Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

Abstract

הניתוח של טירוזין קינאז הקולטן הליגנדים האינטראקציה שלהם מעורב ביולוגיה וסקולרית הרבה פעמים הוא מאתגר בשל הביטוי המכונן של משפחות של רצפטורים קשורים, מגוון רחב של הליגנדים המתייחסים ואת הקושי להתמודד עם תרבויות עיקריות של תאי אנדותל מיוחדים. כאן אנו מתארים מבדק לצורך זיהוי של הליגנדים לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם קולטן 2 (VEGFR-2), מתמר מפתח של אותות המקדמים אנגיוגנזה lymphangiogenesis. CDNA קידוד היתוך של האזור (ליגנד המחייבת) תאיים של VEGFR-2 עם הטרנסממברני ואזורי cytoplasmic של הקולטן אריתרופואטין (EpoR) מתבטא הקו הסלולרי גורם תלויה Ba / F3. שורת תאים זה גדל בנוכחות interleukin-3 (IL-3) ונסיגה של תוצאות גורם זה מוות של תאים בתוך 24 שעות. הביטוי של היתוך קולטן VEGFR-2 / EpoR מספק מנגנון חלופי לקדם הישרדות בפוטנציהlly תרבות תאי Ba / F3 transfected ביציבות בנוכחות ליגנד מסוגל חייב cross-linking החלק התאי של חלבון ההיתוך (כלומר, אחד שיכול קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2). Assay יכול להתבצע בשתי דרכים: גישה כמותית למחצה שבו כמויות קטנות של ליגנד ותאי להתיר מכך מהיר ב -24 שעות, ועל גישת כמותית המעורבת סמנים פונדקאיים של מספר תאי קיימא. Assay הוא יחסית קל לבצע, הוא היענות נלהבת הליגנדים VEGFR-2 ידוע והוא יכול להכיל מעכבי תאיים של VEGFR-2 איתות כגון נוגדנים חד שבטיים לקולטן או ליגנדים, ומלכודות ליגנד מסיסים.

Introduction

הגורם (vascular endothelial growth VEGF) המשפחה של גורמי גדילה חלבון המופרש ו קולטנים בתא השטח מאותו מקור שלהם היא קבוצה חשובה ומגוונת של הליגנדים מסיסים קולטני-מוטבע הממברנה, בהתאמה כי הפונקציה transducing אותות על פני קרום התא. הן מתפקדות בעיקר בתאי האנדותל אלא גם בתאים ממוצא אפיתל ואלה של 1,2 מערכת החיסון. מסלולי איתות עוסקת ידי קולטני VEGF המופעל ליגנד (VEGFRs) הן קריטיות פתולוגיות הגדולות, כגון ניוון וסרטן מקולרי הקשור לגיל, ותרופות מיקוד מהם נמצאים בשימוש קליני תכופים (למשל, bevacizumab נוגדן חד-שבטי שמכוונת-A VEGF) 3,4.

אחת המורכבויות של משפחת VEGF הוא המגוון של הליגנדים מסיסים הנוכחי בטבע (-A VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, חלבונים VEGF המקודדים על ידי ORF המשפחה וירוס parapox ו VEGF ארס נחשים, בתוספת אחרים מעכבisoforms של VEGF-A) 2.

ליגנדים אלה אינטראקציה עם שלושה מבני משפחת טירוזין קינאז קולטן, כלומר VEGFR-1, VEGFR-2 ו VEGFR-3. קולטנים אלה באים לידי ביטוי variably על תאים מסוגים שונים, אך לעתים קרובות הם הביעו במשותף על פני השטח של תאי האנדותל המרפדים את כלי הדם הלימפה מכל הגדלים 5. VEGFR-2 יכול לחייב את יונקים הליגנדים VEGF-A 6, VEGF-C 7 ו VEGF-D 8,9 וכן ORF וירוס 10 VEGF ו- נחש ארס 11 VEGF. VEGFR-2 משחק תפקיד מרכזי בהנעת אנגיוגנזה (צמיחת כלי דם חדשים מכלי קיימים) ב ההתפתחות העוברית, ריפוי פצעים, סרטן ומחלות עיניים. בהקשרים אלה, הליגנדים כגון-A VEGF, לאגד -C ו -D ולהפעיל את הקולטן על תאי האנדותל של כלי דם דם 12-15. על תאי אנדותל הלימפה, VEGFR-2 ממלא תפקיד lymphangiogenesis, היווצרות של כלי הלימפה חדש 16. VEGFR-2 יכול גם לקדם התרחבות והרחבת העורקים הגדולים lymphatics בתאים בריאים המחלה 17. הבנה מלאה של VEGFR-2: אינטראקציות ליגנד לכן חשובה לפיתוח מעכבים לשימוש בטיפול במחלות תלויה אנגיוגנזה 18. בעוד שרוב isoforms של VEGF-A נקשר VEGFR-2, מחשוף פרוטאוליטים של VEGF-C ו- VEGF-D נדרש לשחרר שבר המורכב של תחום VEGF-ההומולוגיה שמספק זיקה גבוהה מחייבת VEGFR-2 19,20.

פתחנו מבדק לפקח ליגנדים של VEGFR-2 אשר נועד לעקוף את הצורך בתאי האנדותל עיקריים, אשר קשים מבחינה טכנית למעבר, יקרים לרכישת תרבות (הדורשים בינוני מיוחד) 21 ולהביע VEGFRs מרובה הקשורים שיתוף קולטני 22. Heterodimerization של VEGFR-2 עם קולטנים VEGF אחרים או-קולטנים שיתוף יכול לגרום מורכבות רצויות כאשר מכוון כדי הרבעהקולטן ליגנד אינטראקציות בינארי y, הערכת פעילות מיוחסת קולטן מסוים, או בהערכת ההשפעה של חומרים כימיים מעכבות. 23. המבדק שומר ניידות של הקולטן הרלוונטי בקרום התא ומאפשר הערכה של יכולתו של ליגנד לקשור קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2.

המבדק מסתמך על יצירת קולטן chimeric בו נמצא האזור תאיים של קולטן VEGF (במקרה זה VEGFR-2) הוא קיבע את הטרנסממברני ואזורים תאיים של קולטן אריתרופואטין (EpoR), חבר של המשפחה הקולטן ציטוקינים 8,24. חלבון היתוך זו בא לידי ביטוי אז הקו הסלולרי פרו-B תלוי הגורם Ba / F3, שעליו גירוי עם ליגנד מסוגל מחייב צולבות המקשרים את התחום התאי של הקולטן גורם הפעלה של האזור מפעיל cytoplasmic, מסוגל של transducing אות הישרדות באמצעות קינאזות יאנוס (JAKs) לקדם התאהישרדות ו / או התפשטות. לעומת זאת, הביטוי של VEGFR-2 באורך מלא בסוג התא אותו, וגירוי עם ליגנד, אינו מקדם הישרדות התא ושגשוגם, המציין כי effectors איתות הפרוקסימלי של מסלול VEGFR-2 אינם זמינים סוג תא זה.

השתמשנו assay במגוון בהקשרים לחקור מחייב של הליגנדים VEGFR-2 הרומן 10,19,20,24-29. בשילוב עם assay VEGFR-3-EpoR-Ba / F3, השווינו את הפעילות היחסית של VEGF-C ו- גורמי גדילה VEGF-D לקשירה cross-linking VEGFR-2 ו VEGFR-3 30. את assay נעשה שימוש כדי לאפיין את פעילות המעכבת של נוגדנים מנטרלים חד-שבטיים כדי VEGFR-2 או VEGF-D, מלכודת VEGFR-2 מסיסים peptidomimetics מיקוד המשפחה VEGF 31. את assay שימש גם להראות את היכולת של VEGFs מן זני נגיף ORF שונים לקשור קשר צולב VEGFR-2 לפני הבדיקה בתאי האנדותל העיקרי 25 או כאשר פרוטוקולי הערכה לצמיחת טיהור גורמי 27.

את assay אנו מתארים הוא קל לביצוע, והגרסה וכמותיות מאפשרת לקביעות מהירה שלפעמים נדרשות כאשר הניטור בייצור או הטיהור של גורמי גדילה, נוגדנים או תחומי קולטן מסיסים לניסויים אחרים. קלות השימוש של assay עושות את זה אידיאלי המשלים עוד ועוד מחקרים מלאים הופיעו עם תאי אנדותל עיקריים נגזרו דם או כלי לימפה מרקמות ספציפיות או מערכות איברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מקור IL-3 ו הכנת אחד מעמיתי המחקר-3D ממוזג בינוני

הערה: תא לוקמיה granulocytic העכבר קו אחד מעמיתי המחקר-3D הוא תרבותי כדי ליצור בינוני מותנה המכיל IL-3.

  1. תרבות, אחד מעמיתי המחקר-3D ב בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS), 1% תוספת גלוטמין לכל החיים, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין. לחסן 5 × 10 6 תאים בשלב יומן של צמיחה לתוך 50 מ"ל של מדיום תרבות טרי בבקבוק תרבות T175 ס"מ 3 רקמות לגדול במשך כ -7 ימים או עד שהתאים עברו שלב יומן שלהם הצמיחה בכ 24 - 48 שעות (למנוע מוות של תאים מוגזם בתרבות). התקשורת אוויר הוא מסוגל להיות מאוחסן במשך שנים מרובות ב -20 ° C, ולכן אצוות של 200 - 500 מ"ל יכול להיות מיוצר בבת אחת.
  2. למזוג נוזל ותאי צלוחיות ספין ב 1000 x ז במשך 15 דקות כדי להסיר תאים ופסולת הסלולר. הסר את% 90 העליון של supernatant. סינון דרך יחידה מסננת 0.22 מיקרומטר.
  3. Aliquot בינוני מותנה, אחד מעמיתי המחקר-3D (CM) לתוך 1 מ"ל, 50 מ"ל ו -200 מ"ל כרכים לאחסון ב -20 ° C או -70 ° C. קטן aliquots שימושי להכנת assay, כרכי ביניים להכנת בינוני תרבות למעבר של שורות תאים תלויי גורם, ואת כמויות גדולות יותר עבור אחסון לטווח ארוך. IL-3 הם יציבים יחסית ב 4 ° C כך בינוני מופשר יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות אם נעשה שימוש בתנאים סטריליים.
  4. לחלופין, להשתמש בעכבר רקומביננטי IL-3 ברמות של 50 ng / ml מדולל לתוך מדיום התרבות, לאחר מסונן דרך יחידת 0.22 מיקרומטר הסינון.

תרבות 2. והערכה של VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 ובקרה Ba / F3 שורות תאים

  1. שליטה תרבות תאים Ba / F3 ב DMEM, 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין או פניצילין / תוספת סטרפטומיצין, 1% התייצב L- גלוטמין ו -10%, אחד מעמיתי המחקר-3D-CM. תאי מעבר בשעת 1:15 דילולים על כל שלושה ימים מתאיםגדל בשלב יומן.
  2. VEGFR2-EpoR-Ba / F3 תרבות התאים DMEM, 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​gentamycin, 1% התייצב L- גלוטמין ו -10%, אחד מעמיתי המחקר-3D-CM ו 1 מ"ג / מ"ל ​​G418. תאי המעבר בשעה 1:15 דילולים מתאי גדל בשלב יומן. ראה 24 לפרטים נוספים על בניית הביטוי של הקולטן chimeric.
  3. שליטה קציר Ba / F3 או VEGFR2-EpoR-Ba / תאים F3 מתרבויות יומן פאזיים באמצע. בעדינות פיפטה כדי להסיר תאים שאינם חסידים אלה מן החלק התחתון של הבקבוק. לשטוף שלוש פעמים מלוחות עכבר טוני שנאגר פוספט, 7.3 pH (PBS), (10 מיליליטר, צנטריפוגות ב g 750 x למשך 5 דקות כדי להתאושש תא גלול) להסיר המכיל בינוני IL-3.
  4. לשטוף את התאים פעם עם DMEM ותוספים, ללא אחד מעמיתי המחקר-3D-CM או IL-3 רקומביננטי, ולאחר מכן resuspend במדיום זה בריכוז של 7.4 × 10 4 תאים / מ"ל (כלומר, 1,000 תאים לכל 13.5 μl; 10,000 תאים לכל 135 μl כפי שנקבע על ידי ספירת באמצעות hemocytometer) עבורלהשתמש בגרסאות וכמותיות או כמותי של assay בהתאמה.
  5. להעריך תאים כדאיים על ידי ההרחקה הכחולה Trypan (זהירות). מערבבים כחול Trypan PBS (0.4%) 1: 1 עם אוכלוסיית תאים ולספור מינימום של 100 תאים על hemocytometer. תאים תופסים צבע נחשבים מתים או גוססים. הכדאיות של יותר מ 98% נדרש לבצע את assay.

3. Assay וכמותיות

  1. הוספת תאי שטף (1,000 תאים) כלולים 13.5 μl של מדיום IL-3 המחסר אל הבארות של צלחת microwell 72-גם ב RT. תשמרי על עצמך כדי לערבב את ההשעיה התא במהלך aliquotting כדי להבטיח שיקוע התא על ידי כוח הכבידה לא ריכוז התא הטיה. השתמש פיפטה אוטומטית P20 היטב מכויל, וטיפים autoclaved.
  2. להוסיף דוגמאות בדיקה ובקרות על בארות ב 10 נפח% (1.5 μl, מה שהופך נפח סופי של 15 μl המכיל 1,000 תאים לכל טוב) בעזרת פיפטה P20 מכויל או, עדיף, פיפטה P2. קח caמחדש על מנת להבטיח כי דגימות עולות בקנה אחד עם תנאי התרבות עבור תאי Ba / F3 מבחינת pH, מלח אחר עלול להיות ציטוטוקסיות / חומרי cytostatic. במידת האפשר, להשתמש במדיום תואם או חיץ (למשל, DMEM או PBS, בהתאמה) או לדלל במדיום או חיץ כזה. טחינה דקה עם אותו הקצה תבטיח ערבוב.
  3. לקבלת דוגמיות שליטה, כולל (i) בינוני לבד המכיל שום IL-3; (Ii), אחד מעמיתי המחקר-3BD-CM הוסיף עד בינוני לבד בווליום הסופי 10%; ו / או (iii) VEGF-A מדולל ל 100 ng / ml במדיום לבד, המכיל לא IL-3.
  4. מלאו כל בארות בשימוש של צלחת microwell עם מים סטריליים, PBS או בינוני ומניחים בצלחת בתוך מיכל humidified (עם מים ספוג ממחטת נייר) חילוף הגזים המאפשר. דגירה תאים בתוך מכולות באווירה humidified של 10% CO 2. assay זה ניתן להגדיר בנוחות 3 שעות על ידי אדם אחד אם דגימות בדיקת רכיבי תקשורת זמינות.
  5. להעריך צלחות בדרך כלל לאחר 16 שעות שלהדגירה שבה אפליה הזמן בין דגימות חיוביות ושליליות ניכר. ראה איור 3 עבור דוגמאות כיצד תאים להופיע בתרבות. לנתח צלחות באמצעות מיקרוסקופ-בניגוד שלב הפוך תקן 40 - 100 × הגדלה.
    הערה: ולס המכיל גורמי גדילה תומכים כגון IL-3 או-A VEGF יכיל תאים המופיעים עגול שקופה. וולס ללא גורמי גדילה תומכים או עם מדיום לבד צמצמיו מספרים של תאים עגולים, כמו גם תאים מתים או גוססים ופסולת הסלולר (למשל, איור 3 ג). הערכת assay ב הדגירה 24-48 שעות שלאחר הוא האופטימלי עבור רגישות.

4. מבדק כמוני

  1. הוספת תאים שטף (10,000 תאים 135 μl) ב IL-3-לקוי בינוני עד בארות צלחת microtiter תקן 96-גם ב RT. תשמור על עצמך כדי לערבב את השעית התא במהלך aliquotting כדי להבטיח שיקוע תא על ידי כוח הכבידה אינו משפיע ceריכוז ll.
  2. להוסיף דוגמאות בדיקה ובקרות על בארות ב 10 נפח% (15 μl) בעזרת פיפטה מכויל (P20). תשמור על מנת להבטיח כי דגימות עולות בקנה אחד עם תנאי התרבות עבור תאי Ba / F3 מבחינת pH, מלח או חומרים ציטוטוקסיים אפשרי אחרים / cytostatic. במידת האפשר, להשתמש במדיום תואם או חיץ (למשל., DMEM או PBS) או לדלל במדיום או חיץ כזה. סנן לעקר בנפחים קטנים באמצעות יחידת מסנן צינור צנטריפוגות אצטט תאית 0.22 מיקרומטר הנקבוביות.
  3. דגירה את התערובת של תאים, גורמי גדילה ו / או מעכב סוכנים באווירה humidified של 10% CO 2 למשך 48 שעות. בצע את assay בתוך מיכל humidified כי יש נייר טישו ספוג מים ומאפשר-חילוף גזים. בסיום תקופת הדגירה, להעריך את assay באמצעות אחת השיטות החלופיות המפורטות להלן שהם סמנים פונדקאיים של המספר הסלולרי קיימא הבאר.
  4. # 1 אלטרנטיבי: 3 H-thymidine התאגדות
    הערה: כימות זה מיועד בפורמט צלחת 96-היטב.
    1. לאחר דגירה של צלחות assay למשך 48 שעות ב 37 ° C (150 נפח μl לכל היטב), להוסיף 3 H-thymidine בהיקף של 50 μl של המדיום assay (בינוני תרבות Ba / F3 ללא IL-3 / אחד מעמיתי המחקר-3D CM) לכל טוב בריכוז של מ"ל 20 μCi /, מתן מינון סופי של 1 μCi לכל טוב.
    2. דגירת צלחות במשך שעה 4 נוספת על 37 מעלות צלזיוס לפני תאי הקצירה באמצעות מקצרת תא. חלץ דוגמאות בודדות על ידי צבת בפילטרים נוצץ ולכמת עם מונה נצנץ נוזלי.
  5. # 2 אלטרנטיבי: פליטת אור איתור של הסלולרית ATP
    הערה: גישה זו משתמשת מגיבה ניטור ATP אשר בשילוב עם lysate תא יכול ליצור אות פליטת אור המשקפת את תאי הקיימא באוכלוסייה.
    1. Lyse תאים לחלץ ATP ולהשתמש מגיב ניטור ATP כדי ליצוראות זורח פי הוראות היצרן. קרא הארה באמצעות luminometer תואם פורמט צלחת 96-היטב.
  6. # 3 אלטרנטיבי: הפחתת אנזימתי של צבע אינדיקטור על ידי תאי קיימא
    הערה: מבחנים מבוססים Resazurin להראות קורלציה טובה כדאי תא.
    1. שלב תאים בתרבית עם הצבע המבוסס resazurin ולכמת מבחנים באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי פי הוראות היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בחלק זה, אנו מציגים את התוצאות של ניסוי המדגימות את התכונות החיוניות של מבדק VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (ראה איור 1 עבור עקרונות של assay). מחקרים שפורסמו אחרים מדגימים יישומים רחבים של assay עבור הליגנדים VEGFR-2 חלופיים, מולקולות VEGF מוטציה ונוגדנים חד-שבטיים מעכבים 8,10,19,24-30.

הנתונים המוצגים כאן מייצגים assay שבו המבדק VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 משמש לכמת את הפעילות של שלושת הליגנדים אנושי רקומביננטי (VEGF-A 165, VEGF-C ו- VEGF-D) עם סגוליות עבור VEGFR -2 בנוכחות נוגדן חד שבטי מעכבות (bevacizumab) כדי VEGF-A נתונים 165. כבר מנורמל מול בתגובה VEGF-A 165 בלבד (איור 2). כצפוי, bevacizumab חסם את ההשפעה של VEGF-A 165 ב assay, אבל לא היתה כל השפעה על פעילות-C VEGF ו- D-VEGF.

בגרסת וכמותיות של assay או כאשר התבוננות assay במהלך פיתוחו, הצגת assay באמצעות מיקרוסקופ שלב הפוך רגיל יכול לספק מידע רב ערך על ההתקדמות של assay. מניתוח של assay (איור 3) מראה את הכדאיות הטובה של VEGFR-2-EpoR-Ba / תאי מבדק F3 כאשר מודגרות עם מדיום המכיל IL-3, או ליגנד עבור VEGFR-2, למשל, VEGF-A. תאים אלה הנם גדולים שקופים, ואין או עדות מינימאלית גרעינית בציטופלסמה הסלולר או פסולת תא בתרבות. בשנת הבאר ללא גורמי גדילה נוספים כיום קיימות ראיות של מספרים סלולריים מופחתים כמה תאים בריאים. תאים נוכחיים יש גרעיניויות משמעותיות הציטופלסמה שלהם פסולת תא היא תכונה עקבית של התרבות. לאחר 48 שעות ואין שום סימן של תאי קיימא.

FO: keep-together.within-page = "1"> איור 1

איור 1. תרשים סכמטי המתאר את העקרונות של VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 המבדק. (א) Ba / תאי F3 הם גורמים תלויים ודורשים גורם צמיחה אקסוגנית כגון IL-3 כדי לעורר צמיחת תאים / כדאיות באמצעות קולטנים IL-3 אנדוגני ואת מסלול איתות JAK. אם EpoR מתבטא הצלת תאים אלה יכולים להתרחש גם דרך מסלול JAK. ביטוי של טירוזין קינאז קולטן באורך מלא כגון VEGFR-2 תוצאות איתות מינימאלית כמטרות במורד זרם של הפעלת VEGFR-2 אינו עוסק מסלול JAK. קולט כימרי עם האזור התאי של VEGFR-2 התמזג אזורי הטרנסממברני cytoplasmic של EpoR, כאשר transfected לתאי Ba / F3 ו מגורה עם ליגנדים ספציפיים VEGFR-2, הוא מסוגל הפעלת מסלול JAK ונהיגת תאהישרדות ושגשוגם. (ב) VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים F3 להביע רמות משמעותיות של הקולטן VEGFR-2-EpoR כימרי אשר ניתן לכמת באמצעות cytometry הזרימה. לאחר דהוי של IL-3 בינוני המכיל, תאים מוקם במגוון תנאי תרבות אשר כונן או הישרדות / תרבות תאים. תאים Ba / F3 untransfected או VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים F3 ללא גורמי גדילה ספציפיים מצליחים לגדול / לשרוד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2

איור 2. הערכת VEGFR-2 הליגנדים ב הכימרה VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 המבדק. IL-3-תלויים תאים Ba / F3 לבטא עכבר VEGFR-2-EpoR היו זורעים במדיום ללא IL-3 (למעט לתת + IL-3, כפי שצוין) בתוספת האדם VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (זו היא צורה של-C VEGF אשר מורכב באזור המרכז כולל את propeptides N ו- C-terminal), או VEGF-DΔNΔC (זו היא צורה של-D VEGF הכולל באזור המרכז כולל את propeptides N ו- C-terminal (VD)) ב -100 bevacizumab נוגדן חד-שבטי נטרול ng / ml ו אנושי (אשר נקשר ומעכב-A VEGF, אבל לא VEGF-C או VEGF-D), או לשלוט ללא נטרול trastuzumab נוגדן, כמצוין על 0.75 מיקרומטר. NF = בינוני המכיל אין גורמי גדילה נוספים. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, מספר תאים ביחס חיים היה לכמת באמצעות זיהוי פליטת אור של ATP הסלולר. קווים אנכיים מייצגים אמצעי (מנורמל מול בתגובת VEGF-A 165 לבד, הבר ראשון) ואת סטיית התקן של הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים. נא ללחוץ כאן נiew גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3

איור 3. VEGFR-2-EpoR-Ba / תאי F3 תלויים בגורמים חיצוניים צמיחה עבור הישרדות. דוגמאות VEGFR-2-EpoR-Ba / מבדק F3 שבו IL-3-תלוי Ba / F3 תאי מבטאי עכבר VEGFR- הכימרה 2-EpoR היו זורעים במדיום (א) המכיל 10%, אחד מעמיתי המחקר-3D מותנה בינוני המספק IL-3, (ב) 100 ng / VEGF-A האדם מ"ל 165 (לא IL-3), או (C) בינוני עם אין IL-3 או גורמי גדילה נוספים. תרבות מתוארת 24 שעות לתוך assay מראות תאי קיימא מאוד בנוכחות של IL-3 (א) או VEGF-A 165 (ב), ואילו בתרבות ללא IL-3 או גורמי גדילה נוספים (C) תא מוות אָדוֹםכדאיות uced ניכרת היטב. ברי סולמות הם 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Assay המתואר כאן מסתמך על שימוש בתאים של כדאיויות גבוהות, אשר תלויים בגורמי צמיחה. תאים ולכן צריכים להיות מתורבת בקפידה כדי לוודא שהם גורמים תלויים, ולשמר ביטוי של הקולטן chimeric. הבטיח כי המדיום הוא עשה טרי ולא מאוחסן לתקופת זמן ממושכת מדי וכי אחד מעמיתי המחקר-3D CM הוא מאוד פעיל חשוב. תאים צריכים לשטוף ביסודיות מ- IL-3 בינוני המכיל לתוך מדיום assay כדי לוודא ששום שיורית IL-3 ומזהמים את assay כאשר חושפים את תאי הליגנדים ההצלה. כפי הליגנדים יכול לבוא במספר צורות שונות, טיפול צריך לקחת בעת הכנת אלה עבור assaying. משמרים, חומרים אנטי-בקטריאליים, מלח או מאגרים של pH שונים יכולים להשפיע על assay, וזו הסיבה בדיקות מקבילות של תאים Ba / F3 untransfected יכול להודיע ​​על בעיות הקשורות חיץ.

אנו משתמשים בשני הפרוטוקולים וכמותיות וכמותית. החצי-quantitatiassay ve מאפשר הערכה מהירה של הפעילות של דגימות לפני שאתחייב assay כמוני לחלוטין אשר דורש יותר זמן מדגם. שיטת הכמותית משמשת אך ורק בעת יצירת נתונים לפרסום. השיטות החלופיות לאיתור את הכדאיות של התרבות הם פשוט יחסית. את assay כמותי הותאם מספר פורמטים שונים עבור כימות של התפשטות, השתמשנו (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-Diphenyltetrazolium ברומיד) MTT 30, זיהוי פליטת אור של ATP הסלולר (לא פורסם), לצבוע מבוססי resazurin (איור 2) ו -3 H-thymidine 31 עם הצלחה. בשנים האחרונות אנו התפתחנו מן שימוש קרינה להתאים גישות פליטת אור ו נצלנו את צבען מבוסס resazurin בשל העלות-התועלת שלו. כל אחת מהגישות לתת תוצאות מתאימות והבחירה יכולה להיות תלויה בזמינות של ריאגנטים אssociated קוראי צלחת מיוחדים במעבדה / מכון או היכרות נתונות עם גישות מסוימות.

פתרון בעיות סובבת סביב הפעילות של שלושת המרכיבים העיקריים של assay, i) IL-3 CM, ii) VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים F3 ו- III) הליגנדים מגרה. רמות ירודות של IL-3 ב CM עקב תאים, אחד מעמיתי המחקר 3D לקויים בתרבות הראשונית, תנאי אחסון עניים, מחזורי הפשרת ההקפאה מוגזמים או באמצעות בשעה גבוהה מדי דילול יכול ליצור תרבויות גדלות גרוע שתקשינה על assay. זה בדרך כלל מזוהה בבארות שליטת אוכלוסיות תאים גדלו לאט, לאבד המראה הבהיר הנורמלי שלהם. VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים assay F3 יכול להפסיד ביטוי פני התא של לבנות כימרי לאורך זמן אם כל הזמן בתרבות לתקופות ממושכות. שמירת מספרים טובים של מניות חנקן נוזליות מאפשרת תרבויות טריות של תאים מאוד המבטאות את הקולטן כימרי להיות זמינות בכל העת. אם נדרש אוכלוסייה להביע גבוהה יכולה להיותמושגת על ידי גידול התאים הליגנדים VEGFR-2 ובחירת האוכלוסייה להביע רמות גבוהות של הקולטן chimeric על ידי זרימת cytometry מיון. תאים אלה יורחבו עוד בתרבות להקפאה.

בעוד הטכניקה היא אלטרנטיבה נוחה ופשוט יותר לניתוח אינטראקציות עם תחום תאי VEGFR-2 זה לא ניתן לראות להחליף ניסויים מתוחכמים יותר שבו קולטן דובר על תאי האנדותל העיקרי הוא נחקר בנוכחות VEGFRs אחרים, שיתוף קולטנים כגון neuropilins. התאים שעליו assay זה מבוסס (תאי B) נבדלים מתאי אנדותל ועל כן לא ניתן להשתמש כדי ללמוד את מסלולי איתות ציטופלסמית וגורמים שעתוק המגיבים ההפעלה VEGFR-2 בתאי האנדותל. אף על פי כן, השיטה מספקת גישה יעילה לנתח אינטראקציה ליגנד לרצפטור שנמצאת בין assay מחייב פשוט הבוחנת אינטראקציה של ליגנד עם רג'פ נייחטור לבן (כגון אזור המסיס קולטן תאי או אזור תאיים קולטן התמזג אימונוגלובולינים), ועל הניתוח של קולטן מחייב ואפקטים במורד לראות מחייב מבחנים לתאי אנדותל עיקריים. הוא מספק מערכת לאפשר מחייב cross-linking של קולטנים, שני השלבים הראשונים שבאמצעותו רבים טירוזין קינאז קולטן מסוג נפוץ ליזום מפל הולכת אותות שלהם. ותחולתו במשפט מספר ההגדרות אקדמיות ומסחריות הוכיחה מקובל כמו assay שימושי לבחינת מאפיינים חייב, במיוחד כאשר אנו מעריכים הליגנדים גרסה או מעכבים של אינטראקצית קולטן ליגנד.

Assay הוא גם שימושי עבור ניתוח של מעכבים חדשים של תחום תאי קולטן או של הליגנדים שלה. את assay יכול לשמש עוד במהירות המסך וריאנטים של הליגנדים או אזורים תאיים קולטן לראות בהקשר של מוטציות גנומי (הן בירושה סומטיים) נמצא האדם geנוס במחלות כגון סרטן 32,33 לקבוע התוצאה התפקודית שלהם. לפיכך היישומים של assay VEGFR-2 זה, צפויים להתרחב בעתיד. יתר על כן, הגישה הכללית שבבסיס assay זה יכול להיות מנוצל באופן נרחב יותר עבור טירוזין קינאז קולטן תא השטח, המהווים משפחה גדולה וחשובה של מולקולות איתות בבריאות ובחולי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

סטיבן א Stacker ומארק מ achen הם בעלי המניות היממה טכנולוגיות בע"מ, חברה לפיתוח תרופות על ידי מיקוד המשפחה VEGF של גורמי גדילה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 109 קולטן VEGF ליגנד מעכב איתות קולטנים מסיסים גורם גדילה חלבון המבדק נוגדן חד-שבטי
מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stacker, S. A., Halford, M. M.,… More

Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter