Summary
Vi beskriver en enkel cellbaserad bioanalys för detektion, kvantifiering och övervakning av aktiviteten hos medlemmar av vascular endothelial growth factor familj av ligander. Analysen använder chimära receptorer som uttrycks i en faktorberoende cellinje för att åstadkomma en semi-kvantitativ eller kvantitativ bedömning av receptorbindning och tvärbindning genom liganden.
Abstract
Analysen av receptortyrosinkinaser och deras samverkande ligander involverade i vaskulär biologi är ofta utmanande på grund av det konstitutiva uttrycket av familjer av besläktade receptorer, ett brett spektrum av relaterade ligander och svårigheten att hantera primära kulturer av specialiserade endotelceller. Här beskriver vi en bioanalys för detektering av ligander till vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor-2 (VEGFR-2), ett nyckelomvandlare av signaler som främjar angiogenes och lymfangiogenes. Ett cDNA som kodar för en fusion av den extracellulära (ligandbindande) området av VEGFR-2 med de transmembrana och cytoplasmiska regionerna av erytropoietinreceptorn (EpoR) uttrycks i den faktor-beroende cellinjen Ba / F3. Denna cellinje växer i närvaro av interleukin-3 (IL-3) och indragning av denna faktor resulterar i död av cellerna inom 24 timmar. Expression av VEGFR-2 / EpoR receptorfusions ger en alternativ mekanism för att främja överlevnad och potentially proliferation av stabilt transfekterade Ba / F3-celler i närvaro av en ligand med förmåga att binda och tvärbinda den extracellulära delen av fusionsproteinet (dvs., en som kan tvärbinda den VEGFR-2 extracellulära regionen). Analysen kan utföras på två sätt: en semi-kvantitativ metod där små volymer av ligand och celler medger snabb följd i 24 timmar, och en kvantitativ metod som innebär surrogatmarkörer av en livskraftig cell nummer. Analysen är relativt lätt att utföra, är mycket mottaglig för kända VEGFR-2-ligander och kan rymma extracellulära inhibitorer av VEGFR-2 signalering såsom monoklonala antikroppar till receptorn eller ligander och lösliga liganden fällor.
Introduction
Den vaskulära endoteliala tillväxtfaktor (VEGF) -familjen av utsöndrade protein tillväxtfaktorer och deras besläktade cellytereceptorer är en viktig och mångskiftande grupp av lösliga ligander och membraninbäddade receptorer, respektive den funktionen i transduktion av signaler över cellmembran. De fungerar huvudsakligen i endotelceller utan även i celler av epitelialt ursprung och de som av immunsystemet 1,2. Signalvägar som anlitas av ligand-aktiverade VEGF-receptorer (VEGFRs) är kritiska i stora sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration och cancer, och terapi riktar dem är ofta klinisk användning (t.ex. den monoklonala antikroppen bevacizumab som riktar VEGF-A) 3,4.
En av komplexiteten av VEGF-familjen är den mångfald av lösliga ligander närvarande i naturen (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-proteiner som kodas av parapox virusfamiljen ORF och ormgift VEGF, plus andra hämmandeisoformer av VEGF-A) 2.
Dessa ligander interagerar med tre medlemmar av receptortyrosinkinas familjen, nämligen VEGFR-1, VEGFR-2 och VEGFR-3. Dessa receptorer är variabelt uttrycks på olika celltyper, men ofta co-uttrycks på ytan av endotelceller som bekläder blod och lymfkärl i alla storlekar 5. VEGFR-2 kan binda däggdjurs ligander VEGF-A 6, VEGF-C 7 och VEGF-D 8,9 samt orf virus VEGF 10 och ormgift VEGF 11. VEGFR-2 spelar en viktig roll för att driva angiogenes (tillväxten av nya blodkärl från redan existerande kärl) i embryonal utveckling, sårläkning, cancer och ögonsjukdomar. I dessa sammanhang, ligander såsom VEGF-A, -C och -D binda och aktivera receptorn på blod vaskulära endotelceller 12-15. På lymfatiska endotelceller, VEGFR-2 spelar en roll i lymfangiogenes, bildandet av nya lymfkärl 16. VEGFR-2 kan också främja utvidgning och utbyggnad av stora artärer och lymfkärl i friska vävnader och sjukdomar 17. En fullständig förståelse av VEGFR-2: ligandinteraktioner är därför viktigt för utvecklingen av inhibitorer för användning vid behandling av angiogenesberoende sjukdomar 18. Medan de flesta isoformerna av VEGF-A binder till VEGFR-2, är proteolytisk klyvning av VEGF-C och VEGF-D krävs för att frigöra ett fragment som består av VEGF-homologidomän som uppvisar hög affinitetsbindning till VEGFR-2 19,20.
Vi har utvecklat en bioanalys för att övervaka ligander av VEGFR-2 som är utformade för att kringgå behovet av primära endotelceller, som är tekniskt svårt att passage, dyrt att köpa och kultur (som kräver specialiserad medium) 21 och uttrycka flera VEGFRs och tillhörande samarbete receptorer 22. Hetero av VEGFR-2 med andra VEGF-receptorer eller co-receptorer kan orsaka oönskad komplexitet när syftet är att study binära receptor-ligandinteraktioner, utvärdera aktivitet kan tillskrivas en specifik receptor, eller bedöma effekten av hämmande reagens. 23. Bioanalysen bibehåller rörligheten av den relevanta receptorn i cellmembranet och möjliggör utvärdering av en ligand förmåga att binda och tvärbinda VEGFR-2 extracellulära regionen.
Bioanalysen förlitar sig på skapandet av en chimär receptor i vilken den extracellulära regionen av en VEGF-receptor (i detta fall VEGFR-2) är sammansmält med transmembran- och intracellulära regioner av erytropoietinreceptorn (EpoR), en medlem av den cytokinreceptorfamiljen 8,24. Detta fusionsprotein uttrycks sedan i den faktor-beroende pro-B-cellinje Ba / F3, på vilken stimulering med en ligand med förmåga att binda och tvärbinda den extracellulära domänen av receptorn orsakar aktivering av den cytoplasmatiska effektor-regionen, som har förmåga att transducera en överlevnadssignal via januskinas (Jaks) att främja cellöverlevnad och / eller proliferation. I motsats, uttryck av fullängds-VEGFR-2 i samma celltyp, och stimulering med ligand, inte främjar cellöverlevnad och -proliferation, vilket indikerar att de proximala signalerings effektorer av VEGFR-2-vägen är inte tillgängliga i denna celltyp.
Vi har använt analysen i en mängd olika sammanhang för att undersöka bindning av nya VEGFR-2-ligander 10,19,20,24-29. I kombination med en VEGFR-3-EpoR-Ba / F3-analysen har vi jämfört de relativa aktiviteterna av VEGF-C och VEGF-D faktorer tillväxt för bindning och tvärbindning VEGFR-2 och VEGFR-3 30. Analysen har använts för att karaktärisera den inhiberande aktiviteten av neutraliserande monoklonala antikroppar till VEGFR-2 eller VEGF-D, löslig VEGFR-2-fälla och peptidomimetika som riktar VEGF-familjen 31. Analysen användes också för att visa förmågan hos VEGFs från olika stammar ORF virus att binda och tvärbinda VEGFR-2 före testning i primära endotelceller
Analysen vi beskriver är lätt att utföra, och semi-kvantitativ version möjliggör snabba bestäm som ibland krävs vid övervakning av produktionen eller rening av tillväxtfaktorer, antikroppar eller lösliga receptordomäner för andra experiment. Den enkla användningen av analysen gör det till ett idealiskt komplement till ytterligare och mer kompletta studier utförda med primära endotelceller härledda från blod eller lymfkärl från specifika vävnader eller organsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Källa till IL-3 och Beredning av WEHI-3D-konditionerat medium
Obs: Musen granulocytisk leukemi-cellinjen WEHI-3D är odlas för att alstra ett konditionerat medium innehållande IL-3.
- Kultur WEHI-3D i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% med lång livslängd glutamin komplement, 50 | ig / ml gentamicin. Ympa 5 x 10 6 celler i log-fas av tillväxt i 50 ml färskt odlingsmedium i en T175 cm 3 vävnadsodlingskolv och växa under ca 7 dagar eller tills cellerna har passerat sin log-fas av tillväxt med cirka 24 till 48 h (undvika överdriven celldöd i kulturen). Konditionerat medium är i stånd att lagras för flera år vid -20 ° C, så satser av 200 - 500 ml kan framställas på en gång.
- Häll vätska och celler från kolvar och snurra vid 1000 x g under 15 minuter för att avlägsna celler och cellrester. Ta bort den övre 90% av supernatant. Filtrera genom ett 0,22 | im filterenhet.
- Alikvotera WEHI-3D konditionerat medium (CM) i 1 ml, 50 ml och 200 ml volymer för lagring vid -20 ° C eller -70 ° C. Mindre portioner är användbara för framställning analys mellanliggande volymer för att göra odlingsmedium för passage av faktorberoende cellinjer, och större volymer för långtidsförvaring. IL-3 är relativt stabila vid 4 ° C så tinade mediet kan lagras under några veckor om de används under sterila betingelser.
- Alternativt, använda rekombinant mus-IL-3 vid nivåer av 50 ng / ml utspädda i odlingsmedium, efter filtrering genom ett 0,22 | im filterenhet.
2. Kultur och utvärdering av VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 och kontroll Ba / F3 cellinjer
- Kultur kontroll Ba / F3-celler i DMEM, 10% FBS, 50 | ig / ml gentamicin eller penicillin / streptomycin supplement, stabiliserad 1% L-glutamin och 10% WEHI-3D-CM. Passage celler vid 1:15 späd ungefär var tredje dag från cellerväxer i log-fas.
- Kultur VEGFR2-EpoR-Ba / F3-celler i DMEM, 10% FBS, 50 pg / ml gentamycin, stabiliserad 1% L-glutamin och 10% WEHI-3D-CM och 1 mg / ml G418. Passage celler vid 1:15 späd från celler som växer i log-fasen. Se 24 för mer information om konstruktionen och uttrycket av den chimära receptorn.
- Fångstkontroll Ba / F3 eller VEGFR2-EpoR-Ba / F3-celler från mitten av log-fas kulturer. pipettera försiktigt för att avlägsna dessa icke-vidhäftande celler från botten av kolven. Tvätta tre gånger i mus tonicitet fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,3 (PBS), (10 ml, centrifugera vid 750 x g under 5 min för att återvinna cellpelleten) för att avlägsna medium innehållande IL-3.
- Tvätta cellerna en gång med DMEM och tillsatser, utan att WEHI-3D-CM eller rekombinant IL-3, och sedan återsuspendera i detta medium vid en koncentration av 7,4 x 10 4 celler / ml (dvs 1000 celler per 13,5 pl; 10.000 celler per 135 pl som bestäms genom att räkna med användning av en hemocytometer) föranvändning i de halv kvantitativa eller kvantitativa versioner av analysen respektive.
- Bedöm celler för livskraft genom trypanblått uteslutning (OBS). Blanda trypanblått i PBS (0,4%) 1: 1 med cellpopulationen och räkna minst 100 celler på en hemocytometer. Celler som tar upp färgämnet anses döda eller döende. Livskraft större än 98% krävs för att utföra analysen.
3. Halv kvantitativ analys
- Lägga tvättade celler (1000 celler) som finns i 13,5 pl av IL-3-deficient medium till brunnarna i en 72-brunnars mikrobrunnsplattan vid RT. Var noga med att blanda cellsuspensionen under aliquotting att säkerställa cellsedimentering av tyngdkraften inte partiskhet cellkoncentrationen. Använd en väl kalibrerad P20 automatiserad pipett och autoklaveras tips.
- Lägga testprover och kontroller till brunnarna vid 10% volym (1,5 | il, vilket gör en slutlig volym på 15 pl innehållande 1000 celler per brunn) med användning av en kalibrerad P20 pipett eller, företrädesvis, P2 pipett. ta care att säkerställa att proven är förenliga med de odlingsbetingelser för Ba / F3-celler i form av pH, salt och andra potentiellt cytotoxiska / cytostatiska substanser. Där det är möjligt, använda ett kompatibelt medium eller buffert (t.ex. DMEM eller PBS, respektive) eller utspädd i ett sådant medium eller buffert. Triturering med samma spets kommer att lösningarna blandas.
- För kontrollprover, innefattar (i) enbart medium-innehållande ingen IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM läggas till enbart medium vid 10% slutlig volym; och / eller (iii) VEGF-A späddes till 100 ng / ml i enbart medium, som inte innehöll någon IL-3.
- Fyll oanvända brunnar i mikroplattan med sterilt vatten, PBS eller medium och placera plattan i en fuktig behållare (med vatten indränkt mjukpapper) tillåter gasutbyte. Inkubera celler i behållarna i en fuktad atmosfär av 10% CO2. Denna analys kan bekvämt inrättas i 3 tim med en person om testproverna och mediakomponenter är tillgängliga.
- Bedöm plattorna vanligen efter 16 timmar avinkubation vid vilken tidpunkt diskriminering mellan positiva och negativa prov är uppenbar. Se figur 3 för exempel på hur celler visas i odling. Analysera plattor med en vanlig inverterad faskontrastmikroskop vid 40-100 gångers förstoring.
Notera: Brunnar innehållande stödjande tillväxtfaktorer såsom IL-3 eller VEGF-A kommer att innehålla celler som förefaller runda och genomskinliga. Brunnar utan stödjande tillväxtfaktorer eller med enbart medium kommer att ha minskat antal av runda celler, såväl som döda eller döende celler och cellrester (t.ex., figur 3C). Utvärdering av analysen vid 24-48 h efter inkubationen är den optimala med avseende på känsligheten.
4. Kvantitativ bioanalys
- Lägga tvättade celler (10000 celler i 135 | j, l) i IL-3-deficient medium till brunnarna i en standard 96-brunnars mikrotiterplatta vid RT. Var noga med att blanda cellsuspensionen under aliquotting att säkerställa cellsedimentering av tyngdkraften påverkar inte cell koncentration.
- Lägga testprover och kontroller till brunnarna vid 10% volym (15 | il) med användning av en kalibrerad pipett (P20). Var noga med att säkerställa att proven är förenliga med odlingsbetingelser för Ba / F3-celler i form av pH, salt eller andra potentiellt cytotoxiska / cytostatiska ämnen. Där det är möjligt, använda ett kompatibelt medium eller buffert (t ex., DMEM eller PBS) eller utspädd i ett sådant medium eller buffert. Filter sterilisera små volymer med hjälp av en 0,22 um por cellulosaacetat centrifugrör filterenhet.
- Inkubera blandningen av celler, tillväxtfaktorer och / eller inhibitor medel i en fuktad atmosfär av 10% CO2 under 48 timmar. Utför analysen i en fuktig behållare som har vattniga mjukpapper och tillåter gas-utbyte. Vid fullbordandet av inkubationsperioden, utvärdera analys med användning av en av de alternativa metoder som anges nedan, vilka är surrogatmarkörer för den viabla cellantalet i brunnen.
- Alternativ # 1: 3 H-thymidine Incorporation
Notera: Denna kvantifiering är avsedd för 96-brunnsplattformat.- Efter inkubering av analysplattor för 48 timmar vid 37 ° C (150 ^ il volym per brunn), tillsätt 3 H-tymidin i en volym av 50 | il analysmedium (Ba / F3 kulturmedium utan IL-3 / WEHI-3D CM) per brunn vid en koncentration av 20 ^ Ci / ml, vilket gav en slutlig dos av 1 | j, Ci per brunn.
- Inkubera plattorna under ytterligare 4 h vid 37 ° C före skörd av celler med användning av en cellskördare. Extrahera individuella prover genom att placera filtren i scintillant och kvantifiera med en vätskescintillationsräknare.
- Alternativ # 2: Bioluminescence detektion av Cellular ATP
Obs: Denna metod använder en ATP-övervakning reagens som när de kombineras med cellysatet kan generera en mareld signal som återspeglar levande celler i populationen.- Lyse celler att utvinna ATP och använda en ATP övervaknings Reagens för att generera ensjälvlysande signal enligt tillverkarens anvisningar. Läs luminiscens med användning av en luminometer kompatibel med en 96-brunnsplattformat.
- Alternativ # 3: Enzymatisk Reduktion av en indikator Dye av levande celler
Obs: Resazurin baserade analyser visar god korrelation till cellernas livskraft.- Kombinera odlade celler med resazurin baserade färgämnet och kvantifiera analyser med användning av en fluorescensplattläsare i enlighet med tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det här avsnittet visar vi resultatet av ett experiment som visar de väsentliga inslag i en VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioanalys (se figur 1 för principerna för analys). Andra publicerade studier visar bredare tillämpningar av analysen för alternativa VEGFR-2-ligander, mutant VEGF molekyler och inhibitoriska monoklonala antikropparna 8,10,19,24-30.
De data som presenteras här representerar en analys i vilken den VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioanalys används för att kvantifiera aktiviteten av de tre rekombinanta humana ligander (VEGF-A 165, VEGF-C och VEGF-D) med specificitet för VEGFR -2 i närvaro av en inhibitorisk monoklonal antikropp (bevacizumab) till VEGF-A 165. Data har normaliserats i förhållande till responsen på VEGF-A 165 enbart (figur 2). Som väntat, bevacizumab blockerade effekten av VEGF-A 165 i analysen, menhade ingen effekt på aktiviteten för VEGF-C och VEGF-D.
I semi-kvantitativ version av analysen eller när man observerar analysen under dess utveckling, tittar analysen med en vanlig inverterad fas mikroskop kan ge värdefull information om utvecklingen av analysen. En analys av en analys (Figur 3) visar den goda livskraft VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-bioassay-celler när de inkuberades med medium innehållande IL-3, eller ligand för VEGFR-2, t.ex., VEGF-A. Dessa celler är stora och genomskinlig, och det finns ingen eller minimal bevis på granularitet i den cellulära cytoplasman eller cellfragment i kulturen. I brunnen med några ytterligare tillväxtfaktorer finns redan tecken på minskat antal celler och få friska celler. Celler som är närvarande har betydande granularitet i deras cytoplasma och cellfragment är ett konsekvent egenskap av kulturen. Efter 48 timmar finns det inga tecken på livsdugliga celler.
Figur 1. Schematiskt diagram Beskriva principerna för VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 Bioanalys. (A) Ba / F3-celler är faktorberoende och kräver en exogen tillväxtfaktor, såsom IL-3 att stimulera celltillväxt / livsduglighet via endogena IL-3-receptorer och JAK signalväg. Om EpoR uttrycks i dessa celler räddning kan också ske via JAK vägen. Expression av en fullängds receptor-tyrosinkinas såsom VEGFR-2 resulterar i minimal signalering som mål för VEGFR-2 aktivering nedströms inte engagera JAK vägen. En chimär receptor med den extracellulära regionen av VEGFR-2 sammansmält med transmembran- och cytoplasmatiska regioner i EpoR, när den transfekteras in i Ba / F3-celler och stimulerades med specifika VEGFR-2-ligander, har förmåga att aktivera JAK-vägen och körning cellöverlevnad och proliferation. (B) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-celler uttrycker signifikanta nivåer av den chimära VEGFR-2-EpoR-receptor som kan kvantifieras med användning av flödescytometri. En gång tvättas ur av IL-3-innehållande medium, celler placeras i en mängd olika odlingsbetingelser som driver antingen överlevnad / proliferation av celler. Otransfekterade Ba / F3-celler eller VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-celler utan specifika tillväxtfaktorer inte växer / överleva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Utvärdering av VEGFR-2-ligander i VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-bioassay. IL-3-beroende Ba / F3-celler som uttrycker en mus VEGFR-2-EpoR chimär såddes i medium utan IL-3 (med undantag förpå + IL-3 undergrupp, såsom anges) plus humant VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (detta är en form av VEGF-C som består av det centrala området och utesluter de N och C-terminala propeptiderna), eller VEGF-DANAC (detta är en form av VEGF-D, som innefattar det centrala området och utesluter de N och C-terminala propeptiderna (VD)) vid 100 ng / ml och humaniserad neutraliserande monoklonala antikroppen bevacizumab (som binder och hämmar VEGF-A, men inte VEGF-C eller VEGF-D), eller kontrollera icke-neutraliserande antikropp trastuzumab, såsom indikeras vid 0,75 ^ M. NF = medium som inte innehåller några ytterligare tillväxtfaktorer. Fyrtioåtta timmar senare, var relativt levande cell nummer kvantifieras med hjälp av bioluminiscens upptäckt av cellulär ATP. Vertikala staplar representerar medel (normaliserade mot svaret på VEGF-A 165 ensam, första bar) och standardfel av medelvärdet av tre oberoende försök. Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.
Figur 3. VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-celler är beroende av externa tillväxtfaktorer för överlevnad. Exempel på VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioanalys i vilken IL-3-beroende Ba / F3-celler som uttrycker en mus VEGFR- 2-EpoR chimär såddes i medium (A) innehållande 10% WEHI-3D-konditionerat medium som tillhandahåller IL-3, (B) 100 ng / ml VEGF-A 165 (inget IL-3), eller (C) medium människa med ingen IL-3 eller ytterligare tillväxtfaktorer. Kultur avbildas 24 h i analys visar höggradigt viabla celler i närvaro av IL-3 (A) eller VEGF-A 165 (B), medan i kultur utan någon IL-3 eller ytterligare tillväxtfaktorer (C) celldöd och röduced livskraft är tydligt. Vågar barer är 100 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den analys som beskrivs här förlitar sig på användning av celler med hög livsduglighet, som är beroende av tillväxtfaktorer. Celler måste därför vara noggrant odlas för att säkerställa att de är faktorberoende, och behålla uttryck av den chimära receptorn. Att se till att mediet nyligen gjort och inte lagras under en alltför lång tid och att WEHI-3D CM är högaktiv är viktigt. Celler måste noggrant tvättas från IL-3-innehållande medium in i analysmediet för att säkerställa att ingen kvarvarande IL-3 förorenar undersökningen, när exponering av cellerna för bärgarligander. Som ligander kan komma i ett antal olika former, behöver att vara försiktig när du förbereder dessa för analys. Konserveringsmedel, anti-bakteriella medel, salt eller buffertar med olika pH kan påverka analysen och det är därför parallell testning av otransfekterade Ba / F3-celler kan informera om buffertrelaterade frågor.
Vi använder både de semikvantitativa och kvantitativa protokoll. Den halv quantitative analysen möjliggör snabb bedömning av aktiviteten hos proverna före att begå ett helt kvantitativ analys som kräver mer tid och prov. Den kvantitativa metoden används uteslutande vid generering av uppgifter för publicering. De alternativa metoder för att detektera livskraft kulturen är relativt enkelt. Den kvantitativa analysen har anpassats till ett antal olika format för kvantifiering av proliferation, och vi har använt (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) MTT 30, bioluminescence detektion av cellulär ATP (opublicerad), resazurin baserat färgämne (figur 2) och 3 H-tymidin 31 med framgång. Under de senaste åren har vi utvecklats från användningen av strålning för att anpassa mareld tillvägagångssätt och har använt resazurin baserade färg på grund av dess kostnadseffektivitet. Alla metoder ger lämpliga resultat och valet kan bero på tillgängligheten av reagenser och enssociated specialiserade plattläsare i ett givet laboratorium / institut eller förtrogenhet med särskilda metoder.
Felsökning kretsar kring aktiviteten av tre huvudkomponenter i analysen, i) IL-3 CM, ii) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-celler och iii) stimulerande ligander. Dåliga nivåer av IL-3 i CM på grund av otillräckliga WEHI 3D celler i den ursprungliga kulturen, dåliga lagringsförhållanden, överdriven frysupptiningscykler eller med hjälp av för hög utspädning kan skapa dåligt växande kulturer som hämmar analysen. Detta är oftast upptäcks i kontrollbrunnar som cellpopulationer växer långsamt, förlora sin normala ljus och runda utseende. VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-analysceller kan förlora cellytan uttryck av den chimära konstruktionen över tiden om de hålls i odling under långa perioder. Att upprätthålla goda antal flytande kväve bestånd gör det möjligt färska cellkulturer starkt uttrycker den chimära receptorn att vara tillgänglig hela tiden. Om det behövs en hög uttrycker befolkning kan varauppnås genom att odla celler i VEGFR-2-ligander och välja population som uttrycker höga nivåer av den chimära receptorn från flödescytometri sortering. Dessa celler är sedan vidareutvecklas i kultur för frysning.
Medan teknik är ett bekvämt och förenklat alternativ för analys av interaktioner med VEGFR-2 extracellulära domänen det kan inte ses att ersätta mer sofistikerade experiment där den nativa receptorn på primära endotelceller probas i närvaro av andra VEGFRs, co-receptorer, såsom neuropilins. Cellerna på vilken denna analys bygger på (B-celler) är skilda från endotelceller och bör därför inte användas för att studera de cytoplasmiska signalvägar och transkriptionsfaktorer som svarar på VEGFR-2-aktivering i endotelceller. Icke desto mindre, tillhandahåller metoden ett användbart tillvägagångssätt för att analysera receptor-ligand växelverkan som ligger mellan en enkel bindningsanalys som undersöker interaktionen av en ligand med en immobiliserad receptor konstruera (såsom en löslig receptor extracellulär region eller en receptor extracellulär region sammansmält med immunglobulin), och analysen av receptorbindning och nedströms effekter som ses i bindningsanalyser till primära endotelceller. Det ger ett system för att medge bindning och tvärbindning av receptorer, de två första etapperna av vilka många receptor-typ tyrosinkinaser initierar vanligen deras signaltransduktion kaskad. Dess tillämpning i ett antal akademiska och kommersiella miljöer har visat att det är accepterat som en användbar analys för att undersöka bindningsegenskaper, speciellt vid utvärdering variantligander eller hämmare av receptor-ligand växelverkan.
Analysen är också användbar för analys av nya inhibitorer av receptorextracellulära domänen eller dess ligander. Analysen skulle kunna användas vidare för att snabbt screena varianter av de ligander eller receptorextracellulära regioner som ses i samband med genomiska mutationer (både ärvd och somatisk) som finns i humant genes i sjukdomar som cancer 32,33 för att bestämma deras funktionella följd. Därav tillämpningar av denna VEGFR-2-analysen kommer sannolikt att expandera i framtiden. Vidare kan utnyttjas det allmänna tillvägagångssätt som ligger bakom denna analys mer allmänt för cellyte receptortyrosinkinaser, som utgör en stor och viktig familj av signalmolekyler i hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Steven A. Stacker och Marc M. Achen är aktieägare i Circadian Technologies Ltd, ett företag som utvecklar läkemedel genom att rikta VEGF-familjen av tillväxtfaktorer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester | |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K.
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K.
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
