Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En enkel Bioassay for Evaluering av vaskulær endotelial vekstfaktorer

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

Vi beskriver en enkel cellebasert bioanalyse for å påvise, kvantifisere og overvåking av aktiviteten av medlemmer av vaskulær endotelial vekstfaktor familie av ligander. Analysen anvender kimære reseptorer uttrykt i en faktoravhengig cellelinje for å gi en semi-kvantitativ eller kvantitativ vurdering av reseptor-binding og tverrbinding av liganden.

Abstract

Analysen av reseptor-tyrosin-kinaser og deres samvirkende ligander involvert i vaskulære biologi er ofte vanskelig på grunn av den konstitutive ekspresjon av familier av beslektede reseptorer, et bredt spekter av beslektede ligander og vanskeligheten med å håndtere primære kulturer av spesialiserte endotelceller. Her beskriver vi et bioassay for påvisning av ligander til vaskulær endotel vekstfaktor-reseptor-2 (VEGFR-2), en nøkkel transduser av signaler som fremmer angiogenese og lymphangiogenesis. Et cDNA som koder for en fusjon av det ekstracellulære (ligand-binding) region av VEGFR-2 med de transmembrane og cytoplasmatiske regioner av erytropoietinreseptoren (Epor) er uttrykt i faktor-avhengige cellelinje Ba / F3. Denne cellelinje vokser i nærvær av interleukin-3 (IL-3) og tilbaketrekking av denne faktoren resulterer i død av celler i løpet av 24 timer. Uttrykk av VEGFR-2 / Epor reseptoren fusjon gir en alternativ mekanisme for å fremme overlevelse og Potentiaslly spredning av stabilt transfekterte Ba / F3-celler i nærvær av en ligand som er i stand til binding og tverrbinding av den ekstracellulære del av fusjonsproteinet (dvs., en som kan kryssbinde VEGFR-2 ekstracellulære region). Analysen kan utføres på to måter: en semi-kvantitativ metode hvori små volumer av ligand og celler som tillater en hurtig resultat i 24 hr, og en kvantitativ tilnærming involverer surrogatmarkører for et levedyktig celleantall. Analysen er forholdsvis lett å utføre, er meget mottakelig for kjente VEGFR-2-ligander og rommer ekstracellulære inhibitorer av VEGFR-2-signalering, for eksempel monoklonale antistoffer mot reseptoren eller ligander, og løselige ligand feller.

Introduction

Den vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) familie av utskilte proteiner vekstfaktorer og deres beslektede celleoverflatereseptorer er en viktig og mangfoldig gruppe av løselige ligander og membranreseptorer innebygd, henholdsvis som funksjon på overførende signaler på tvers av cellemembraner. De fungerer hovedsakelig i endotelceller, men også på celler av epitelial opprinnelse og de ​​av immunsystemet 1,2. Signalveier som er engasjert av ligand-aktiverte VEGF reseptorer (VEGFRs) er kritisk i store patologi, som aldersrelatert makuladegenerasjon og kreft, og therapeutics rettet mot dem er i hyppig klinisk bruk (f.eks monoklonalt antistoff bevacizumab som er rettet mot VEGF-A) 3,4.

En av kompleksiteten av VEGF familien er mangfoldet av løselige ligander tilstede i naturen (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF proteiner kodet av parapox virus familien orf og slangegift VEGF, pluss andre hemmendeisoformer av VEGF-A) 2.

Disse ligander interagere med tre medlemmer av reseptor-tyrosin-kinase-familien, nemlig VEGFR-1, VEGFR-2 og VEGFR-3. Disse reseptorer er variabelt uttrykt på forskjellige celletyper, men som ofte er ko-uttrykt på overflaten til endoteliale cellene som kler blod og lymfekar av alle størrelser 5. VEGFR-2 kan binde pattedyr ligander VEGF-A 6, VEGF-C 7 og VEGF-D 8,9 samt orf virus VEGF 10 og slangegift VEGF 11. VEGFR-2 spiller en stor rolle i å drive angiogenese (vekst av nye blodkar fra eksisterende fartøy) i fosterutviklingen, sårheling, kreft og øyesykdommer. I disse sammenhenger, ligander så som VEGF-A, -C og -D binder og aktiverer reseptoren på blod vaskulære endotelceller 12-15. På lymfatiske endotelceller, spiller VEGFR-2-en rolle i lymphangiogenesis, dannelsen av nye lymfekar 16. VEGFR-2 kan også fremme utvidelse og utbygging av store arterier og lymfekar i friskt vev og sykdom 17. En fullstendig forståelse av VEGFR-2: ligand interaksjoner er derfor viktig for utvikling av inhibitorer for anvendelse ved behandling av angiogenese-avhengige sykdommer 18. Mens de fleste isoformer av VEGF-A binder til VEGFR-2, proteolytisk spalting av VEGF-C og VEGF-D nødvendig for å frigjøre et fragment som består av VEGF-homologi domene som oppviser høy affinitetsbinding til VEGFR-2 19,20.

Vi har utviklet en bioassay å overvåke ligander av VEGFR-2 som er designet for å omgå behovet for primære endotelceller, som er teknisk vanskelig å passasje, dyrt å kjøpe og kultur (som krever spesialisert medium) 21 og uttrykke flere VEGFRs og tilhørende co- reseptorer 22. Heterodimerisering av VEGFR-2 med andre VEGF reseptorer eller co-reseptorer kan føre til uønsket kompleksitet når som mål å study binære reseptor-ligand interaksjoner, evaluere aktivitet som kan tilskrives en spesifikk reseptor, eller vurdere effekten av inhiberende reagenser. 23. Bioanalysen beholder mobiliteten av det relevante reseptorer i cellemembranen og tillater evaluering av en ligand evne til å binde og tverrbinde VEGFR-2 ekstracellulære region.

Bioanalysen er avhengig av etablering av en kimær reseptor i hvilken det ekstracellulære område av en VEGF-reseptor (i dette tilfellet VEGFR-2) er fusjonert til det transmembrane og intracellulære områdene av erytropoietinreseptoren (Epor), et medlem av cytokin-reseptor-familien 8,24. Dette fusjonsprotein blir deretter uttrykt i faktor-avhengige pro-B cellelinje Ba / F3, hvorpå stimulering med en ligand som er i stand til binding og tverrbinding av det ekstracellulære domene av reseptoren fører til aktivering av det cytoplasmatiske effektor-regionen, som er i stand av transducing en overlevelsessignal via Janus kinaser (Jaks) for å fremme celleoverlevelse og / eller spredning. I motsetning til ekspresjon av full-lengde VEGFR-2 i den samme celletype, og stimulering med ligand, ikke fremmer celleoverlevelse og proliferasjon, noe som indikerer at de proksimale signal effektorer av VEGFR-2 veien ikke er tilgjengelig i denne celletype.

Vi har brukt til analysen i en rekke sammenhenger for å utforske binding av nye VEGFR-2 ligander 10,19,20,24-29. I kombinasjon med en VEGFR-3-Epor-Ba / F3 analysen har vi sammenliknet de relative aktiviteter av VEGF-C og VEGF-D vekstfaktorer for binding og kryssbinding VEGFR-2 og VEGFR-3 30. Analysen har blitt brukt for å karakterisere den hemmende aktiviteten av nøytraliserende monoklonale antistoffer til VEGFR-2 eller VEGF-D, oppløselige VEGFR-2-felle og peptidomimetika som målrettes mot VEGF-familien 31. Analysen ble også benyttet for å vise evnen til VEGFs fra forskjellige orf virusstammer til å binde og tverrbinde VEGFR-2 før testing i primære endotelceller 25 eller ved vurderingen av protokoller for rensing av vekstfaktorer 27.

Analysen vi beskriver er lett å utføre, og den semi-kvantitative versjon muliggjør rask bestemmelse som noen ganger er nødvendig når overvåking av produksjon eller rensing av vekstfaktorer, antistoffer eller løselige reseptor domener for andre eksperimenter. Brukervennligheten av analysen gjør det til et ideelt supplement til videre og mer komplette studier utført med primære endotelceller avledet fra blod eller lymfekar fra bestemte vev eller organsystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kilde av IL-3 og klargjøring av WEHI-3D-condition Medium

Merk: mus granulocytisk leukemi-cellelinje WEHI-3D ​​er dyrket for å generere et kondisjonert medium som inneholder IL-3.

  1. Kultur WEHI-3D ​​i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% lang-levetid glutamin supplement, 50 ug / ml gentamicin. Inokulere 5 x 10 6-celler i log-fase vekst i 50 ml friskt kulturmedium i en T175 cm 3 vevskulturkolbe og vokse i ca. 7 dager, eller inntil cellene har passert sin log vekstfase ved ca. 24 - 48 timer (unngå overdreven celledød i kultur). Kondisjonert media er i stand til å bli lagret for flere år ved -20 ° C, så satser av 200 - 500 ml kan fremstilles på en gang.
  2. Dekanter væsken og celler fra kolber og sentrifugering ved 1000 x g i 15 minutter for å fjerne celler og celleavfall. Fjern det øverste 90% av supernatant. Filtrer gjennom et 0,22 um filter enhet.
  3. Delmengde WEHI-3D ​​kondisjonert medium (CM) i 1 ml, 50 ml og 200 ml volumer for lagring ved -20 ° C eller -70 ° C. Mindre alikvoter er anvendbare for analyse fremstilling, mellomliggende volum for fremstilling av kulturmediet for passasje av faktoravhengige cellelinjer, og større volumer for langtidslagring. IL-3 er forholdsvis stabilt ved 4 ° C så opptint medium kan lagres i noen få uker hvis de brukes under sterile betingelser.
  4. Alternativt kan bruke rekombinant muse-IL-3 ved nivåer på 50 ng / ml fortynnet i kulturmedium, etter å ha blitt filtrert gjennom et 0,22 um filter enhet.

2. Kultur og evaluering av VEGFR-2-Epor-Ba / F3 og kontroll Ba / F3 cellelinjer

  1. Kultur kontroll Ba / F3-celler i DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml gentamicin eller penicillin / streptomycin supplement, en stabilisert% L-glutamin og 10% WEHI-3D-CM. Passage cellene ved 1:15 fortynninger ca hver tredje dag fra cellervokser i log fase.
  2. Kultur VEGFR2-Epor-Ba / F3-celler i DMEM, 10% FBS, 50 ug / ml gentamycin, 1% stabilisert L-glutamin og 10% WEHI-3D-CM og 1 mg / ml G418. Passage cellene ved 1:15 fortynninger fra celler som vokser i log fase. Se 24 for mer informasjon om konstruksjon og uttrykk for kimære reseptor.
  3. Høstings Ba / F3 eller VEGFR2-Epor-Ba / F3-celler fra midten av log-fase kulturer. Forsiktig pipette for å fjerne disse ikke-heftende celler fra bunnen av kolben. Vask tre ganger i mus tonisitet fosfatbufret saltvann, pH 7,3 (PBS), (10 ml, sentrifuger ved 750 x g i 5 minutter for å gjenvinne cellepelleten) for å fjerne medium inneholdende IL-3.
  4. Vask cellene en gang med DMEM og tilsetningsstoffer, uten WEHI-3D-CM eller rekombinant IL-3, og deretter resuspender i dette medium ved en konsentrasjon på 7,4 x 10 4 celler / ml (dvs. 1,000 celler pr 13,5 mL; 10 000 celler per 135 mikroliter, som bestemmes ved å telle ved hjelp av en hemocytometer) forbruk i semi-kvantitative eller kvantitative versjoner av analysen respektivt.
  5. Vurdere celler for levedyktighet med trypanblått eksklusjon (OBS). Bland trypanblått i PBS (0,4%) 1: 1 med den cellepopulasjon og telle et minimum av 100 celler på et hemocytometer. Celler som tar opp fargestoffet blir betraktet som døde eller døende. Levedyktigheten til mer enn 98% er nødvendig for å utføre analysen.

3. Semi-kvantitativ analyse

  1. Legg vaskede celler (1000 celler) inneholdt i 13,5 mL av IL-3-manglende medium til brønnene i en 72-brønns mikrobrønnplate ved RT. Vær nøye med å blande cellesuspensjonen under aliquotting å sikre celle bosetting av tyngdekraften ikke skjevhet cellekonsentrasjonen. Bruk en godt kalibrert P20 automatisert pipette, og autoklaveres tips.
  2. Legge til testprøver og kontroller til brønnene ved 10% volum (1,5 ul, slik at et endelig volum på 15 ul inneholdende 1,000 celler pr brønn) ved hjelp av en kalibrert P20 pipette eller fortrinnsvis P2 pipette. ta care for å sikre at prøvene er forenlige med dyrkningsforhold for Ba / F3-celler når det gjelder pH, salt og andre potensielt cytotoksiske / cytostatisk stoffer. Der det er mulig, bruker du en kompatibel medium eller buffer (f.eks DMEM eller PBS, henholdsvis) eller fortynne i et slikt medium eller buffer. Utgnidning med den samme spissen vil sikre blanding.
  3. For kontrollprøver, omfatter (i) Medium alene holdige no IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM lagt til medium alene på 10% sluttvolum; og / eller (iii) VEGF-A fortynnet til 100 ng / ml i medium alene, som ikke inneholder noe IL-3.
  4. Fyll ubrukte brønnene på mikroplaten med sterilt vann, PBS eller medium og plasser platen i en fuktet container (med vann gjennomvåt silkepapir) slik at gassutveksling. Inkuber cellene i beholderne i en fuktig atmosfære av 10% CO2. Denne analysen kan komfortabelt satt opp i tre timer etter en person hvis testprøver og medie komponenter er tilgjengelige.
  5. Vurdere plater vanligvis etter 16 timer avinkubering ved hvilket tidspunkt å skjelne mellom positive og negative prøver er tydelig. Se figur 3 for eksempler på hvordan celler vises i kultur. Analyser plater ved hjelp av en standard omvendt fase-kontrast mikroskop på 40-100 × forstørrelse.
    Merk: Brønner inneholdende støttende vekstfaktorer så som IL-3 eller VEGF-A vil inneholde celler som synes rund og gjennomskinnelig. Brønner uten støttende vekstfaktorer eller med medium alene vil ha redusert antall av runde celler, så vel som døde eller døende celler og cellerester (for eksempel figur 3C). Vurdering av undersøkelsesresultatet ved 24-48 timer etter inkubering er den optimale for følsomhet.

4. Kvantitativ Bioassay

  1. Legg vaskede celler (10000 celler i 135 ul) i IL-3-manglende medium til brønnene i en standard 96-brønners mikrotiterplate ved RT. Vær nøye med å blande cellesuspensjonen under aliquotting å sikre celle bosetting av tyngdekraften påvirker ikke cell konsentrasjon.
  2. Legg testprøver og kontroller til brønnene på 10% volum (15 mikroliter) med en kalibrert pipette (P20). Pass på å sikre at prøvene er kompatibel med dyrkningsforhold for Ba / F3-celler i form av pH, salt eller andre potensielt cytotoksiske / cytostatisk stoffer. Der det er mulig, bruker du en kompatibel medium eller buffer (f.eks., DMEM eller PBS) eller fortynnet i et slikt medium eller buffer. Filter sterilisere små volumer ved hjelp av en 0,22 mikrometer pore celluloseacetat sentrifugerør filterenhet.
  3. Inkuber blandingen av celler, vekstfaktorer og / eller inhibitor midler i en fuktig atmosfære med 10% CO2 i 48 timer. Utfør analysen innen en fuktet container som har vann-gjennomvåt silkepapir og lar gassutveksling. Ved fullførelsen av inkubasjonsperioden, evaluere analyse ved bruk av en av de alternative fremgangsmåter som er oppført nedenfor som er surrogatmarkører for den levedyktige celletallet i brønnen.
  4. Alternativ 1: 3 H-thymidine innlemmelse
    Merk: Denne kvantifisering er beregnet på 96-brønners plateformat.
    1. Etter inkubasjon av analyseplater i 48 timer ved 37 ° C (150 ul volum per brønn), tilsett 3H-tymidin i et volum på 50 ul analysemedium (Ba / F3 kulturmedium uten IL-3 / WEHI-3D ​​CM) per brønn i en konsentrasjon på 20 pCi / ml, noe som gir en endelig dose på 1 uCi pr brønn.
    2. Inkuber platene i ytterligere 4 timer ved 37 ° C før innhøsting celler ved hjelp av en cellehøster. Ekstraher individuelle prøver ved å plassere filtrene på scintillant og kvantifisere med en væskescintillasjonsteller.
  5. Alternativ 2: Bioluminesens Påvisning av Cellular ATP
    Merk: Denne fremgangsmåten bruker en ATP overvåkning reagens som når den kombineres med cellelysat kan generere et biolumine-signal som gjenspeiler de levedyktige celler i populasjonen.
    1. Lyses celler til å trekke ATP og bruke en ATP Monitoring Reagens å generere enlysende signal i henhold til produsentens instruksjoner. Les luminescens ved hjelp av et luminometer er kompatibel med et 96-brønners plateformat.
  6. Alternativ # 3: Enzymatisk Reduksjon av en indikator Dye av levende celler
    Merk: Resazurin baserte analyser viser god korrelasjon til celle levedyktighet.
    1. Kombiner dyrkede celler med resazurin basert fargestoff og kvantifisere analyser ved hjelp av en fluorescens plateleser i henhold til produsentens instruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette avsnittet viser vi resultatene av et eksperiment som viser de grunnleggende funksjonene i en VEGFR-2-Epor-Ba / F3 bioassay (se figur 1 for prinsippene i analysen). Andre publiserte studier viser bredere anvendelser av analysen for alternative VEGFR-2 ligander, mutante molekyler og VEGF-hemmende monoklonale antistoffer 8,10,19,24-30.

Dataene presentert her, er en analyse hvor det VEGFR-2-Epor-Ba / F3-bioanalyse blir brukt til å kvantifisere aktiviteten av de tre rekombinante humane ligander (VEGF-A 165, VEGF-C og VEGF-D) med spesifisitet for VEGFR -2, i nærvær av en hemmende monoklonalt antistoff (bevacizumab) til VEGF-A 165. data er normalisert i forhold til respons på VEGF-A 165 alene (figur 2). Som forventet, bevacizumab blokkerte virkningen av VEGF-A 165 i analysen, menhadde ingen effekt på aktiviteten av VEGF-C og VEGF-D.

I semikvantitativ versjon av analysen eller ved iakttagelse av analysen i løpet av sin utvikling, viser analyse ved bruk av en standard invertert fasemikroskop kan gi verdifull informasjon om fremdriften av analysen. En analyse av en analyse (Figur 3) viser god levedyktighet av VEGFR-2-Epor-Ba / F3-celler bioassay når inkubert med medium inneholdende IL-3, eller ligand for VEGFR-2, for eksempel VEGF-A. Disse cellene er store og gjennomsiktig, og det er ingen eller minimal bevis for granularitet i det cellulære cytoplasma eller celleavfall i kulturen. I brønnen uten ekstra vekstfaktorer Det er allerede bevis for redusert celletall og noen sunne celler. Celler tilstede har betydelig granularitet i sitt cytoplasma og celleavfall er et gjennomgående trekk av kulturen. Etter 48 timer er det ingen tegn til levende celler.


Figur 1. Skjematisk diagram som beskriver prinsippene for VEGFR-2-Epor-Ba / F3 Bioassay. (A) Ba / F3-celler er faktor-avhengige og krever en eksogen vekstfaktor så som IL-3 for å stimulere cellevekst / levedyktighet via endogene IL-3-reseptorer og JAK signalveien. Hvis Epor er uttrykt i disse cellene redning kan også skje via JAK veien. Uttrykk for en full-lengde reseptortyrosinkinasehemming som VEGFR-2 gir minimal signal som nedstrøms mål for VEGFR-2 aktiverings ikke engasjere JAK veien. Et kimær-reseptor med den ekstracellulære region av VEGFR-2 fusjonert til de transmembrane og cytoplasmatiske regioner av Epor, når transfektert inn i Ba / F3-celler og stimulert med spesifikke VEGFR-2 ligander, er i stand til å aktivere JAK reaksjonsveien og å drive cellenoverlevelse og spredning. (B) VEGFR-2-Epor-Ba / F3-celler uttrykker signifikante nivåer av det kimære VEGFR-2-Epor reseptor som kan kvantifiseres ved hjelp av flow cytometri. Når det er vasket ut av IL-3-inneholdende medium, blir cellene plassert i en rekke med dyrkningsforhold som driver enten overlevelse / proliferering av celler. Utransfekterte Ba / F3-celler eller VEGFR-2-Epor-Ba / F3-celler uten spesifikke vekstfaktorer klarer å vokse / overleve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2

Figur 2. Evaluering av VEGFR-2-ligander ved VEGFR-2-Epor-Ba / F3-bioassay. IL-3-avhengige Ba / F3-celler som uttrykker en mus VEGFR-2-Epor kimær ble sådd ut i medium uten IL-3 (bortsett tili + IL-3-undergruppe, som indikert) pluss humant VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (dette er en form for VEGF-C som består av det sentrale område og utelukker de N- og C-terminale propeptider), eller VEGF-DΔNΔC (dette er en form for VEGF-D som omfatter det sentrale område og utelukker de N- og C-terminale propeptider (VD)) ved 100 ng / ml og humanisert nøytraliserende monoklonalt antistoff bevacizumab (som binder og hemmer VEGF-A, men ikke VEGF-C eller VEGF-D), eller kontroll ikke-nøytraliserende antistoff trastuzumab, som indikert ved 0,75 pM. NF = medium som ikke inneholder noen ekstra vekstfaktorer. Førti-åtte timer senere ble relativ levende celle nummer kvantifisert ved hjelp av bioluminesens deteksjon av mobilnettet ATP. Vertikale linjene representerer midler (normalisert versus respons på VEGF-A 165 alene, første bar) og standardfeil for gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å vIEW en større versjon av dette tallet.

Figur 3

Figur 3. VEGFR-2-Epor-Ba / F3-celler er avhengig av eksterne vekstfaktorer for å overleve. Eksempler på VEGFR-2-Epor-Ba / F3 bioassay som IL-3-avhengige Ba / F3-celler som uttrykker en mus VEGFR- 2-Epor kimær ble sådd ut i medium (A) inneholdende 10% WEHI-3D-kondisjonert medium som inneholder IL-3, (B) 100 ng / ml humant VEGF-A 165 (uten IL-3), eller (C) medium med no IL-3 eller flere vekstfaktorer. Kultur er vist 24 timer inn i forsøket viser sterkt levedyktige celler i nærvær av IL-3 (A) eller VEGF-A 165 (B), mens det i kulturen uten IL-3 eller flere vekstfaktorer (C) celledød og røduced levedyktighet er helt tydelig. Scales barer er 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analysen som beskrives her er avhengig av anvendelse av celler med høy levedyktighet, som er avhengige av vekstfaktorer. Celler må derfor være nøye dyrkes for å sikre at de er faktor-avhengige, og beholde uttrykk for kimære reseptor. Sikre at mediet er rykende fersk og ikke lagres over en svært lang periode, og at WEHI-3D ​​CM er svært aktiv er viktig. Cellene må være grundig vasket fra IL-3-inneholdende medium inn i analysemedium for å sikre at ingen rester av IL-3 forurenser analysen ved å eksponere cellene til redning ligander. Som ligander som kan komme i en rekke ulike former, må tas når forbereder disse for analysering pleie. Konserveringsmidler, anti-bakterielle midler, salt eller buffere med forskjellig pH kan påvirke analysen, og dette er grunnen til parallell testing av utransfekterte Ba / F3-celler kan opplyse om bufferrelaterte spørsmål.

Vi bruker både semi-kvantitative og kvantitative protokoller. Den semi-kvantitativtve analysen muliggjør rask vurdering av aktiviteten av prøvene før binde seg til en fullstendig kvantitativ analyse som krever mer tid og prøven. Den kvantitative metoden brukes utelukkende ved generering av data for publisering. Den alternative metoder for påvisning av levedyktigheten til kulturen er relativt enkelt. Den kvantitative analysen er tilpasset til et antall forskjellige formater for kvantifisering av proliferasjon, og vi har brukt (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) MTT-30, bioluminescens påvisning av cellulære ATP (upublisert), resazurin basert fargestoff (figur 2) og 3H-tymidin 31 med suksess. I de senere år har vi utviklet seg bort fra bruken av stråling for å tilpasse Bioluminescens fremgangsmåter, og har brukt den resazurin basert fargestoff på grunn av sin kostnadseffektivitet. Alle de fremgangsmåter gir tilfredsstillende resultater, og valget kan avhenge av tilgjengeligheten av reagenser og enssociated spesialiserte plate lesere i et gitt laboratorium / institutt eller kjennskap til spesielle tilnærminger.

Problemløsning dreier seg om aktiviteten av tre hoveddelene i analysen, i) IL-3-CM, ii) VEGFR-2-Epor-Ba / F3-celler og iii) stimulerende ligander. Dårlige nivåer av IL-3 i CM skyldes utilstrekkelig WEHI 3D-celler i den opprinnelige kulturen, dårlige lagringsforhold, overdreven fryse-tine sykluser eller hjelp ved for høy fortynning kan skape dårlig voksende kulturer som vil hemme analysen. Dette er vanligvis påvises i kontrollbrønner som celle populasjoner vokser sakte, å miste sin normale lyse og runde utseende. Den VEGFR-2-Epor-Ba / F3 analysen celler kan miste celleoverflate-ekspresjon av den kimære konstruksjon over tid hvis de holdes i kultur i lengre perioder. Opprettholde gode mengder flytende nitrogen lager tillater friske kulturer av celler som sterkt uttrykker det kimære reseptor for å være tilgjengelig til enhver tid. Om nødvendig en høy uttrykke befolkning kan væreoppnås ved å dyrke celler i VEGFR-2-ligander og valg av befolkningen som uttrykker høye nivåer av det kimære reseptor ved flowcytometri sortering. Disse cellene blir deretter ytterligere utvidet i kultur for frysing.

Selv om teknikken er en praktisk og forenklet alternativ for å analysere interaksjoner med VEGFR-2 ekstracellulære domene det ikke kan ses å erstatte mer sofistikerte forsøk hvor den native reseptoren på primære endotelceller blir probet i nærvær av andre VEGFRs, co-reseptorer så som neuropilins. Cellene som på denne analysen er basert på (B-celler) er forskjellig fra endotelceller, og bør derfor ikke brukes til å studere de cytoplasmiske signalveier og transkripsjonsfaktorer som svarer til VEGFR-2-aktivering i endotelceller. Ikke desto mindre tilveiebringer fremgangsmåten en nyttig tilnærming for å analysere reseptor-ligand-interaksjon som ligger mellom en enkel bindingsanalyse som undersøker interaksjonen av en ligand med en immobilisert receptor konstruere (slik som en oppløselig reseptor ekstracellulære område eller en reseptor ekstracellulære område kondensert til immunoglobulin), og analyse av reseptorbinding og nedstrøms effekter sett i bindingsanalyser i primære endotelceller. Det gir et system for å tillate binding og kryssbinding av reseptorer, de første to trinn av hvilke mange reseptor-type tyrosin-kinaser ofte initiere deres signaltransduksjon kaskade. Dens anvendelse i en rekke faglige og kommersielle sammenhenger har vist at det er akseptert som en nyttig analyse for å undersøke bindingsegenskaper, spesielt ved evaluering av variant ligander eller inhibitorer av reseptor-ligand-interaksjon.

Analysen er også nyttig for analyse av nye inhibitorer av reseptor ekstracellulære domene eller til sine ligander. Analysen kan videre brukes til raskt å screene varianter av ligandene eller reseptor-ekstracellulære områder sett i sammenheng med genomiske mutasjoner (både arvet og somatisk) funnet i human genes ved sykdommer som kreft 32,33 for å bestemme deres funksjonelle konsekvens. Derav anvendelser av denne VEGFR-2-analysen er sannsynlig å utvide i fremtiden. Videre kan den generelle fremgangsmåten som ligger til grunn av denne analysen anvendes i videre forstand for celleoverflate-reseptor-tyrosin-kinaser, som utgjør en stor og viktig familie av signalmolekyler i helse og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Steven A. Stacker og Marc M. Achen er aksjonærer i Circadian Technologies Ltd., et selskap som utvikler legemiddel ved å målrette VEGF familie av vekstfaktorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
  2. Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
  3. Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
  4. Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
  5. Korpelainen, E. I., Alitalo, K. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).
  6. Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  7. Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
  8. Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
  9. Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
  10. Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
  11. Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
  12. Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).
  13. Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
  14. Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
  15. Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
  16. Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
  17. Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
  18. Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
  19. Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
  20. McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
  21. Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
  22. Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
  23. Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
  24. Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
  25. Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
  26. Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
  27. Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
  28. Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
  29. Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
  30. Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
  31. Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
  32. Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
  33. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).

Tags

Cellular Biology Receptor VEGF ligand inhibitor signalering løselige reseptorer protein vekstfaktor bioassay monoklonalt antistoff
En enkel Bioassay for Evaluering av vaskulær endotelial vekstfaktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stacker, S. A., Halford, M. M.,… More

Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter