Abstract
For at undersøge de molekylære veje for Parkinsons sygdom (PD) og til at udvikle nye terapeutiske strategier, videnskabelige forskere afhængige dyremodeller. Identifikationen af PD-associerede gener har ført til udviklingen af genetiske PD-modellerne. De fleste transgene α-SYN musemodeller udvikler gradvis α-SYN patologi, men undlader at vise klart dopaminerge celletab og dopamin-afhængige adfærdsmæssige mangler. Denne forhindring blev overvundet ved direkte målretning af substantia nigra med virusvektorer overudtrykker PD-associerede gener. Lokal genafgivelse under anvendelse virale vektorer giver en attraktiv måde at udtrykke transgener i centralnervesystemet. Specifikke hjerneregioner kan målrettes (f.eks substantia nigra), kan ekspression induceres i den voksne indstilling og kan opnås høje ekspressionsniveauer. Endvidere kan forskellige vektor systemer baseret på forskellige vira anvendes. Protokollen beskriver alle afgørende skridt til at udføre en viral vektorinjektion i substantia nigra rottens at udvikle en viral vektor-baserede alfa-synuclein dyremodel for Parkinsons sygdom.
Introduction
For at undersøge patofysiologien af PD og til at udvikle nye terapeutiske strategier, der er et presserende behov for dyremodeller, der nøje ligner neuropatologien, fysiologi og motoriske symptomer på menneskets PD. Jo højere den prædiktive værdi, jo bedre vi kan oversætte nye terapier fra dyremodeller til patienter.
Opdagelsen af alfa-synuclein (α-SYN) som første PARK genet i 1997 førte til udviklingen af de første genetiske PD-modellerne. Mange transgene mus overudtrykker humant vildtype (WT) eller mutant (A30P, A53T) α-SYN er blevet dannet i det sidste årti. Niveauerne af α-SYN overekspression har vist sig at være afgørende for udviklingen af patologien. Også musestammen, nærvær eller fravær af endogen α-SYN, og om den fulde længde eller en trunkeret form udtrykkes, spiller en rolle (detaljeret gennemgang af Magen og Chesselet 1). Overekspression af både WT og flere kliniske mutanter af human &# 945; -SYN i transgene mus inducerer patologisk akkumulation af α-SYN og neuronal dysfunktion 2-6. Men indtil nu mest transgene α-SYN musemodeller undladt at vise klart dopaminerge celletab og dopamin-afhængige adfærdsmæssige mangler.
Denne forhindring blev overvundet ved direkte målretning af substantia nigra (SN) med virusvektorer overudtrykker α-SYN. Virale vektorer er afledt af vira, der let kan inficere celler, indføre genetisk materiale i deres værtsgenomet og tvinger værtscellen at replikere det virale genom for at producere nye viruspartikler. Vira kan manipuleres til ikke-replikerende virale vektorer, der bevarer deres evne til at trænge ind i celler og introducere gener. Ved at slette dele af det virale genom og erstatte dem med generne af interesse, vil anvendelse af vektoren resulterer i en enkelt runde infektion uden replikation i værtscellen, generelt betegnet som "transduktion". Virale vektorer cen bruges til både overekspression og gendæmpning. Det udtrykte transgen kan være en reporter protein (f.eks grønt fluorescerende protein eller ildflueluciferase) 7, et terapeutisk protein til genterapi applikationer 8-10 eller, som vi vil fokusere på i dette papir, en sygdomsrelateret protein bruges til sygdom modellering 11 -14.
Viral vektor-formidlet gen-levering tilvejebringer en alternativ måde at udtrykke transgener i CNS med flere fordele. Brug lokal transgen levering, kan specifikke hjerneområder målrettes. Endvidere kan transgenekspression induceres i voksenalderen mindske risikoen for kompenserende mekanismer under udviklingen. Desuden kan modeller laves i forskellige arter og stammer. Og endelig forskellige transgener kan let kombineres. Brug af virale vektorer, kan høje transgene ekspressionsniveauer opnås, hvilket kan være afgørende, eftersom sygdommen indtræden og sværhedsgraden ofte afhænge af niveauet af overexpression.
Adskillige vektorsystemer baseret på forskellige virus er blevet udviklet. Valget af vektorsystem afhænger af størrelsen af genet af interesse, den nødvendige varighed af genekspression, målcellen og spørgsmål om biosikkerhed. For stabil genoverførsel i hjernen, lentivirale (LV) og rekombinant adenoassocieret viral (rAAV) -vektorer betragtes nu de vektorsystemer af valg, da de fører til effektiv og langvarig genekspression i gnaverhjerne. For specifik målretning af de dopaminerge neuroner (DN) i SN, har rAAV vektorer efterhånden udkonkurreret LV vektorer på grund af deres højere titre og transduktion effektivitet DN.
De bedste α-SYN baseret gnavermodeller øjeblikket er til rådighed er blevet udviklet fra en kombineret metode nyere AAV serotyper (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) og optimeret vektor konstruktioner, titre og renhed 15,16. Vektoren titer samt vektoren renhed påvirker direkteden fænotypiske resultatet af modellen. Overdreven vektor titre eller utilstrækkeligt oprensede vektor partier kan resultere i ikke-specifik toksicitet. Derfor passende kontrolforanstaltninger vektorer er uundværlige. Betydelig tid investering i de virale vektor produktion, opskalering og oprensningsmetoder har også vist vigtigt at opnå reproducerbare og høj kvalitet vektor partier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter dyr gennemføres i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv af 24. november 1986 (86/609 / EØF) og godkendt af bioetik udvalg universitetet i Leuven (Belgien).
1. Rekombinant AAV fremstilling og oprensning
Bemærk: rAAV-vektor produktion og oprensning blev udført ved Leuven Viral Vector Core (LVVC) som tidligere beskrevet 17.
- Kort beskrevet transficere subkonfluerende lav (<50) passage adhærente HEK 293T-celler under anvendelse af en 25 kD lineær polyethylenimin 150 nM NaCl transfektionsopløsning og tre forskellige plasmider i et forhold på 1: 1: 1 i DMEM medium 2% føtalt bovint serum. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C i en 5% CO2, udskifte mediet med frisk DMEM medium 2% føtalt bovint serum.
Bemærk: Plasmiderne omfatter konstruktionerne for AAV7 serotype, AAV transfer plasmid, som koder det humane A53T mutant α-SYN under kontrol af den CMVIE forbedrede Synapsin1 promotoren og pAdvDeltaF6 adenoviral helper plasmid 17. - Høst mellemlang 5 dage efter transient transfektion og koncentrere under anvendelse tangentielstrømningsfiltrering 17.
- Rense rAAV vektorpartikler fra den koncentrerede medium ved anvendelse af en iodixanol tringradient 17.
- Brug standard teknikker real-time PCR for genomisk kopi (GC) beslutsomhed. I denne protokol, en vektor titer på 3,0 E11 GC / ml blev anvendt til at udvikle en α-SYN baseret rotte model for PD 17.
2. Stereotaktisk injektion af rAAV α-SYN Vector i SN af rotten (figur 2)
- House otte uger gamle Wistar rotter med en vægt omkring 200-250 g under en normal 12 timers lys / mørke cyklus med fri adgang til pelleteret foder og vand fra hanen.
- Indsende rotte til intraperitoneal (ip) anesthesia indeholdende en blanding af ketamin (60 mg / kg) og medetomidin (0,4 mg / kg). Når rotten er bedøvet og ikke reagerernår presse forskellige poter, administrere et mikro-transponder subkutant på bagsiden af rotte for yderligere anerkendelse ved anvendelse af en mikro-transponder implanter. Kontroller, om mikro-transponder er placeret korrekt, og kan udlæses ved læsning enhed.
- Klippe håret på toppen af hovedbunden. Påfør en lokalbedøvelse på både hovedbunden og ørerne. Udfør resten af den kirurgiske procedure under en laminar strømning under anvendelse af aseptiske teknikker.
- Placer rotterne i en stereotaktisk hoved ramme ved hjælp af to øre barer, en mund og en næse bar. Dække kroppen af rotte med et papir tæppe at undgå et fald i kropstemperatur. Påfør et okulært smøremiddel for at forhindre øjnene mod udtørring.
- Desinficere hovedbunden med jodium 1% i isopropanol 70% og lave et lille snit i midterlinjen af hovedbunden. Forsigtigt skrabe væk membranerne på kraniet og skyl med saltopløsning. Lad kraniet tørre i adskillige minutter. Overhold kranielle suturer og de to referencepunkter: Bregma og Lambda. For at injicere rAAV-vektor i SN, definere koordinaterne mod Bregma (anteroposteriore: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm og dorsoventral: 7,2 mm beregnes fra dura).
Bemærk: De tredimensionale koordinater for hvert område af interesse kan beregnes ved hjælp af en stereotaksiske atlas af rottehjernen, anvendelse Bregma som anatomisk referencepunkt. - Fyld en 10 pi mikroinjektion sprøjte (30 gauge 20 mm) med rAAV-vektor og placere den i stereotaktisk instrument forbundet med en motoriseret mikroinjektion pumpe. Styr lydstyrken ved at frigive en dråbe vektor og fjerne i en polyvalent rengøringsmiddel pH 9 (f.eks RBS).
- Kontrollér visuelt, hvis hovedet er fast lige i hovedet rammen og evaluere venstre-højre akse. Omhyggeligt visuelt definere anteroposteriore og mediolateral koordinater for Bregma og Lambda og måle deres højde ved anvendelse af en 30 gauge 20 mm nål i dorsoventral arm af stereotaktisk ramme.
- Tillad amaks på 0,3 forskel mm i højden mellem Bregma og Lambda. Placer nålen tilbage på Bregma og anvende anteroposteriore og mediolateral koordinater ved at flytte anteroposteriore og mediolateral arm af stereotaktisk ramme.
- På det sted, injektion, måle højden af kraniet og sikre, at den ikke afviger mere end 0,3 mm fra højden af Bregma. Bore et hul i kraniet med en diameter på ca. 2 mm. Måle højden af dura, vil dette tjene som reference til at anvende dorsoventral koordinat. Alternativt subtrahere en fast tykkelse for kraniet (0,9 mm).
- Gennemtrænge dura under anvendelse af en 26 gauge nål og absorbere blodet med en steril væv. Vent indtil alle blødningen er stoppet, før du fortsætter.
- Sæt langsomt den 10 pi mikroinjektion sprøjte præinstalleret med vektor løsning i hjernen til den forudbestemte dybde (dorsoventral koordinat). Vent 1 min med nålen på plads. Sprøjt 3 piaf vektor-opløsning (3,0 E11 genom kopier / ml (medium vektor dosis) eller 1,0 E12 GC / ml (høj vektor dosis) af rAAV2 / 7 α-SYN eller eGFP styrevektor) under anvendelse af motoriserede mikroinjektion pumpe med en kapacitet på 0,25 pl / min.
- Efter injektion, holde nålen på plads for en anden 5 minutter før langsomt fjerner den. Sy hovedbunden ved hjælp belagt flettet polyester 3,0 desinficere med 1% jodium i 70% isopropanol og fjern forsigtigt dyret fra stereotaktisk instrument. Først løsnes næse og mund bar, skal de to øre barer.
- At vende anæstesi injiceres rotten intraperitonealt med 0,5 mg / kg atipamezol og placere rotten i en ren bur på en varmeplade på 38 ° C, indtil den aktiveres. Dæk rotte med et papir tæppe til at forhindre et fald i kropstemperatur.
- Der skal være let adgang til mad og vand til de første timer. Overvåg rotten i de første par dage. Hvis det er nødvendigt at anvende analgesi.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at fjerne maskerne fra than kraniet. Efter 1-2 uger kraniet er helt repareret og de masker kommer løs.
3. Vurdering af rAAV2 / 7 α-SYN Indsprøjtede Rotter bruger ikke-invasiv PET Imaging, Behavioral Tests og immunhistokemisk analyse
- Som opfølgning kinetikken for nigrostriatale dopaminerge neurodegeneration ikke-invasivt over tid i de enkelte dyr, kvantificere dopamin-transporteren (DAT) binding under anvendelse af mindre dyr tomografi positron emission (PET) og et sporstof af DA Transporter f.eks [18F] -FECT 16 .
- For at undersøge, om niveauet for dopaminerge neurodegeneration er tilstrækkelig til at fremkalde motoriske svækkelser i rotterne, underkaste rotterne til cylinderen test for at vurdere spontan forben brug.
- Placer rotte i en 20 cm bred klart glas cylinder og videobånd adfærd under lodrette bevægelser langs væggen og landing efter en bageste. Score antallet af kontakter fra hver forpote for i alt 20kontakter. For detaljeret beskrivelse af de kriterier scoring se Schallert et al. 18 Udtryk antallet af værdiforringede forben kontakter (f.eks venstre forpoteknogler) som en procentdel af de samlede forben kontakter (venstre plus højre forpote).
Bemærk: rotter Ikke-læderede kontrol med begge poter lige skulle score omkring 50% i denne test.
- Placer rotte i en 20 cm bred klart glas cylinder og videobånd adfærd under lodrette bevægelser langs væggen og landing efter en bageste. Score antallet af kontakter fra hver forpote for i alt 20kontakter. For detaljeret beskrivelse af de kriterier scoring se Schallert et al. 18 Udtryk antallet af værdiforringede forben kontakter (f.eks venstre forpoteknogler) som en procentdel af de samlede forben kontakter (venstre plus højre forpote).
- Udfør immunhistokemisk (IHC) analyse for at vurdere niveauet af transgen ekspression og dopaminerge celle tab.
- På forskellige slutstadiet, ofrer rotterne med en overdosis af natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) og udfører en intracardial perfusion med koldt saltvand efterfulgt af 4% paraformaldehyd i PBS 19. Fiksere hjernerne natten over ved 4 ° C og skæres 50 um tykke koronale hjernesnit anvendelse af en vibrerende mikrotom.
- Udfør IHC farvning på fritflydende sektioner ved hjælp af antistoffer mod α-SYN og tyrosinhydroxylase at analysere α-SYN ekspressionsniveauer og level af neurodegeneration 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den samlede ordning af forsøget er vist i figur 1
rAAV 2/7-medieret overekspression af A53T α-SYN inducerer dopamin-afhængige motoriske mangler.
For at undersøge, om niveauet for α-SYN overekspression er tilstrækkelig til at inducere motoriske svækkelser hos rotterne, underkastede vi rotterne til cylinderen test til bedømmelse spontan forben brug (figur 3A). Fra 3 uger efter injektion, blev en signifikant motorisk svækkelse hos rotter, der fik en dosis 3,0 E11 GC / ml A53T α-SYN rAAV2 / 7-vektor. Ved 4 uger efter injektion blev der observeret en 50% nedgang i spontan kontralaterale (venstre) forpote brug, mens kontrollen eGFP rAAV2 / 7 injicerede dyr viste ingen asymmetri i forpote brug (figur 3B). Rotter, der modtog en højere A53T α-SYN rAAV2 / 7 vektor dosis viste en mere udtalt impairment af forpote brug (70%) ved 29 dage efter injektion (figur 3C). For at bevise, at den observerede motorisk svækkelse var dopamin-afhængige, vi administreret en enkelt dosis af L-DOPA (6 mg / kg ip) til rotterne injiceret med en høj vektor dosis. Når vi gentog cylinder test 45 min efter L-DOPA behandling, en fuld genopretning af forpote brug i A53T α-SYN rAAV2 / 7 injicerede dyr blev observeret (figur 3C).
PET imaging tillader ikke-invasiv billeddannelse af α-SYN inducerede progressiv neurodegeneration.
For at følge op kinetikken af nigrostriatale dopaminerge neurodegeneration ikke-invasivt over tid i de enkelte dyr, vi kvantificeret dopamin-transporteren (DAT) binding ved hjælp af små-dyr tomografi positron emission (PET) med [18 F] -FECT som radioaktiv ligand. DAT-binding faldt betydeligt i de ipsilaterale spiegelske-putamen af A53T α-SYN rAAV2 / 7 injected rotter over tid, men forblev stabil i eGFP kontrol dyr (Figur 4A - 4B). Kvantificering af DAT binding af A53T α-SYN rAAV2 / 7 injicerede dyr viste en maksimal hastighed på nigrostriatale dopaminerge degeneration mellem dag 7 og 21 efter injektion. Efter 32 dage blev et fald i DAT binding af op til 85% observeret (figur 4C). Som en positiv kontrol, injektion af neurotoksinet 6-OHDA i SN inducerede 90% tab af DAT binding inden for 7 dage (Figur 4B - 4C).
Stereotaktisk injektion af rAAV2 / 7 A53T α-SYN i SN af rotte inducerer nigrale dopaminerg celledød og dannelse af uopløselige α-SYN positive aggregater.
For at analysere niveauet af α-SYN overekspression og dopaminerge celletab vi aflivet dyr på forskellige tidspunkter. IHC blev udført på fritflydende sektioner ved hjælp af et antistof against α-synuclein (kanin polyklonalt 1: 5.000). Dette antistof kan registrere både humane og rotte α-synuclein, men endogene niveauer af rotte α-synuclein var under detektionsgrænsen inden nigrale celle somata, på grund af sin dominerende lokalisering på synaptiske membraner. Til æsler celletab brugte vi et antistof mod TH (kanin polyklonale 1: 1000).
Fire dage efter rAAV-vektor injektion blev α-SYN eller eGFP ekspression påvist i SN (figur 5A - 5C) af rotterne. Størstedelen (> 90%) af DN blev effektivt transduceret og begge transgene proteiner blev lokaliseret i cellelegemer og axoner. Ved 29 dage blev observeret efter injektion (PI) en væsentlig reduktion af α-SYN ekspression i SNpc, mens det stadig var påviselig i områder omkring SN (figur 5B - 5C). Dernæst analyserede vi niveauet af nigrale celletab. En hurtig og fremadskridende tab of op til 80% af TH-positive neuroner blev detekteret over 29 dage hos rotter injiceret med A53T α-SYN rAAV2 / 7 (figur 5D - 5H). Notatet overekspression af vildtype stedet for A53T α-SYN resulterede i lignende dopaminerg neurodegeneration (data ikke vist). Tabet af DN i SN blev modsvaret af en robust fald i TH-positive nerveterminaler i striatum (STR) (figur 5F). At udelukke bestemte vektor batch virkninger blev forskellige α-SYN vektor-præparationer testet i SN med lignende resultater. Ingen reduktion i TH farvning blev observeret i SN eller STR af eGFP rAAV2 / 7 injiceret kontroldyr (Figur 5E-5H). Desuden dopaminerg neurodegeneration, tilstedeværelsen af α-synucleinopathy er et andet væsentligt kendetegn ved PD. Trods den korte tidsforløb for vores model (fire uger), vi observeret både α-SYN-positive cytoplasmatiske aggregater i SN og dystrofiske neuritter i STR (figur 5I ong>). Ubiquitin immunoreaktivitet er et særligt træk af Lewy body patologi i den menneskelige hjerne 20-22. Vi observerede co-lokalisering af α-SYN og ubiquitin på 29 dage pi i en fraktion (± 20%) af α-SYN udtrykkende nigrale neuroner (figur 5J). Den fibrillære karakter α-SYN aggregater blev bedømt ved thioflavin S (Thio S) farvning 23. Thio S positive celler blev påvist i SN fra 17 dage og opefter (figur 5J).
Figur 1:. Stereotaktisk injektion af rAAV2 / 7 α-SYN vektor resulterer i progressiv neurodegeneration Stereotaktisk injektion af rAAV2 / 7 α-SYN vektoren i SN af rotte inducerer dopaminerg neurodegeneration målt via adfærd analyse (cylinder test), ikke-invasiv PET billedbehandling og IHC-analyse.d / 53.670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Stereotaktisk injektion af rAAV2 / 7 vektor, der koder α-SYN i SN rottens. (A, B, E) De kraniel suturer på rotte kraniet, som definerer de to referencepunkter: Bregma og Lambda. (C) En stereotaksiske atlas af rottehjernen præsentere regionen injektion nemlig SN. (D) En Wistar rotte anbragt i en stereotaktisk hovedramme under anvendelse af to øre barer, en mund og en trykbjælke. (F) 30 gauge nål fyldt med vektor placeres i position for substantia nigra. (G) En lille helhed bores på injektionsstedet og nålen er placeret i position. (H) Efter injektion hovedbunden er stitched og desinficeres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: rAAV 2/7-medieret overekspression af A53T α-SYN inducerer dopamin-afhængige motoriske mangler (A, B) Cylinder test på forskellige tidspunkter efter injektion af rAAV2 / 7 A53T α-SYN.. (Middelværdi ± standardafvigelse, * p <0,05 versus 17 dage # p <0,05 eGFP kontrol ved ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). (C) Cylinder test på forskellige tidspunkter efter injektion af rAAV2 / 7 A53T α-SYN (høj vektor dosis). (Gennemsnit ± SD, * p <0,05 4 dage mod 29 dage ved ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). Testen blev udført med eller uden administrering af Levodopa (L-DOPA). (Middelværdi ± standardafvigelse, * p <0.05 ikke-behandlede versus behandlede dyr ved ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). Genoptrykt fra Neurobiologisk af aldring, Vol. 36, Van der Perren et al., Langsgående opfølgning og karakterisering af en robust rottemodel for Parkinsons sygdom baseret på overekspression af alfa-synuclein med adenoassocierede virale vektorer, 1543-1558, (2015), med tilladelse fra Elsevier. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Ikke-invasiv billeddannelse af A53T α-SYN induceret dopaminerg celledød under anvendelse DAT PET imaging (A - B) Serie af horisontale og koronale skiver afbilder gennemsnitlige striatale DAT binding af (A) rAAV2 / 7 A53T α-SYN injicerede dyr ved different tidspunkter efter injektion (n = 7) og (B) rAAV2 / 7 eGFP injiceret (n = 1) eller 6-OHDA behandlede kontroldyr (n = 1) 79 dage efter injektion. Color søjler indikerer bindende potentialer for DAT. (C) Kvantificering af DAT binding af rAAV2 / 7 A53T α-SYN, rAAV2 / 7 eGFP og 6-OHDA injicerede dyr målt på forskellige tidspunkter (data repræsenterer middelværdi ± SD). Genoptrykt fra Neurobiologisk af aldring, Vol. 36, Van der Perren et al., Langsgående opfølgning og karakterisering af en robust rottemodel for Parkinsons sygdom baseret på overekspression af alfa-synuclein med adenoassocierede virale vektorer, 1543-1558, (2015), med tilladelse fra Elsevier. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: rAAV 2/7-medieret overekspression af A53T α-SYN inducerer dopaminerge celledød og dannelse af uopløselige α-SYN positive aggregater. (A - B) IHC farvning viser α-SYN overekspression 4 dage og 29 dage efter rAAV medieret overførsel rotte SN. Indsætter viser forstørrelser af det valgte område. Scale bar = 400 um (oversigtsbillede venstre), 70 um og 200 um (skær højre). (C) IHC farvning viser eGFP overekspression 4 dage og 29 dage efter rAAV medieret overførsel i rotte SN. Scale bar = 400 um. (D - G) IHC farvning for TH i SN og STR på forskellige tidspunkter efter injektion af (D, F) rAAV2 / 7 α-SYN eller 29 dage efter injektion af (E, G) rAAV2 / 7 eGFP i SN . Scale bar a, c = 400 um, b, d = 1,000 um. (H) Stereologisk kvantificering af følelsesløsER af TH-positive neuroner i SN over tid efter rAAV2 / 7 A53T α-SYN injektion eller rAAV2 / 7 eGFP kontrolvektor (gennemsnit ± SD, * p <0,05 versus 8 dage # p <0,05 versus eGFP kontrol ved ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). (I) IHC farvning viser α-SYN patologi, herunder cytoplasmatiske aggregater i SN og dystrofe og svulmende neuritter i STR, efter intranigral rAAV2 / 7 A53T α-SYN injektion. (J) Repræsentative konfokale billeder af fluorescerende dobbelt immunfarvninger for α-SYN (grøn) og ubiquitin (rød) viser en stigning i co-lokalisering over tid (pile). Scale bar c = 50 um. Thioflavin S-farvning af SN 29 dage efter injektion af rAAV2 / 7 A53T α-SYN. Scale bar D = 30 um. Genoptrykt fra Neurobiologisk af aldring, Vol. 36, Van der Perren et al., Langsgående opfølgning og karakterisering af en robust rottemodel for Parkinsons sygdom baseret på overekspression af alfa-synuclein med annonceeno-associerede virale vektorer, 1543-1558, (2015), med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin i protokollen. Vektoren titer samt vektoren renhed direkte påvirker den fænotypiske resultatet af modellen. Overdreven vektor titre eller utilstrækkeligt oprensede vektor partier kan resultere i ikke-specifik toksicitet. Derfor er brugen af høj kvalitet vektor partier og passende kontrolforanstaltninger vektorer er uundværlig. Endvidere nøjagtig placering af rottens hoved i stereotaktisk ramme og nøjagtig bestemmelse af koordinaterne er afgørende målretning substantia nigra. Efter boring af hullet i kraniet ved injektionsstedet, er det vigtigt at indsætte kanylen direkte ind i rottens hjerne uden at røre nogen marginer. Nålen skal langsomt fjernes efter injektion den virale vektor, for at forhindre vektor lækage. Endelig efter syning, hovedbunden skal desinficeres med 1% jodium i 70% isopropanol at undgå bidende af masker af andre dyr. Alternativt andre antiseptiske reagenserKan bruges.
Den beskrevne fremgangsmåde kan også anvendes til at udvikle en rAAV2 / 7 α-SYN baseret mus model for Parkinsons sygdom 24. Hos mus injicerer vi et volumen på 2 pi rAAV-vektor i SN. Sammenlignet med rotter, mus DN synes at være noget mindre følsom over for a-SYN overekspression, hvilket resulterer i en forsinket manifestation af neurodegeneration. Desuden kan andre regioner i hjernen (f.eks striatum, hippocampus, cortex, etc.) målrettes. Koordinaterne for de forskellige hjerneområder kan findes i stereotaktisk atlas. Optimering af koordinaterne kan gøres ved kinesisk blæk eller ved anvendelse af en viral vektor, der koder for et reportergen (f.eks eGFP). Forskellige vektorer systemer (rAAV, LV, osv) kan anvendes afhængigt af anvendelsen.
Denne teknik har den begrænsning, at samtlige dyr skal injiceres individuelt. Derfor er en uddannet person bør udføre injektioner for at minimize variationer mellem de forskellige dyr. En anden begrænsning er, at metoden er tidskrævende (når udføres af en uddannet person, det tager omkring 45 min per dyr). Kun otte til ti dyr kan injiceres på én dag.
Viral vektor-formidlet gen-levering tillader specifik målretning af hjerneregioner. Brug af virale vektorer, kan høje transgene ekspressionsniveauer opnås, hvilket er afgørende, da sygdommen indtræden og sværhedsgraden afhænger af niveauet af α-SYN ekspression. Desuden kan forskellige doser anvendes, som vil resultere i en dyremodel udviser langsommere eller hurtigere kinetik for neurodegenerering. Endelig kan denne teknik anvendes til at skabe modeller i forskellige dyrearter og stammer under anvendelse af samme vektor forberedelse.
Denne procedure kan anvendes til at levere virale vektorer samt toksiner (f.eks 6-OHDA) i forskellige regioner i brain.The transgen kodes af vektoren, kan være en reporter protein, et terapeutisk protein til genterapi applikationer 8-10 eller et sygdomsrelateret protein bruges til sygdom modellering 11-14. Denne teknik kan bruges til at udvikle nye dyremodeller som muliggør præklinisk afprøvning lægemiddel og kan være gavnlig til at studere den molekylære mekanisme af Parkinsons sygdom samt mange andre neurodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen aktuel eller potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Joris Van Asselberghs og Ann Van Santvoort for deres fremragende teknisk bistand. Forskning blev finansieret af IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), den FWO Vlaanderen (G.0768.10), som EF-FP6-program "Dimi" (LSHB-CT-2005 til 512.146), FP7 FTU-projekt MEFOPA (SUNDHED -2.009-241.791), FP7-programmet "INMiND« (HEALTH-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), og den MJFox Foundation (Target validering 2010). A. Van der Perren og C. Casteels er et postdocs af den flamske Fund af videnskabelig forskning. K. Van Laere er en ledende klinisk fyr af den flamske Fund af videnskabelig forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6 mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F.
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L.
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. 3rd Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
