células irregulares.
Algumas modificações para este protocolo pode ser realizada, dependendo da questão de pesquisa, por exemplo, em nossa experiência a solução de alginato de sódio pode ser misturado wom uma proteína da membrana basal, como o colagénio do tipo IV, e seguindo o protocolo anteriormente descrito, obter um andaime alginato tridimensional. Outra possibilidade é fazer almofadas de alginato em poços de 15 mm de diâmetro flutuante; no interior destes geles, as células podem ser semeadas por cima ou dentro delas. Solução de problemas ao trabalhar com o alginato poderia ser necessário se qualquer experiência particular precisa de modificações em suas Ca 2+ ou Mg 2+. Isto é porque a estabilidade de hidrogel pode ser alterada. Ba2 + -e Cu2 + -crosslinked geles de alginato são relativamente estáveis em soluções aquosas, infelizmente, estes catiões são frequentemente citotóxicas 3.
Quando se trabalha com tecidos de tumor, tais como tecidos de adenoma pituitário, uma limitação desta técnica é a pequena amostra de tecido fornecida. Portanto, o número de contas de alginato obtida depende do tamanho da amostra de tecido.
Anteriormente, um sistema demanter as células adenoma pituitário em uma cultura tridimensional foi descrito. Os autores submeteram as células a gyratory agitação para formar agregados e manteve as células nesta condição por diferentes períodos de 16. A utilização desta cultura em suspensão de células requer equipamento giratório no interior da câmara de cultura. Uma vantagem do protocolo aqui descrito é que permite a cultura de células em um sistema tridimensional sem a necessidade de equipamento de laboratório extra. As células incorporados no sistema de alginato tridimensional são mantidas numa incubadora normal dentro de um frasco normal. Outra vantagem é que o andaime alginato, em contraste com outros sistemas tridimensionais, permite que as células a ser libertado a partir do hidrogel para uma investigação mais aprofundada 7. Além disso, um aspecto importante da cultura de células em drageias de alginato é que as células incorporadas na presente sistema é capaz de sintetizar matriz extracelular de novo. Uma alternativamétodo para o estudo de células embebidas em alginato é a fixação das drageias de alginato, seguida da sua desidratação com concentrações crescentes de polietilenoglicol para o seccionamento subsequente e imuno-histoquímica analisa 17.
Estamos interessados no futuro para aplicar o sistema de contas de alginato tridimensional para células pituitária de ratos normais de cultura primária incorporados a fim de analisar suas interações em um ambiente tridimensional, e também para a cultura outro tipo de adenomas hipofisários.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
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