Protocol
禽流感胚胎不在IUCAC法规考虑脊椎动物。
1.获取外科手术胚胎
- 孵育80 - 在一个加湿（60％）的摇杆培养箱90受精Bovan鸡卵（钝端上）在40℃下大约72小时在哈密尔顿和汉堡（11H）阶段获得的胚胎17确定基于鸡蛋的确切数目功耗分析和胚胎17的成活率。使用塑料托盘鸡蛋孵化，以便有足够的空气流通。
- 一旦这个期望发育阶段被获得，倒入约20ml温水（37℃）的Tyrode缓冲液（补充有碳酸氢钠（1克/升））的成100毫米×26毫米的培养皿。
- 消毒用70％乙醇蛋壳。
- 破解轻轻用手术刀手柄的外壳和精心释放其内容为包含台氏缓冲的菜。丢弃如果胚胎（i）它们在视觉上出现异常（ⅱ）它们未在合适的发育阶段（ⅲ）它们不正确定向在蛋黄和/或（iv）任何出血发生。保留未进行手术的任何胚胎在40℃放置前卵 ，以便不损害发展之后。
注：分期是根据汉密尔顿和汉堡18进行。鸡胚异常通过肉眼而根据解剖范围来确定。确保胚胎有适当的折叠和弯曲和血管。
2. OFT捆扎
- 从单一的11/0尼龙手术缝合Tweeze有个别长1厘米的线程，形成一个松散的结。紫外线消毒所有预制节。
- 在解剖镜下，在视觉上保证心脏以正常速度（〜120次/分）击败。如果不是，丢弃的胚胎。
- 刚好手术前，应用5 - 第6毫升温（37℃）台氏缓冲液中，使用移液管胚胎表面。
- 通过预形成的结中的一个自由端OFT下，在OFT /心室结（OVJ）（或期望的位置）缝线定位，和自由端通入结从而缩窄OFT包括围绕心脏的膜。
- 手术后，湿蛋黄的表面5 - 第6毫升的温用移液管（37℃）蒂罗德缓冲液中。
- 保持控制胚胎前大毛作为带状胚胎;然而，不使其受到了外科手术。
- 在加湿（60％）培养箱孵育胚胎，对时间的期望的量，在40℃。
- 一旦达到所希望的时间点，切除从使用直剪刀蛋黄胚胎。用细镊子解剖的心脏，并使用了几个下游的研究，如心脏形态，由于血流动力学改变17的变化。
3.确认捆扎干预导致血流动力学中的变更
注意：所引起的条纹干涉的部分收缩导致在OVJ增加血流速度。此血液动力学参数是使用二维超声成像，这是在实验的所需时间点上执行方便评估。
- 由于只有单个的胚胎可以一次成像，保持在40℃的培养箱中指定用于超声成像的所有其它胚胎。
- 放置在设定在40℃的加热垫待成像含有胚胎的培养皿。
- 填写的菜，到边缘，用温水（37℃）台氏缓冲区。慢慢倒入缓冲溶液放入盘中，以便保持蛋黄完好无损。然而，如果蛋黄的完整性在该步骤中受到损害，丢弃胚胎。
- 东方胚胎，使得胚胎的中心轴是垂直于从一个可调节的支架悬浮超声波探头。
- 随着超声机歌剧亭在B模式，获得跳动的心脏在屏幕上的2D图像和移动台（加热板），使得OFT，心室和OVJ都清晰可见。
- 切换到脉冲波（PW）模式，在所需的脉冲重复频率（ 例如 ，20千赫），并在OVJ准确获得速度数据。在屏幕上得到心脏跳动的B模式图像。
- 移动舞台上看到的OFT，心室和OVJ。使用超声波机软件，获得准确的OVJ速度测量。
请注意：如果一个胚胎的心脏速率成像期间降低，这样获得的速度数据不应该被用于分析。用于速度测量所有胚胎应优选地不被用于超声成像后的任何其它实验。
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Representative Results
如图1中所示，建议需要OFT绑扎工具。含有胚胎的前培养皿（ 图1A） 卵内应该足够深，以便当与盖覆盖，以不破坏胚胎。深培养皿（ 图1C）应也可用于超声成像以允许台氏缓冲液的适当体积要浇卵黄顶上。
单1厘米螺纹（ 图2A）是从11/0尼龙线（ 图1A）tweezed出来，绑成一个松散的结（ 图1B）。所有预形成结部被紫外线消毒。 图3A示出的潮湿摇杆室，在这里已受精的鸡卵孵育直至所需的阶段。 图3B示出一个胚胎孵化器，其中，带状和对照胚胎保持前卵
示于图4A是在蛋黄前卵 。 图4B的顶部HH17胚胎是显示在一个HH17胚胎的OVJ缝线（带）的位置的示意图。 图4C是成像的带状胚胎的代表图像手术后48小时。
通过缩颈部位的血流速度绑扎干预的效果是通过二维超声成像测量的。正如所料，在OVJ速度是在带状胚胎相对于对照（ 图5）更高。我们最近在示出的血流速度和壁剪切应力17 OFT绑扎效果的24小时的时间点上执行带状并控制心计算流体动力学（CFD）分析。
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图1.手术器械。（A）11/0尼龙线。（B）含预成型结培养皿。（C）深培养皿为前卵胚胎培养和超声成像（D）移液管。（E）解剖刀刀把破解鸡蛋壳。（F）胚胎切除手术后研究直剪。（G）细镊子请点击此处查看该图的放大版本。
图2.缝合OFT捆扎。 （A）单1厘米线从缝合tweezed出来。
图3.培养室。 （A）加湿摇杆孵化受精卵。（B）为前OVO带状和控制胚胎文化湿盒。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. OFT捆扎。 （一）所有HH17鸡胚保持前大毛 ，比例尺= 10毫米（B）示意图描绘了收缩网站（红色）。（C）杀鸡取卵胚胎后OFT绑扎成像48小时，比例尺为0.5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.超声衍生速度测量。（A）的控制和（B）的代表性速度分布的带状在1小时的时间点获得的胚胎。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这种技术是相对快速和容易执行，然而某些关键点需要牢记以便获得准确的下游结果。胚胎应保持前卵在包含蒂罗德缓冲以提供足够的补液的培养皿。同样重要的是水合蛋黄手术后与台氏缓冲液，以确保孵育室充分水合。手术不应该在胚胎如有出血可见或蛋黄甚至略有破损进行。这将影响胚胎存活率，特别是对于长期的实验。杀伤力的胚胎另一个潜在原因，是各地OFT乐队是否太紧时首次应用，从而显著影响心脏功能。
目前，我们使用超声波作为一种验证工具，在OFT绑扎确定血流速度的变化。在未来，我们将确认采用微型计算机断层扫描（CT）。我们也直观地判断周围的B型2D图像OFT带松紧度。重要的是，心脏率和体积流量（采用CFD计算）无显着差异是在杀鸡取卵组和对照组17之间的胚胎观察。这些表明，对心血管系统的生理在带状胚胎不受损害，从而进一步证实了绑扎干预。
在期望的时间点，绑扎后，几个分析可以被执行以了解改变血液动力学的上临界阀发育过程的影响。这些包括，但不限于，确定在所涉及的阀发展关键的调节基因的转录水平的变化，确定ECM成分的定位和确定OFT超微结构。
最后，该技术改进了在窗口蛋19内的胚胎绑扎的OFT的当前方法。这种方法是严重由立法院不能妨碍积累必要的胚胎做下游分子分析。这种新技术可以在救援实验中使用为好。该应用程序允许OFT带状被救出和胚胎允许从侮辱恢复。没有电流方法可以做到这一点，并仍然能够执行统计学显著下游分析。
我们已成功地使用这种技术在非常早的发育阶段（HH 16 - 17），以改变在鸡胚的心脏血液动力学的刺激。在执行发展后期的手术时，带协议可能会提出一个挑战，因为切口的胚外血管的风险。另外，在发展的后期，它往往很难保持卵黄囊完好时蛋内容物转移到培养皿。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
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