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Biology

Un bioessai simple pour l'évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

Published: March 15, 2016 doi: 10.3791/53867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Summary

Nous décrivons un test biologique simple, basée sur des cellules pour la détection, la quantification et le suivi de l'activité des membres de la famille du facteur de croissance endothélial vasculaire des ligands. L'essai utilise des récepteurs chimères exprimés dans une lignée cellulaire dépendant du facteur de fournir une évaluation semi-quantitative ou quantitative de la liaison au récepteur et la réticulation par le ligand.

Abstract

L'analyse des tyrosine kinases des récepteurs et leurs ligands impliqués dans l'interaction de la biologie vasculaire est souvent difficile en raison de l'expression constitutive de la famille des récepteurs apparentés, une large gamme de ligands associés et de la difficulté de traiter des cultures primaires de cellules endotheliales spécialisées. Nous décrivons ici un essai biologique pour la détection de ligands du facteur de croissance vasculaire endothélial récepteur-2 (VEGFR-2), un transducteur de signaux clés qui favorisent l'angiogenèse et la lymphangiogenèse. Un ADNc codant pour une fusion de la région extracellulaire (liaison de ligand) de VEGFR-2 avec les régions transmembranaires et cytoplasmiques du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR) est exprimée dans la lignée cellulaire dépendante du facteur de Ba / F3. Cette lignée cellulaire se développe en présence d'interleukine-3 (IL-3) et le retrait de ce facteur entraîne la mort des cellules dans les 24 heures. L'expression de la / EpoR fusion du récepteur VEGFR-2 fournit un autre mécanisme pour favoriser la survie et potentially prolifération de cellules Ba / F3 transfectées de façon stable en présence d'un ligand capable de se lier et de réticulation de la partie extracellulaire de la protéine de fusion ( par exemple, celui qui peut réticuler la région extracellulaire du VEGFR-2). Le test peut être réalisé de deux façons: une approche semi-quantitative dans laquelle de petits volumes de ligand et les cellules permettent un résultat rapide en 24 heures, et une approche quantitative impliquant des marqueurs de substitution d'un certain nombre de cellules viables. L'essai est relativement facile à réaliser, est très sensible à VEGFR-2 connus et peuvent accueillir des ligands inhibiteurs extracellulaires de VEGFR-2 de signalisation tels que des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur ou des ligands et des pièges de ligands solubles.

Introduction

La famille de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), les facteurs de croissance des protéines sécrétées et leurs congénères des récepteurs de surface cellulaire est un groupe important et diversifié de ligands solubles et des récepteurs de la membrane-embedded, respectivement cette fonction dans la transduction des signaux à travers les membranes cellulaires. Ils fonctionnent principalement dans les cellules endothéliales , mais également dans des cellules d'origine épithéliale et ceux du 1,2- du système immunitaire. Les voies de signalisation engagées par les récepteurs activés par des ligands VEGF (VEGFR) sont essentiels dans des pathologies majeures telles que la dégénérescence et le cancer maculaire liée à l'âge, et les thérapeutiques qui leur sont destinés sont en utilisation clinique fréquente (par exemple, le bevacizumab anticorps monoclonal qui cible VEGF-A) 3,4.

L'une des complexités de la famille de VEGF est la diversité des ligands solubles présents dans la nature (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, les protéines de VEGF codées par le orf de famille des virus parapox et venin de serpent VEGF, ainsi que d'autres inhibiteurisoformes du VEGF-A) 2.

Ces ligands interagissent avec les trois membres de la famille tyrosine kinase du récepteur, à savoir VEGFR-1, VEGFR-2 et VEGFR-3. Ces récepteurs sont variablement exprimés sur différents types de cellules , mais sont souvent co-exprimés sur la surface des cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins et lymphatiques de toutes tailles 5. VEGFR-2 peut se lier à des ligands de mammifère VEGF-A 6, le VEGF-C et VEGF-7 8,9 D ainsi que le virus orf VEGF 10 et 11 de venin de serpent VEGF. VEGFR-2 joue un rôle majeur dans l'angiogenèse (la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants) dans le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, le cancer et les maladies oculaires conduite. Dans ces contextes, les ligands tels que le VEGF-A, -C et -D se lient et activent le récepteur sur les cellules endothéliales vasculaires sanguines 12-15. Sur les cellules endothéliales lymphatiques, VEGFR-2 joue un rôle dans la lymphangiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques 16. VEGFR2 peut également favoriser la dilatation et de l' expansion des grandes artères et des vaisseaux lymphatiques dans les tissus et les maladies 17 sains. Une compréhension complète de VEGFR-2: interactions ligand est donc important pour le développement d'inhibiteurs pour une utilisation dans le traitement de maladies dépendantes de l' angiogenèse 18. Alors que la plupart des isoformes du VEGF-A se lient à VEGFR-2, le clivage protéolytique de VEGF-C et VEGF-D est nécessaire pour libérer un fragment constitué par le domaine VEGF-homologie qui présente la liaison à VEGFR-2 19,20 haute affinité.

Nous avons mis au point un test biologique pour surveiller les ligands de VEGFR-2 qui est conçu pour contourner la nécessité pour les cellules endothéliales primaires, qui sont techniquement difficiles à passage, coûteux à l' achat et de la culture (nécessitant moyen spécialisé) 21 et d' exprimer plusieurs VEGFR et co - associé 22 récepteurs. Hétérodimérisation de VEGFR-2 avec d'autres récepteurs du VEGF ou co-récepteurs peut provoquer la complexité indésirable lorsque l'on cherche à goujoninteractions y binaires récepteur-ligand, en évaluant l' activité attribuable à un récepteur spécifique, ou évaluant l'effet des réactifs inhibiteurs. 23. L'essai biologique conserve la mobilité du récepteur concerné dans la membrane cellulaire et permet d'évaluer la capacité d'un ligand à se lier et à réticuler la région extracellulaire de VEGFR-2.

L'essai biologique repose sur la création d'un récepteur chimère dans lequel la région extracellulaire d'un récepteur de VEGF (dans ce cas, VEGFR-2) est fusionnée à l'extrémité régions transmembranaires et intracellulaires du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR), un membre de la famille des récepteurs de cytokines 8,24. Cette protéine de fusion est ensuite exprimée dans la lignée cellulaire pro-B dépendant du facteur Ba / F3, sur lequel la stimulation avec un ligand capable de se lier et de réticulation du domaine extracellulaire du récepteur entraîne l'activation de la région effectrice cytoplasmique, qui est capable de transduire un signal de survie via Janus kinases (JAK) pour promouvoir la cellulela survie et / ou la prolifération. En revanche, l'expression de pleine longueur de VEGFR-2 dans le même type de cellules et la stimulation avec le ligand, ne favorise pas la survie et la prolifération cellulaire, ce qui indique que les effecteurs de signalisation proximale de la voie de VEGFR-2 ne sont pas disponibles dans ce type de cellule.

Nous avons utilisé le test dans une variété de contextes pour explorer la liaison de nouveaux VEGFR-2 ligands 10,19,20,24-29. En combinaison avec un essai / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, nous avons comparé les activités relatives du VEGF-C et les facteurs de croissance VEGF-D pour la liaison et la réticulation de VEGFR-2 et VEGFR-3 30. L'essai a été utilisé pour caractériser l'activité d' inhibition de la neutralisation des anticorps monoclonaux contre le VEGFR-2 ou VEGF-D, soluble dans VEGFR-2 et le piège peptidomimétiques ciblant la famille VEGF 31. L'essai a également été utilisé pour montrer la capacité de VEGF à partir de différentes souches de virus orf de lier et de cross-link VEGFR-2 avant le test dans les cellules endothéliales primaires 25 ou l' évaluation de la croissance de purification 27 facteurs.

L'essai, nous décrivons est facile à réaliser, et la version semi-quantitative permet des déterminations rapides qui sont parfois nécessaires lors de la surveillance de la production ou la purification des facteurs de croissance, des anticorps ou des domaines de récepteurs solubles pour d'autres expériences. La facilité d'utilisation de l'essai, il est un complément idéal à d'autres études et plus complètes réalisées avec des cellules endothéliales primaires dérivées de vaisseaux sanguins ou lymphatiques à partir de tissus spécifiques ou systèmes d'organes.

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Protocol

Moyenne Source de l'IL-3 et préparation de WEHI-3D-conditionné

Remarque: La lignée cellulaire de la leucémie myéloïde de la souris WEHI-3D ​​est mis en culture pour produire un milieu conditionné contenant l'IL-3.

  1. La culture des cellules WEHI-3D ​​en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 1% de supplément de glutamine de longue durée, 50 pg / ml de gentamicine. Inoculer 5 × 10 6 cellules en phase de croissance logarithmique dans 50 ml de milieu frais de culture dans un T175 cm 3 flacon de culture tissulaire et à croître pendant environ 7 jours ou jusqu'à ce que les cellules aient passé leur phase logarithmique de croissance d'environ 24 - 48 h (éviter la mort cellulaire excessive dans la culture). milieu conditionné est susceptible d'être stocké pendant plusieurs années à -20 ° C, de sorte que des lots de 200 - 500 ml peuvent être produits à un moment donné.
  2. Transvaser du fluide et des cellules provenant des flacons et centrifugation à 1000 x g pendant 15 min pour éliminer les cellules et les débris cellulaires. Enlever la partie supérieure de 90% de Supernatant. Filtrer à travers une unité de filtration de 0,22 pm.
  3. moyen aliquote WEHI-3D ​​conditionné (CM) dans 1 ml, 50 ml et 200 ml volumes de stockage à -20 ° C ou -70 ° C. De plus petites quantités aliquotes sont utiles pour la préparation de l'essai, les volumes intermédiaires pour la préparation du milieu de culture pour le passage des lignées cellulaires dépendantes de facteurs, et des volumes plus importants pour le stockage à long terme. IL-3 est relativement stable à 4 ° C milieu de sorte décongelée peut être stocké pendant quelques semaines si elle est utilisée dans des conditions stériles.
  4. En variante, en utilisant la souris recombinante d'IL-3 à des concentrations de 50 ng / ml dilués dans du milieu de culture, après avoir été filtré à travers une unité de filtration de 0,22 pm.

2. Culture et évaluation de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 et contrôle Ba / F3 lignées cellulaires

  1. les cellules Ba / F3 de contrôle de la culture dans le DMEM, 10% FBS, 50 ng / ml de gentamicine ou de la pénicilline / streptomycine supplément, 1% stabilisé L-glutamine et 10% WEHI-3D-CM. cellules Passage à 1:15 dilutions environ tous les trois jours à partir de cellulesde plus en plus en phase log.
  2. La culture des cellules VEGFR2 EpoR-Ba / F3 dans du DMEM, 10% de FBS, 50 pg / ml de gentamycine, 1% stabilisé L-glutamine et 10% WEHI-3D-CM et 1 mg / ml de G418. cellules Passage à 1:15 dilutions de cellules en croissance en phase logarithmique. Voir 24 pour plus de détails sur la construction et l' expression du récepteur chimère.
  3. le contrôle de la récolte Ba / F3 ou cellules / F3 VEGFR2-EpoR-Ba à partir de cultures mi phase logarithmique. pipeter doucement pour éliminer les cellules non adhérentes à partir du fond du flacon. Laver trois fois la tonicité de la souris une solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,3 (PBS) (10 ml, centrifuger à 750 x g pendant 5 minutes pour récupérer culot cellulaire) afin d' éliminer du milieu contenant IL-3.
  4. Laver les cellules une fois avec du DMEM et des additifs, sans WEHI-3D-CM ou recombinante d' IL-3, puis remises en suspension dans ce milieu à une concentration de 7,4 x 10 4 cellules / ml (soit 1.000 cellules par 13,5 ul, 10 000 cellules par 135 pi tel que déterminé par comptage en utilisant un hémocytomètre) pourutiliser dans les versions semi-quantitatives ou quantitatives du dosage respectivement.
  5. Évaluer les cellules pour la viabilité de bleu Trypan exclusion (ATTENTION). Mélanger Trypan Bleu dans du PBS (0,4%) 1: 1 avec la population de cellules et compter un minimum de 100 cellules sur un hémocytomètre. Les cellules qui prennent le colorant sont considérés comme morts ou mourants. Viabilité supérieure à 98% est nécessaire pour effectuer le dosage.

3. Dosage semi-quantitatif

  1. Ajouter des cellules lavées (1.000 cellules) contenues dans 13,5 ul de milieu IL-3 déficient dans les puits d'une plaque de microtitration 72 puits à température ambiante. Prendre soin de mélanger la suspension de cellules pendant aliquotage pour assurer sédimentation des cellules par gravité ne concentration cellulaire de polarisation. Utilisez un P20 automatisé pipette bien calibré, et des conseils autoclavés.
  2. Ajouter des échantillons et les groupes témoins aux puits à un volume de 10% (1,5 ul, ce qui rend un volume final de 15 ul contenant 1000 cellules par puits) à l'aide d'une pipette P20 calibrée ou, de préférence, P2 pipette. Prenez care pour garantir que les échantillons soient compatibles avec les conditions de culture des cellules Ba / F3 en termes de pH, de sel et d'autres substances potentiellement cytotoxiques / cytostatiques. Lorsque cela est possible, utiliser un milieu compatible ou un tampon (par exemple, DMEM ou PBS, respectivement) ou dilué dans un tel milieu ou tampon. La trituration avec la même astuce va assurer le mélange.
  3. Pour les échantillons témoins, y compris: (i) le milieu seul, ne contenant pas d'IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM ajouté à un milieu seul à 10% volume final; et / ou (iii) le VEGF-A diluée à 100 ng / ml dans du milieu seul, sans addition d'IL-3.
  4. Remplissez tous les puits non utilisés de la plaque de micropuits avec de l'eau stérile, PBS ou moyenne et placer la plaque dans un conteneur humidifié (avec de l'eau imbibé du papier de soie) permettant les échanges gazeux. Incuber les cellules dans les récipients dans une atmosphère humidifiée de 10% de CO 2. Ce test peut être confortablement installé dans 3 h par une seule personne, si des échantillons d'essai et les composants des médias sont disponibles.
  5. Évaluer les plaques généralement après 16 heures deincubation à laquelle la discrimination de temps entre les échantillons positifs et négatifs est évidente. Voir Figure 3 pour des exemples de la façon dont les cellules apparaissent dans la culture. Analyser les plaques en utilisant un inversé à contraste de phase microscope standard à 40-100 × grossissement.
    Remarque: Les puits contenant des facteurs de croissance favorables telles que l'IL-3 ou du VEGF-A contient des cellules qui apparaissent rondes et translucides. Puits sans facteurs de croissance favorables ou avec le milieu seul aura une diminution du nombre de cellules rondes, ainsi que des cellules mortes ou mourantes et de débris cellulaires (par exemple, la figure 3C). L'évaluation de l'essai à 24-48 heures après l'incubation est l'optimum pour la sensibilité.

4. Quantitative bioessai

  1. Ajouter des cellules lavées (10.000 cellules dans 135 pi) dans IL-3-deficient moyen des puits d'une plaque à 96 puits de microtitration standard à RT. Prenez soin de mélanger la suspension cellulaire pendant aliquotage pour assurer décantation cellulaire par gravité n'a pas d'incidence CEconcentration II.
  2. Ajouter des échantillons et les groupes témoins aux puits à un volume de 10% (15 ul) à l'aide d'une pipette calibrée (P20). Veillez à ce que les échantillons sont compatibles avec les conditions de culture des cellules Ba / F3 en termes de pH, de sel ou d'autres substances potentiellement cytotoxiques / cytostatiques. Lorsque cela est possible, utiliser un milieu compatible ou un tampon (par exemple., DMEM ou PBS) ou dilué dans un tel milieu ou tampon. Stériliser par filtration à l'aide d'un faible volume d'acétate de cellulose unité de filtre à tube centrifuge pores de 0,22 pm.
  3. Laisser incuber le mélange de cellules, les facteurs de croissance et / ou inhibiteur d' agents dans une atmosphère humidifiée de 10% de CO2 pendant 48 heures. Effectuer le test dans un conteneur humidifié qui a du papier de soie imbibé d'eau et permet d'échange de gaz. A la fin de la période d'incubation, on évalue l'essai avec l'une des méthodes alternatives listées ci-dessous, qui sont des marqueurs de substitution du nombre de cellules viables dans le puits.
  4. Alternative # 1: 3 H-thymidine Incorporation
    Remarque: Cette quantification est conçu pour le format de plaque à 96 puits.
    1. Après incubation des plaques d'essai pendant 48 heures à 37 ° C (volume de 150 ul par puits), ajouter 3 H-thymidine dans un volume de 50 pi de milieu d'essai (Ba / F3 milieu de culture sans IL-3 / WEHI-3D ​​CM) par puits à une concentration de 20 pCi / ml, donnant une dose finale de 1 pCi par puits.
    2. Incuber les plaques pendant 4 heures à 37 ° C avant la récolte des cellules en utilisant un récolteur de cellules. Extraire des échantillons individuels en plaçant les filtres de scintillation et de quantifier avec un compteur à scintillation liquide.
  5. Alternative # 2: bioluminescence Détection de Cellular ATP
    Remarque: Cette approche utilise un réactif de contrôle de l'ATP qui, lorsqu'il est combiné avec le lysat cellulaire peut générer un signal de bioluminescence qui reflète les cellules viables dans la population.
    1. lyser les cellules afin d'extraire l'ATP et l'utilisation d'un réactif de surveillance de l'ATP pour produire unle signal luminescent selon les instructions du fabricant. Lire la luminescence en utilisant un luminomètre compatible avec un format de plaque à 96 puits.
  6. Alternative # 3: Réduction enzymatique d'un colorant indicateur par des cellules viables
    Remarque: des analyses basées résazurine montrent une bonne corrélation avec la viabilité cellulaire.
    1. Combiner des cellules cultivées avec le colorant à base de résazurine et de quantifier les essais en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence selon les instructions du fabricant.

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Representative Results

Dans cette section, nous montrons les résultats d'une expérience démontrant les caractéristiques essentielles d'un bioessai VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (voir la figure 1 pour les principes de l'essai). D' autres études publiées démontrent des applications plus larges de l'essai pour d' autres VEGFR-2 ligands, molécules de VEGF mutantes et des anticorps monoclonaux inhibiteurs 8,10,19,24-30.

Les données présentées ici représentent un dosage dans lequel la / F3 biodosage VEGFR-2-EpoR-Ba est utilisé pour quantifier l'activité des trois ligands humains recombinants (VEGF-A 165, VEGF-C et VEGF-D) avec une spécificité pour VEGFR -2 , en présence d'un anticorps monoclonal inhibiteur (bevacizumab) le VEGF-A 165. les données ont été normalisées par rapport à la réponse au VEGF-A 165 seul (figure 2). Comme on s'y attendait, le bevacizumab bloque l'effet du VEGF-A 165 dans l'essai, maisn'a eu aucun effet sur l'activité du VEGF-C et VEGF-D.

Dans la version semi-quantitative de l'essai ou en observant l'essai au cours de son développement, la visualisation de l'essai à l'aide d'un microscope de phase standard inversé peut fournir des informations précieuses sur l'état d'avancement de l'essai. Une analyse d'un essai (figure 3) montre la bonne viabilité du VEGFR-2-Ba-EpoR / cellules d'essais biologiques F3 lorsqu'elles sont incubées avec un milieu contenant IL-3, ou d'un ligand pour VEGFR-2, par exemple, le VEGF-A. Ces cellules sont grandes et translucide, et il n'y a pas ou peu de preuves de granularité dans le cytoplasme cellulaire ou de débris cellulaires dans la culture. Dans le puits sans facteurs de croissance supplémentaires, il existe déjà des preuves du nombre de cellules réduites et quelques cellules saines. Cellules présentes ont une granularité importante dans leur cytoplasme et les débris cellulaires est une caractéristique constante de la culture. Après 48 heures, il n'y a aucun signe de cellules viables.


Figure 1. Schéma décrivant les principes du VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioessai. (A) Des cellules Ba / F3 sont des facteurs dépendant et nécessitent un facteur de croissance exogène tel que l' IL-3 pour stimuler la croissance cellulaire / viabilité par endogènes des récepteurs IL-3 et de la voie de signalisation JAK. Si EpoR est exprimé dans ces cellules de sauvetage peuvent également se produire par la voie JAK. Expression d'une pleine longueur du récepteur tyrosine kinase tels que VEGFR-2 résultats dans la signalisation minimale en tant que cibles en aval de VEGFR-2 activation n'engagent pas la voie JAK. Un récepteur chimère avec la région extracellulaire de VEGFR-2 fusionnée aux régions transmembranaires et cytoplasmiques de EpoR, lorsqu'il est transfecté dans des cellules Ba / F3 et stimulées avec VEGFR-2 ligands spécifiques, est capable d'activer la voie JAK et la cellule d'entraînementla survie et la prolifération. (B) cellules / F3 VEGFR-2-EpoR-Ba expriment des niveaux élevés du récepteur VEGFR-2-EpoR chimérique qui peut être quantifié par cytométrie de flux. Après lavage de l'IL-3 contenant du milieu, les cellules sont placées dans une variété de conditions de culture qui conduisent soit la survie / prolifération des cellules. Cellules Ba / F3 non transfectées ou VEGFR-2-EpoR-cellules Ba / F3 sans facteurs de croissance spécifiques ne parviennent pas à se développer / survivre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2

Figure 2. Evaluation de VEGFR-2 dans les Ligands / F3 cellules / F3 VEGFR-2-EpoR-Ba analyse biologique. IL-3 dépendant de Ba exprimant une souris VEGFR-2-EpoR chimères ont été ensemencées dans un milieu sans IL-3 ( à l' exception pourle + IL-3 sous - ensemble, comme il est indiqué) plus VEGF-A humain 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (ce qui est une forme de VEGF-C qui comprend la région centrale et ne comprend pas les propeptides N et C-terminales) ou VEGF-DANAC (ce qui est une forme de VEGF-D qui comprend la région centrale et ne comprend pas les propeptides N et C-terminales (VD)) à 100 ng ml et humanisés neutralisant l'anticorps monoclonal bevacizumab / (qui se lie et inhibe le VEGF-a, mais pas VEGF-C ou VEGF-D), ou contrôler non-anticorps neutralisants trastuzumab, comme il est indiqué à 0,75 uM. NF = milieu contenant pas de facteurs de croissance supplémentaires. Quarante-huit heures plus tard, le nombre relatif de cellules vivantes a été quantifiée en utilisant une détection par bioluminescence de l'ATP cellulaire. Les barres verticales représentent des moyens (normalisés par rapport à la réponse au VEGF-A 165 seul, premier bar) et l' erreur standard de la moyenne de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.

Figure 3

Figure 3. Cellules VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 sont dépendantes de facteurs de croissance externe pour la survie. Des exemples de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 bioessai dans lequel les cellules / F3 IL-3-dépendants Ba expriment une souris VEGFR 2-EpoR chimères ont été ensemencées dans du milieu (A) contenant 10% WEHI-3D ​​moyen qui fournit l' IL-3, (B) à 100 ng / ml de VEGF-A 165 (pas d' IL-3), (C) un milieu humain avec conditionnée aucun des facteurs de croissance supplémentaires ou d'IL-3. La culture est représenté 24 h dans l'essai montrant des cellules hautement viables en présence d'IL-3 (A) ou VEGF-A 165 (B), tandis que , dans la culture sans (C) , la mort cellulaire facteurs de croissance supplémentaires de l' IL-3 ou et rougeuced viabilité sont clairement. Balances barres sont 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'essai décrit ici repose sur l'utilisation de cellules de grande viabilité, qui dépendent des facteurs de croissance. Les cellules doivent donc être soigneusement cultivées pour assurer qu'ils sont le facteur de charge, et de conserver l'expression du récepteur chimérique. Veiller à ce que le milieu est fraîchement préparé et non stocké pendant une période excessivement longue et que WEHI-CM 3D est très actif est important. Les cellules doivent être soigneusement lavés à partir de IL-3 dans un milieu contenant le milieu de dosage pour assurer qu'aucun résidu de l'IL-3 contamine l'essai en exposant les cellules aux ligands sauvetage. Comme ligands peuvent venir dans un certain nombre de formes différentes, des précautions doivent être prises lors de la préparation de ces pour analyse. Préservatifs, des agents anti-bactériens, de sel ou des tampons de pH différents peuvent affecter le dosage, ce qui est la raison pour laquelle l'essai en parallèle des cellules Ba / F3 non transfectées peut informer sur les questions liées tampons.

Nous utilisons à la fois les protocoles semi-quantitatives et quantitatives. La demi-quantitative test permet une évaluation rapide de l'activité des échantillons avant de commettre à un test totalement quantitatif qui nécessite plus de temps et de l'échantillon. La méthode quantitative est utilisée exclusivement lors de la génération de données pour publication. Les méthodes alternatives de détection de la viabilité de la culture sont relativement simples. Le dosage quantitatif a été adaptée à un certain nombre de formats différents pour la quantification de la prolifération, et nous avons utilisé (3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium) MTT 30, la détection de la bioluminescence de l' ATP cellulaire (non publié), colorant à base de résazurine (Figure 2) et 3 H-thymidine 31 avec succès. Au cours des dernières années, nous avons évolué loin de l'utilisation des rayonnements pour adapter les approches de bioluminescence et avons utilisé le colorant à base de résazurine-en raison de son rapport coût-efficacité. Toutes les méthodes donnent des résultats appropriés et le choix peut dépendre de la disponibilité de réactifs et unssociated lecteurs de plaques spécialisées dans un laboratoire / institut ou la familiarité donnée avec des approches particulières.

Dépannage tourne autour de l'activité des trois principales composantes de l'essai, i) IL-3 CM, ii) des cellules VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 et iii) des ligands stimulants. faibles niveaux de IL-3 en CM en raison de l'insuffisance des cellules WEHI 3D dans la culture initiale, mauvaises conditions de stockage, les cycles de gel-dégel excessifs ou en utilisant à une trop forte dilution peut créer des cultures mal croissantes qui entravent le dosage. Ceci est habituellement détecté dans les puits de contrôle comme des populations de cellules à croissance lente, perdant leur aspect brillant et rond normal. VEGFR-2-EpoR-Ba / cellules de test F3 peut perdre l'expression de surface cellulaire de la construction chimérique au fil du temps si elles sont conservées en culture pendant des périodes prolongées. Le maintien d'un bon nombre de stocks d'azote liquide permet des cultures fraîches de cellules exprimant fortement le récepteur chimérique d'être disponible à tout moment. Si nécessaire, une population exprimant élevée peut êtreobtenue par croissance de cellules dans VEGFR-2 ligands et la sélection de la population exprimant des taux élevés du récepteur chimère par cytométrie de flux de tri. Ces cellules se sont ensuite développées en culture pour la congélation.

Bien que la technique est une alternative pratique et simplifié pour l'analyse des interactions avec le domaine extracellulaire de VEGFR-2, il ne peut pas être vu de remplacer des expériences plus sophistiqués où le récepteur natif sur les cellules endothéliales primaires est sondé en présence d'autres VEGFR, des co-récepteurs tels que neuropilines. Les cellules sur lesquelles se fonde cette analyse (cellules B) sont distincts des cellules endothéliales et ne devraient donc pas être utilisés pour étudier les voies de signalisation cytoplasmiques et des facteurs de transcription qui répondent à VEGFR-2 activation dans les cellules endothéliales. Néanmoins, le procédé fournit une méthode utile pour analyser l'interaction récepteur-ligand qui se situe entre un dosage de liaison simple qui examine l'interaction d'un ligand avec un récep immobilisétor construction (par exemple une région extracellulaire du récepteur soluble ou une région extracellulaire du récepteur fusionné à une immunoglobuline) et l'analyse de la liaison aux récepteurs et les effets en aval observés dans des essais sur des cellules endothéliales primaires de liaison. Il fournit un système pour permettre la liaison et la reticulation des récepteurs, les deux premières étapes par lesquelles de nombreuses tyrosine kinases de type récepteur initié couramment leur cascade de transduction du signal. Son application dans un certain nombre de milieux universitaires et commerciaux a montré qu'elle est acceptée comme un test utile pour examiner les caractéristiques de liaison, en particulier lors de l'évaluation des ligands variants ou inhibiteurs de l'interaction récepteur-ligand.

Le dosage est également utile pour l'analyse de nouveaux inhibiteurs du domaine extracellulaire du récepteur ou de ses ligands. Le dosage peut être encore utilisé pour cribler rapidement des variantes des ligands ou des régions extracellulaires du récepteur vu dans le contexte des mutations génomiques (aussi bien héritées et somatique) trouvés dans le ge humainnda dans des maladies telles que le cancer 32,33 pour déterminer leur conséquence fonctionnelle. Par conséquent, les applications de ce VEGFR-2 test sont susceptibles de se développer dans l'avenir. En outre, l'approche générale qui sous-tend ce test peut être utilisé plus largement pour les tyrosine kinases des récepteurs de surface cellulaire, ce qui constitue une grande et importante famille de molécules dans la santé et la maladie de signalisation.

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Disclosures

Steven A. Stacker et Marc M. Achen sont actionnaires de Circadian Technologies Ltd., une société de développement thérapeutique en ciblant la famille de VEGF de facteurs de croissance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer
G418 Sulphate (Geneticin) Invivogen ant-gn-5 Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.
3H-Thymidine PerkinElmer NET-027 This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit Lonza LT07-221 Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent
Prestoblue Cell Viability Reagent Invitrogen A13261 Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell
Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) Thermo Scientific 136528 Small microtitre plate
96 well Tissue Culture Plate Falcon, Corning Inc. 353072
DMEM (1X) Gibco 11965-92
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
Fetal Bovine Serum Gibco  10099-141
Cell Harvester Tomtec Life Sciences Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester
Liquid Scintillation Counter LKB Wallac 1205 LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter
UniFilter-96 GF/B Perkin Elmer 6005177 White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize
Gentamicin Gibco, Life Technologies 15750-060
Penicillin/Streptomycin Gibco, Life Technologies 15140-122
0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit Costar, Corning Inc. 8160 Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube.
Fluorescence Reader BioTek BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader 

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References

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Biologie cellulaire numéro 109 le récepteur VEGF un ligand un inhibiteur de signalisation de récepteurs solubles le facteur de croissance protéique essai biologique l'anticorps monoclonal
Un bioessai simple pour l'évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire
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Stacker, S. A., Halford, M. M., Roufail, S., Caesar, C., Achen, M. G. A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors. J. Vis. Exp. (109), e53867, doi:10.3791/53867 (2016).

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