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Biology

संवहनी endothelial वृद्धि कारकों की मूल्यांकन के लिए एक सरल Bioassay

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

हम पता लगाने बढ़ाता है और ligands के संवहनी endothelial वृद्धि कारक परिवार के सदस्यों की गतिविधि की निगरानी के लिए एक साधारण सेल आधारित bioassay का वर्णन है। परख एक कारक पर निर्भर सेल लाइन में व्यक्त chimeric रिसेप्टर्स का उपयोग करता ligand द्वारा रिसेप्टर बंधन और पार से जोड़ने की एक अर्द्ध मात्रात्मक या मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करने के लिए।

Abstract

रिसेप्टर tyrosine kinases और उनकी बातचीत ligands संवहनी जीव विज्ञान में शामिल के विश्लेषण से संबंधित रिसेप्टर्स, संबंधित ligands के एक विस्तृत रेंज और विशेष endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों के साथ काम करने की कठिनाई के परिवारों के विधान अभिव्यक्ति के कारण अक्सर चुनौतीपूर्ण है। यहाँ हम संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (VEGFR -2), संकेत है कि angiogenesis और lymphangiogenesis को बढ़ावा देने का एक प्रमुख ट्रांसड्यूसर को ligands का पता लगाने के लिए एक bioassay का वर्णन है। एक सीडीएनए transmembrane और erythropoietin रिसेप्टर (EpoR) के cytoplasmic क्षेत्रों के साथ VEGFR -2 के बाह्य (ligand बाध्यकारी) क्षेत्र के एक संलयन एन्कोडिंग कारक पर निर्भर सेल लाइन बीए / F3 में व्यक्त किया जाता है। यह सेल लाइन 24 घंटा के भीतर कोशिकाओं की मौत में इंटरल्यूकिन 3 (आईएल 3) और इस पहलू परिणामों की वापसी की उपस्थिति में होती है। VEGFR-2 / EpoR रिसेप्टर संलयन की अभिव्यक्ति एक वैकल्पिक व्यवस्था अस्तित्व और क्षमता को बढ़ावा देने के लिए प्रदान करता हैएक ligand बंधन और संलयन प्रोटीन (यानी, एक है कि कर सकते हैं पार से लिंक VEGFR -2 बाह्य क्षेत्र) के बाह्य भाग पार से जोड़ने के लिए सक्षम की उपस्थिति में स्थित होकर ट्रांसफ़ेक्ट बीए / F3 कोशिकाओं के प्रसार lly। एक अर्द्ध मात्रात्मक दृष्टिकोण जिसमें ligand और कोशिकाओं की छोटी मात्रा में 24 घंटा में तेजी से परिणाम की अनुमति है, और एक मात्रात्मक एक व्यवहार्य सेल नंबर के किराए की मार्कर से जुड़े दृष्टिकोण: परख दो तरीकों से किया जा सकता है। परख प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, ज्ञात VEGFR -2 ligands के लिए अत्यधिक संवेदनशील है और VEGFR -2 ऐसे रिसेप्टर या ligands, और घुलनशील ligand जाल को मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में संकेत के बाह्य अवरोधकों को समायोजित कर सकते हैं।

Introduction

secreted प्रोटीन वृद्धि कारक है और उनके आत्मीय कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) परिवार घुलनशील ligands और झिल्ली एम्बेडेड रिसेप्टर्स, सेलुलर झिल्ली भर संकेतों transducing में क्रमश कि समारोह का एक महत्वपूर्ण और विविध समूह है। वे endothelial कोशिकाओं में भी, लेकिन उपकला मूल की कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली 1,2 के उन लोगों में मुख्य रूप से कार्य करते हैं। उन्हें निशाना बना ligand सक्रिय वीईजीएफ़ रिसेप्टर्स (VEGFRs) जैसे उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन और कैंसर के रूप में प्रमुख विकृतियों, में महत्वपूर्ण हैं, और चिकित्सा विज्ञान से लगे हुए रास्ते संकेतन लगातार नैदानिक ​​उपयोग में हैं (जैसे, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी bevacizumab कि वीईजीएफ़-ए लक्ष्य) 3,4।

वीईजीएफ़ परिवार की जटिलताओं से एक प्रकृति में मौजूद घुलनशील ligands (वीईजीएफ़-ए, वीईजीएफ़-बी, वीईजीएफ़-सी, वीईजीएफ़-डी, प्रोटीन वीईजीएफ़ parapox वायरस परिवार ओआरएफ और सांप के जहर वीईजीएफ़, के अलावा अन्य द्वारा इनकोडिंग की विविधता है निरोधात्मकवीईजीएफ़-ए) 2 के isoforms।

ये ligands रिसेप्टर tyrosine काइनेज परिवार के तीन सदस्यों, अर्थात् VEGFR -1, VEGFR -2 और VEGFR-3 के साथ बातचीत। इन रिसेप्टर्स अस्थायित्व विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं पर व्यक्त कर रहे हैं, लेकिन endothelial कोशिकाओं है कि सभी आकार 5 के रक्त और लसीका वाहिकाओं लाइन की सतह पर अक्सर सह व्यक्त कर रहे हैं। VEGFR -2 बाध्य कर सकते हैं स्तनधारी ligands वीईजीएफ़-ए 6, वीईजीएफ़-सी 7 और वीईजीएफ़-डी 8,9 के साथ ही ओआरएफ वायरस वीईजीएफ़ 10 और सांप के जहर वीईजीएफ़ 11। VEGFR -2 angiogenesis भ्रूण के विकास में (पूर्व मौजूदा जहाजों से नए रक्त वाहिकाओं के विकास), घाव भरने, कैंसर और नेत्र रोगों ड्राइविंग में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। इन संदर्भों में, इस तरह के वीईजीएफ़-ए, सी और डी के रूप में बाँध और ligands रक्त संवहनी endothelial कोशिकाओं 12-15 पर रिसेप्टर को सक्रिय करें। लसीका endothelial कोशिकाओं पर, VEGFR -2 lymphangiogenesis में एक भूमिका है, नए लसीका वाहिकाओं 16 के गठन निभाता है। VEGFR-2 भी फैलाव और स्वस्थ ऊतकों और रोग 17 में प्रमुख धमनियों और lymphatics के विस्तार को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। VEGFR -2 की पूरी समझ: ligand बातचीत इसलिए angiogenesis निर्भर रोगों 18 के उपचार में उपयोग के लिए अवरोधकों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। VEGFR-2 वीईजीएफ़-एक बाँध के सबसे isoforms, वीईजीएफ़-सी और डी के वीईजीएफ़-प्रोटिओलिटिक दरार वीईजीएफ़-अनुरूपता डोमेन कि उच्च आत्मीयता VEGFR -2 19,20 के लिए बाध्य दर्शाती से मिलकर एक टुकड़ा जारी करने के लिए आवश्यक है है।

हम जानते हैं कि प्राथमिक endothelial कोशिकाओं है, जो पारित होने के लिए तकनीकी रूप से कठिन हैं, खरीद करने के लिए महंगा और संस्कृति के लिए जरूरत नाकाम करने के लिए बनाया गया है VEGFR -2 के ligands की निगरानी के लिए एक bioassay (विशेष माध्यम की आवश्यकता होती है), 21 विकसित और कई VEGFRs एक्सप्रेस और सह जुड़े है 22 रिसेप्टर्स। अन्य वीईजीएफ़ रिसेप्टर्स या सह-रिसेप्टर्स के साथ VEGFR -2 के Heterodimerization अवांछित जटिलता पैदा कर सकता है जब संवर्धन करने के लिए लक्ष्यY बाइनरी रिसेप्टर ligand बातचीत, गतिविधि के मूल्यांकन के लिए एक विशिष्ट रिसेप्टर के कारण, या निरोधात्मक अभिकर्मकों के प्रभाव का आकलन। 23। bioassay कोशिका झिल्ली में प्रासंगिक रिसेप्टर की गतिशीलता बरकरार रखती है और एक ligand के लिए बाध्य करने की क्षमता और पार से लिंक VEGFR -2 बाह्य क्षेत्र के मूल्यांकन की अनुमति देता है।

bioassay एक chimeric रिसेप्टर के सृजन में जो एक वीईजीएफ़ रिसेप्टर (इस मामले VEGFR -2 में) के बाह्य क्षेत्र transmembrane और erythropoietin रिसेप्टर (EpoR), साइटोकाइन रिसेप्टर परिवार के एक सदस्य के intracellular क्षेत्रों से जुड़े हुए है पर निर्भर करता है 8,24। इस संलयन प्रोटीन तो, कारक पर निर्भर समर्थक बी सेल लाइन बीए / F3 में व्यक्त किया जाता है एक ligand बंधन और पार से जोड़ने रिसेप्टर के बाह्य डोमेन cytoplasmic प्रेरक क्षेत्र है, जो करने में सक्षम है की सक्रियता के कारण बनता में सक्षम के साथ जो उत्तेजना पर जानूस kinases (JAKs) के माध्यम से एक अस्तित्व संकेत transducing सेल को बढ़ावा देने केअस्तित्व और / या प्रसार। इसके विपरीत, पूर्ण लंबाई VEGFR-2 एक ही प्रकार की कोशिका में, और ligand के साथ उत्तेजना की अभिव्यक्ति, सेल अस्तित्व और प्रसार को बढ़ावा देने नहीं करता है, यह दर्शाता है कि VEGFR -2 मार्ग के समीपस्थ सिगनल प्रभावोत्पादक इस प्रकार की कोशिका में उपलब्ध नहीं हैं।

हम संदर्भों की एक किस्म में परख का इस्तेमाल किया है उपन्यास VEGFR -2 ligands 10,19,20,24-29 के बंधन पता लगाने के लिए। एक VEGFR-3-EpoR-बीए / F3 परख के साथ संयोजन में, हम बंधन और पार से जोड़ने VEGFR -2 और VEGFR-3 30 के लिए वीईजीएफ़-सी के सापेक्ष गतिविधियों और वीईजीएफ़-डी में वृद्धि कारकों की तुलना में है। परख VEGFR -2 या वीईजीएफ़-डी, घुलनशील VEGFR -2 जाल और वीईजीएफ़ परिवार 31 को लक्षित करने के लिए peptidomimetics मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने की निरोधात्मक गतिविधि को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। परख भी प्राथमिक endothelial कोशिकाओं में अलग ओआरएफ वायरस तनाव से VEGFs की क्षमता को बाध्य करने के लिए और पार से लिंक VEGFR -2 का परीक्षण करने से पहले दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था 25 या जब सफ़ाई के विकास के लिए आकलन प्रोटोकॉल कारकों 27 के लिए पेश कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

परख का वर्णन हम प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और अर्द्ध मात्रात्मक संस्करण त्वरित निर्धारण कि कभी कभी जब उत्पादन या वृद्धि कारक है, एंटीबॉडी या अन्य प्रयोगों के लिए घुलनशील रिसेप्टर डोमेन की शुद्धि की निगरानी के लिए आवश्यक हैं के लिए अनुमति देता है। परख के उपयोग में आसानी यह प्राथमिक endothelial विशिष्ट ऊतकों या अंग प्रणालियों से रक्त या लसीका वाहिकाओं से ली गई कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन आगे और अधिक पूरा अध्ययन करने के लिए एक आदर्श पूरक बनाता है।

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Protocol

आईएल 3 और की तैयारी के स्रोत Wehi 3 डी-वातानुकूलित माध्यम

नोट: माउस granulocytic ल्यूकेमिया सेल लाइन Wehi-3D एक वातानुकूलित माध्यम आईएल -3 युक्त उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत है।

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में संस्कृति Wehi 3 डी (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% लंबे जीवन glutamine पूरक, 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन। एक T175 3 सेमी टिशू कल्चर फ्लास्क में ताजा संस्कृति के माध्यम से 50 मिलीलीटर में विकास की लॉग चरण में 5 × 10 6 कोशिकाओं टीका लगाना और के बारे में 7 दिनों के लिए विकसित या जब तक कोशिकाओं के बारे में 24 से विकास के उनके लॉग चरण बीत चुके हैं - 48 घंटा (संस्कृति में अत्यधिक कोशिका मृत्यु से बचने)। वातानुकूलित मीडिया, -20 डिग्री सेल्सियस पर कई वर्षों के लिए भंडारित किया जा रहा करने में सक्षम है, इसलिए 200 के बैच - 500 मिलीलीटर एक समय में उत्पादन किया जा सकता है।
  2. पर 1,000 x जी तरल पदार्थ और बोतल और स्पिन से कोशिकाओं को छानना 15 मिनट कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए। supern के शीर्ष 90% निकालेंatant। एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर यूनिट के माध्यम से फ़िल्टर।
  3. अशेष Wehi 3 डी वातानुकूलित मध्यम (मुख्यमंत्री) 1 मिलीलीटर, 50 मिलीलीटर और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 200 मिलीलीटर की मात्रा या -70 डिग्री सेल्सियस में। छोटे aliquots परख तैयारी, कारक पर निर्भर सेल लाइनों के पारित होने के लिए संस्कृति के माध्यम से बनाने के लिए मध्यवर्ती संस्करणों, और लंबी अवधि के भंडारण के लिए बड़ी मात्रा के लिए उपयोगी होते हैं। आईएल -3 अपेक्षाकृत स्थिर 4 डिग्री सेल्सियस पर इतनी Thawed मध्यम कुछ ही हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है अगर बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है।
  4. वैकल्पिक रूप से, संस्कृति माध्यम में पतला एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर यूनिट के माध्यम से फ़िल्टर किए जाने के बाद 50 एनजी / एमएल के स्तर पर पुनः संयोजक माउस आईएल -3 का उपयोग करें।

2. संस्कृति और VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 और नियंत्रण बीए / F3 सेल लाइन्स का मूल्यांकन

  1. संस्कृति नियंत्रण DMEM में बीए / F3 कोशिकाओं, 10% FBS, 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन या पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन पूरक, 1% स्थिर एल glutamine और 10% Wehi 3 डी-मुख्यमंत्री। कोशिकाओं से हर तीन दिन के बारे में 1:15 dilutions में पारित होने कोशिकाओंलॉग चरण में बढ़ रहा है।
  2. DMEM में संस्कृति VEGFR2-EpoR-बीए / F3 कोशिकाओं, 10% FBS, 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin, 1% एल glutamine और 10% Wehi 3 डी-मुख्यमंत्री और 1 मिलीग्राम / एमएल G418 स्थिर हो। लॉग चरण में बढ़ कोशिकाओं से 01:15 dilutions में पारित होने कोशिकाओं। निर्माण और कैमेरिक रिसेप्टर की अभिव्यक्ति के बारे में अधिक जानकारी के लिए 24 देखें।
  3. हार्वेस्ट नियंत्रण बीए / F3 या मध्य लॉग चरण संस्कृतियों से VEGFR2-EpoR-बीए / F3 कोशिकाओं। धीरे कुप्पी के नीचे से इन गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के पिपेट। तीन बार माउस सुर, शक्तिप्रदता फॉस्फेट बफर खारा, पीएच 7.3 (पीबीएस) में, (10 मिलीलीटर, सेंट्रीफ्यूज पर 750 x जी 5 मिनट के लिए सेल गोली ठीक करने के लिए) मध्यम युक्त आईएल -3 दूर करने के लिए धो लें।
  4. 10,000 कोशिकाओं प्रति, एक बार DMEM और additives के साथ धो कोशिकाओं, Wehi 3 ​​डी-मुख्यमंत्री या पुनः संयोजक आईएल -3 के बिना, और फिर 7.4 × 10 4 कोशिकाओं / एमएल (यानी, 13.5 μl प्रति 1,000 कोशिकाओं की एकाग्रता में इस माध्यम में resuspend के लिए 135 μl के रूप में एक hemocytometer का उपयोग गिनती द्वारा निर्धारित)क्रमश: परख की अर्द्ध मात्रात्मक या मात्रात्मक संस्करणों में उपयोग करें।
  5. Trypan ब्लू बहिष्कार (चेतावनी) द्वारा व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं का आकलन करें। सेल की आबादी के साथ 1 और एक hemocytometer पर 100 कोशिकाओं की एक न्यूनतम गिनती: पीबीएस (0.4%) 1 में Trypan ब्लू मिक्स। प्रकोष्ठों कि डाई हाथ में ले लिया मृत या मर माना जाता है। अधिक से अधिक से अधिक 98% की व्यवहार्यता परख प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है।

3. अर्द्ध मात्रात्मक परख

  1. धोया कोशिकाओं (1,000 कोशिकाओं) आरटी पर एक 72 अच्छी तरह से microwell प्लेट के कुओं के लिए आईएल -3 की कमी माध्यम की 13.5 μl में निहित जोड़ें। सेल बसने सुनिश्चित करने के लिए गुरुत्वाकर्षण पूर्वाग्रह सेल एकाग्रता नहीं करता है के द्वारा aliquotting के दौरान सेल निलंबन मिश्रण करने के लिए ध्यान रखना। एक अच्छी तरह से calibrated P20 स्वचालित पिपेट, और autoclaved युक्तियों का उपयोग करें।
  2. 10% मात्रा में कुओं के लिए परीक्षण के नमूने और नियंत्रण जोड़ें (1.5 μl, अच्छी तरह से प्रति 1,000 कोशिकाओं से युक्त 15 μl के अंतिम मात्रा बनाने) एक calibrated P20 पिपेट या, अधिमानतः, P2 पिपेट का उपयोग। सीए ले लोफिर से सुनिश्चित करने के लिए कि नमूने पीएच, नमक और अन्य संभावित साइटोटोक्सिक / cytostatic पदार्थों के मामले में बीए / F3 कोशिकाओं के लिए संस्कृति शर्तों के साथ संगत कर रहे हैं। जहां संभव हो, एक संगत माध्यम का उपयोग या बफर (जैसे, DMEM या पीबीएस, क्रमशः) या इस तरह के मध्यम या बफर में पतला। एक ही टिप के साथ Trituration मिश्रण सुनिश्चित करेगा।
  3. नियंत्रण नमूने के लिए, (मैं) मध्यम अकेले युक्त शामिल कोई आईएल 3; (Ii) Wehi-3BD-मुख्यमंत्री 10% अंतिम मात्रा में अकेले माध्यम से जोड़ा; और / या (iii) वीईजीएफ़-ए अकेले माध्यम में 100 एनजी / एमएल पतला, कोई आईएल -3 युक्त।
  4. बाँझ पानी, पीबीएस या माध्यम के साथ microwell प्लेट के किसी भी अप्रयुक्त कुओं भरें और एक humidified कंटेनर के भीतर थाली जगह की अनुमति के गैस एक्सचेंज (पानी से लथपथ टिशू पेपर के साथ)। 10% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में कंटेनर के भीतर कोशिकाओं को सेते हैं। इस परख आराम से एक व्यक्ति द्वारा 3 घंटा में स्थापित किया जा सकता है, तो परीक्षण के नमूने और मीडिया घटकों उपलब्ध हैं।
  5. प्लेटों का आकलन आम तौर पर 16 घंटे के बादऊष्मायन, जिस पर सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच समय भेदभाव स्पष्ट है। कैसे कोशिकाओं संस्कृति में दिखाई देते हैं के उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें। 100 × बढ़ाई - 40 पर एक मानक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग प्लेटों का विश्लेषण।
    नोट: वेल्स ऐसे आईएल -3 या वीईजीएफ़-ए युक्त सहायक विकास कारक हैं जो दौर और पारदर्शी दिखाई कोशिकाओं में शामिल होंगे। सहायक विकास कारकों के बिना या अकेले माध्यम के साथ वेल्स दौर कोशिकाओं, साथ ही मृत या मर कोशिकाओं और सेलुलर मलबे (जैसे, चित्रा -3 सी) की संख्या को कम कर दिया जाएगा। 24-48 घंटा के बाद ऊष्मायन पर परख का मूल्यांकन संवेदनशीलता के लिए इष्टतम है।

4. मात्रात्मक Bioassay

  1. आरटी पर एक मानक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट के कुओं के लिए आईएल -3 की कमी माध्यम में धोया कोशिकाओं (135 μl में 10,000 कोशिकाओं) जोड़ें। गुरुत्वाकर्षण सीई को प्रभावित नहीं करता द्वारा सेल बसने सुनिश्चित करने के लिए aliquotting के दौरान सेल निलंबन मिश्रण करने के ख्याल रखनाडालूँगा एकाग्रता।
  2. 10% की मात्रा (15 μl) एक calibrated पिपेट (P20) का उपयोग करने पर कुओं के लिए परीक्षण के नमूने और नियंत्रण जोड़ें। यह सुनिश्चित करें कि नमूने पीएच, नमक या अन्य संभावित साइटोटोक्सिक / cytostatic पदार्थों के मामले में बीए / F3 कोशिकाओं के लिए संस्कृति शर्तों के साथ संगत कर रहे हैं ख्याल रखना। जहां संभव हो, एक संगत माध्यम का उपयोग या बफर (उदा।, DMEM या पीबीएस) या ऐसे मध्यम या बफर में पतला। फ़िल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना सेलूलोज एसीटेट अपकेंद्रित्र ट्यूब फिल्टर यूनिट का उपयोग कर छोटे संस्करणों बाँझ।
  3. 48 घंटे के लिए 10% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में कोशिकाओं, वृद्धि कारक है और / या अवरोध एजेंटों के मिश्रण सेते हैं। एक humidified कंटेनर पानी से लथपथ टिशू पेपर है और गैस विनिमय की अनुमति देता है कि भीतर परख प्रदर्शन। ऊष्मायन अवधि के पूरा होने पर, जो नीचे सूचीबद्ध वैकल्पिक तरीकों में से एक का उपयोग परख का मूल्यांकन में अच्छी तरह से व्यवहार्य सेल नंबर के किराए की मार्करों हैं।
  4. वैकल्पिक # 1: 3 एच-thymidine निगमन
    नोट: यह मात्रा का ठहराव 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप के लिए बनाया गया है।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस (अच्छी तरह से प्रति 150 μl मात्रा) पर 48 घंटे के लिए परख प्लेटों के ऊष्मायन के बाद, (आईएल 3 / Wehi 3 ​​डी मुख्यमंत्री के बिना बीए / F3 संस्कृति के माध्यम से) परख माध्यम के 50 μl की मात्रा में 3 एच thymidine जोड़ने अच्छी तरह से 20 μCi / एमएल की एकाग्रता में प्रति, अच्छी तरह से प्रति 1 μCi के अंतिम खुराक दे रही है।
    2. एक और 4 के लिए एक सेल फसल काटने की मशीन का उपयोग कोशिकाओं की कटाई से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं। Scintillant में फिल्टर रखकर अलग-अलग नमूने निकालने और एक तरल जगमगाहट काउंटर के साथ यों।
  5. वैकल्पिक # 2: सेलुलर एटीपी के Bioluminescence जांच
    नोट: यह दृष्टिकोण एक एटीपी निगरानी अभिकर्मक जो जब सेल lysate के साथ संयुक्त एक bioluminescence संकेत है जो जनसंख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं को दर्शाता है उत्पन्न कर सकते हैं का उपयोग करता है।
    1. Lyse कोशिकाओं एटीपी निकालने के लिए और एक एटीपी निगरानी अभिकर्मक का प्रयोग कर एक उत्पन्न करने के लिएluminescent संकेत निर्माता के निर्देशों के अनुसार। एक luminometer एक 96 अच्छी तरह से थाली स्वरूप के साथ संगत का उपयोग कर luminescence पढ़ें।
  6. वैकल्पिक # 3: व्यवहार्य कोशिकाओं से एक सूचक डाई के enzymatic कमी
    नोट: Resazurin आधारित assays सेल व्यवहार्यता के लिए अच्छे संबंध दिखाने।
    1. resazurin आधारित डाई के साथ संवर्धित कोशिकाओं का मिश्रण है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग assays यों।

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Representative Results

इस खंड में, हम एक VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 bioassay (परख के सिद्धांतों के लिए चित्रा 1 देखें) की आवश्यक सुविधाओं का प्रदर्शन एक प्रयोग के परिणाम बताते हैं। अन्य प्रकाशित अध्ययन विकल्प VEGFR -2 ligands, उत्परिवर्ती वीईजीएफ़ अणुओं और निरोधात्मक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 8,10,19,24-30 के लिए परख के व्यापक अनुप्रयोगों प्रदर्शित करता है।

यहाँ प्रस्तुत डेटा एक परख जिसमें VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 bioassay तीन पुनः संयोजक मानव ligands (वीईजीएफ़-ए 165, वीईजीएफ़-सी और वीईजीएफ़-डी) VEGFR के लिए विशिष्टता के साथ की गतिविधि यों इस्तेमाल किया जाता है का प्रतिनिधित्व -2 के लिए एक निरोधात्मक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (bevacizumab) की उपस्थिति में वीईजीएफ़-ए 165. डेटा वीईजीएफ़-ए 165 लड़का (चित्रा 2) के जवाब बनाम सामान्यीकृत किया गया है। जैसी कि उम्मीद थी, bevacizumab वीईजीएफ़-ए परख में 165 के प्रभाव अवरुद्ध है, लेकिनवीईजीएफ़-सी और वीईजीएफ़-डी की गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

परख की अर्द्ध मात्रात्मक संस्करण में या जब अपने विकास के दौरान परख देख, एक मानक उल्टे चरण माइक्रोस्कोप का उपयोग परख की प्रगति के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं परख देखने। जब VEGFR -2, जैसे, वीईजीएफ़-A के लिए मध्यम युक्त आईएल -3, या ligand के साथ incubated एक परख (चित्रा 3) के विश्लेषण से VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 bioassay कोशिकाओं की अच्छी व्यवहार्यता पता चलता है। इन कोशिकाओं को बड़े और पारदर्शी हैं, और सेलुलर कोशिका द्रव्य या संस्कृति में सेल मलबे में विघटन की कोई न्यूनतम या सबूत नहीं है। खैर कोई अतिरिक्त वृद्धि कारकों के साथ वहाँ पहले से ही कम सेल नंबर और कुछ स्वस्थ कोशिकाओं का सबूत है। वर्तमान कोशिकाओं उनके कोशिका द्रव्य में महत्वपूर्ण विघटन है और सेल मलबे संस्कृति के अनुरूप एक सुविधा है। 48 घंटे के बाद वहाँ व्यवहार्य कोशिकाओं के कोई संकेत नहीं है।


चित्रा 1. योजनाबद्ध आरेख VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 Bioassay के सिद्धांतों बताते। (ए) बीए / F3 कोशिकाओं कारक पर निर्भर कर रहे हैं और इस तरह के रूप में एक exogenous वृद्धि कारक की आवश्यकता होती है आईएल -3 के माध्यम से सेल के विकास / व्यवहार्यता प्रोत्साहित करने के लिए अंतर्जात आईएल -3 रिसेप्टर्स और जे ए संकेतन मार्ग। EpoR इन कोशिकाओं के बचाव में व्यक्त किया जाता है, तो भी जे ए मार्ग के माध्यम से हो सकता है। ऐसे VEGFR -2 सक्रियण के बहाव के लक्ष्य के रूप में कम से कम संकेतन में VEGFR-2 में परिणाम के रूप में एक पूरी लंबाई की रिसेप्टर tyrosine kinase की अभिव्यक्ति जे ए मार्ग संलग्न नहीं है। VEGFR -2 के बाह्य क्षेत्र EpoR की transmembrane और cytoplasmic क्षेत्रों से जुड़े हुए के साथ एक chimeric रिसेप्टर, विशिष्ट VEGFR -2 ligands के साथ प्रेरित जब बीए / F3 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट और, जम्मू एवं कश्मीर मार्ग को सक्रिय करने और सेल ड्राइविंग के लिए सक्षम हैअस्तित्व और प्रसार। (बी) VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 कोशिकाओं कैमेरिक VEGFR-2-EpoR रिसेप्टर जो प्रवाह cytometry का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है के महत्वपूर्ण स्तर व्यक्त करते हैं। एक बार जब आईएल -3 युक्त मध्यम से बाहर धोया, कोशिकाओं संस्कृति की स्थिति जो ड्राइव कोशिकाओं की या तो अस्तित्व / प्रसार की एक किस्म में रखा जाता है। Untransfected बीए / F3 कोशिकाओं या VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 कोशिकाओं विशिष्ट वृद्धि कारकों के बिना विकास / जीवित रहने के लिए असफल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2

चित्रा 2. VEGFR -2 एक माउस VEGFR-2-EpoR कल्पना व्यक्त VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 Bioassay। आईएल -3 निर्भर बीए / F3 कोशिकाओं में ligands के मूल्यांकन को छोड़कर (आईएल -3 बिना माध्यम में वरीयता प्राप्त थे के लिये+ आईएल -3 सबसेट, संकेत के रूप में) से अधिक मानव वीईजीएफ़-ए 165, वीईजीएफ़-CΔNΔC (वीसी) (इस मध्य क्षेत्र के होते हैं और और एन सी टर्मिनल propeptides शामिल नहीं है जो वीईजीएफ़-सी का एक रूप है), या वीईजीएफ़-DΔNΔC (इस जो मध्य क्षेत्र भी शामिल है और शामिल नहीं वीईजीएफ़-डी का एक रूप है और एन सी टर्मिनल propeptides (वी डी)) 100 एनजी / एमएल और humanized निष्क्रिय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी bevacizumab पर (जो बांधता है और वीईजीएफ़-ए रोकता है, लेकिन नहीं वीईजीएफ़-सी या वीईजीएफ़-डी), या गैर निष्क्रिय करने एंटीबॉडी त्रास्तुज़ुमाब, के रूप में 0.75 सुक्ष्ममापी पर संकेत दिया नियंत्रित करते हैं। एनएफ = कोई अतिरिक्त वृद्धि कारक युक्त मध्यम। अड़तालीस घंटे बाद, रिश्तेदार रहते सेल नंबर सेलुलर एटीपी के bioluminescence का पता लगाने का उपयोग मात्रा गया था। कार्यक्षेत्र सलाखों के साधन और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब की मानक त्रुटि (वीईजीएफ़-ए 165 हम अकेले हैं, पहली बार के जवाब बनाम सामान्यीकृत) प्रतिनिधित्व करते हैं। वी करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

चित्र तीन

चित्रा 3. VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 प्रकोष्ठों जीवन रक्षा के लिए बाह्य विकास कारकों पर निर्भर कर रहे हैं। VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 bioassay के उदाहरण जिसमें आईएल -3 निर्भर बीए / F3 कोशिकाओं को एक माउस व्यक्त VEGFR- 2-EpoR कल्पना मध्यम (ए) से युक्त 10% Wehi 3 ​​डी वातानुकूलित मध्यम कि आईएल -3, (बी) 100 एनजी / एमएल मानव वीईजीएफ़-ए 165 (कोई आईएल -3), या (सी) के साथ मध्यम प्रदान करता है में वरीयता प्राप्त थे कोई आईएल -3 या अतिरिक्त वृद्धि कारक है। संस्कृति, परख में 24 घंटा आईएल 3 (ए) या ​​वीईजीएफ़-ए 165 (बी) की उपस्थिति में अत्यधिक व्यवहार्य कोशिकाओं दिखा दर्शाया गया है, जबकि कोई आईएल -3 या अतिरिक्त वृद्धि कारक (सी) कोशिका मृत्यु के साथ संस्कृति में और लालuced व्यवहार्यता स्पष्ट रूप से स्पष्ट कर रहे हैं। तराजू सलाखों 100 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

परख यहाँ वर्णित है, जो विकास के कारकों पर निर्भर कर रहे हैं उच्च व्यवहार्यता की कोशिकाओं, के प्रयोग पर निर्भर करता है। कोशिकाओं इसलिए सुनिश्चित करें कि वे कारक पर निर्भर हैं, और कैमेरिक रिसेप्टर की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए सावधानी से सुसंस्कृत होने की जरूरत है। यह सुनिश्चित करना है कि मध्यम हौसले से बना है और एक जरूरत से ज्यादा लंबी अवधि के लिए और कहा कि Wehi 3 डी मुख्यमंत्री अत्यधिक सक्रिय महत्वपूर्ण है संग्रहीत नहीं। कोशिकाओं को अच्छी तरह सुनिश्चित करें कि कोई अवशिष्ट आईएल -3 जब बचाव ligands के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने परख contaminates परख माध्यम में आईएल -3 युक्त मध्यम से धोया जा करने की जरूरत है। ligands के विभिन्न रूपों की संख्या में आ सकता है के रूप में, ध्यान जब परख करने की क्रिया के लिए इन तैयारी उठाए जाने की जरूरत है। संरक्षक, विरोधी बैक्टीरियल एजेंट, नमक या अलग पीएच की बफ़र्स परख प्रभावित कर सकते हैं, और इस वजह से untransfected बीए / F3 कोशिकाओं के समानांतर परीक्षण बफर से संबंधित मुद्दों के बारे में सूचित कर सकते हैं।

हम दोनों अर्द्ध मात्रात्मक और मात्रात्मक प्रोटोकॉल का उपयोग करें। अर्द्ध quantitative परख से पहले एक पूरी तरह से मात्रात्मक परख जो अधिक समय और नमूने की आवश्यकता के लिए करने के लिए नमूने की गतिविधि के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। जब प्रकाशन के लिए डेटा पैदा मात्रात्मक विधि विशेष रूप से प्रयोग किया जाता है। संस्कृति की व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए वैकल्पिक तरीकों अपेक्षाकृत सीधा कर रहे हैं। मात्रात्मक परख प्रसार की मात्रा का ठहराव के लिए विभिन्न प्रारूपों के एक नंबर करने के लिए अनुकूलित किया गया है, और हम इस्तेमाल किया है (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-YL) -2,5-Diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) MTT 30, सेलुलर एटीपी (अप्रकाशित), resazurin आधारित डाई (चित्रा 2) और सफलता के साथ 3 एच thymidine 31 के bioluminescence का पता लगाने। हाल के वर्षों में हम विकिरण के उपयोग bioluminescence दृष्टिकोण अनुकूल करने के लिए दूर से विकसित किया है और इसकी लागत प्रभावशीलता के कारण resazurin आधारित डाई का इस्तेमाल किया है। दृष्टिकोण के सभी उचित परिणाम दे और विकल्प अभिकर्मकों की उपलब्धता और एक पर निर्भर हो सकता हैएक दिया प्रयोगशाला / संस्थान या विशेष दृष्टिकोण के साथ अपनेपन में विशेष प्लेट पाठकों ssociated।

समस्या निवारण परख के तीन मुख्य घटक है, मैं) आईएल 3 सेमी, द्वितीय) VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 कोशिकाओं और iii) उत्तेजक ligands की गतिविधि के आसपास घूमती है। प्रारंभिक संस्कृति में अपर्याप्त Wehi 3 डी कोशिकाओं, गरीब भंडारण की स्थिति, अत्यधिक फ्रीज विगलन चक्र या बहुत अधिक एक कमजोर पड़ने पर उपयोग करते हुए खराब बढ़ रही संस्कृतियों है कि परख प्रभावित होगा बना सकते हैं के कारण आईएल -3 मुख्यमंत्री में से गरीब स्तरों। यह आमतौर पर के रूप में सेल आबादी धीरे-धीरे बढ़ रही है, अपने सामान्य उज्ज्वल और गोल उपस्थिति खोने नियंत्रण कुओं में पता चला है। VEGFR-2-EpoR-बीए / F3 परख कोशिकाओं कैमेरिक निर्माण की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति समय के साथ यदि विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में रखा खो सकते हैं। तरल नाइट्रोजन के शेयरों की अच्छी संख्या को बनाए रखने अत्यधिक कैमेरिक रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं की ताजा संस्कृतियों हर समय उपलब्ध होने की अनुमति देता है। यदि आवश्यक हो, एक उच्च व्यक्त आबादी हो सकता हैVEGFR -2 ligands में कोशिकाओं बढ़ रही है और आबादी छँटाई प्रवाह cytometry द्वारा कैमेरिक रिसेप्टर के उच्च स्तर व्यक्त चयन करके हासिल की। इन कोशिकाओं को फिर आगे की ठंड के लिए संस्कृति में विस्तार कर रहे हैं।

तकनीक VEGFR -2 बाह्य डोमेन के साथ बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधाजनक और सरल विकल्प है, जबकि यह अधिक परिष्कृत प्रयोगों जहां प्राथमिक endothelial कोशिकाओं पर देशी रिसेप्टर अन्य VEGFRs, सह रिसेप्टर्स जैसे की उपस्थिति में जांच कर रहा है की जगह नहीं देखा जा सकता है neuropilins। कोशिकाओं जिस पर इस परख आधारित है (बी कोशिकाओं) endothelial कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं और इसलिए cytoplasmic संकेत दे रास्ते और प्रतिलेखन कारक है कि endothelial कोशिकाओं में VEGFR -2 सक्रियण का जवाब का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। फिर भी, विधि रिसेप्टर ligand बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तरीका है कि एक साधारण बाध्यकारी परख है कि एक स्थिर रिसेप साथ एक ligand की बातचीत की परख होती है के बीच स्थित है प्रदान करता हैटो, और बाध्यकारी रिसेप्टर के विश्लेषण और नीचे की ओर प्रभाव प्राथमिक endothelial कोशिकाओं को assays के बंधन में देखा (जैसे एक घुलनशील रिसेप्टर बाह्य क्षेत्र या एक रिसेप्टर बाह्य क्षेत्र से जुड़े हुए इम्युनोग्लोबुलिन के रूप में) का निर्माण किया। यह रिसेप्टर्स के बंधन और पार से जोड़ने, पहले दो चरणों जिसके द्वारा कई रिसेप्टर प्रकार tyrosine kinases आमतौर पर उनके संकेत पारगमन झरना आरंभ अनुमति देने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है। शैक्षिक और व्यावसायिक स्थितियों की एक संख्या में अपने आवेदन से पता चला है यह बाध्यकारी विशेषताओं की जांच के लिए एक उपयोगी परख के रूप में स्वीकार किया जाता है, खासकर जब संस्करण ligands या रिसेप्टर ligand बातचीत के अवरोधकों का मूल्यांकन।

परख भी रिसेप्टर बाह्य डोमेन के या उसके ligands के नए अवरोधकों के विश्लेषण के लिए उपयोगी है। परख आगे किया जा सकता है जल्दी से ligands या रिसेप्टर बाह्य क्षेत्रों जीनोमिक परिवर्तन के संदर्भ में देखा के वेरिएंट स्क्रीन करने के लिए (दोनों विरासत में मिला है और दैहिक) मानव जीई में पायाइस तरह के कैंसर 32,33 जैसे रोगों में एनईएस उनके कार्यात्मक परिणाम निर्धारित करने के लिए। इसलिए इस VEGFR -2 परख के आवेदनों भविष्य में विस्तार की संभावना है। इसके अलावा, सामान्य दृष्टिकोण इस परख अंतर्निहित कोशिका की सतह रिसेप्टर tyrosine kinases है, जो स्वास्थ्य और रोग में संकेतन अणुओं के एक बड़े और महत्वपूर्ण परिवार गठन के लिए अधिक मोटे तौर पर उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

स्टीवन ए स्टेकर और मार्क एम Achen Circadian टेक्नोलॉजीज लिमिटेड, एक कंपनी के विकास के कारकों में से वीईजीएफ़ परिवार को निशाना बनाने से चिकित्सा विज्ञान के विकास में शेयरधारकों हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 109 रिसेप्टर वीईजीएफ़ ligand अवरोध संकेत घुलनशील रिसेप्टर्स प्रोटीन वृद्धि कारक bioassay मोनोक्लोनल एंटीबॉडी
संवहनी endothelial वृद्धि कारकों की मूल्यांकन के लिए एक सरल Bioassay
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Stacker, S. A., Halford, M. M.,… More

Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

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