Protocol
Kuş embriyolar IUCAC yönetmelikleri uyarınca omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmez.
1. Cerrahi Embriyolar Alınması
- 80 inkübe - Hamilton ve Hamburger (HH) aşamasında embriyolar elde etmek için yaklaşık 72 saat boyunca 40 ° C'de bir nemlendirilmiş (% 60) rocker inkübatör 90 döllenmiş Bovan tavuk yumurtası (kör uç yukarı) 17. dayalı yumurta sayısını tam olarak belirlemek güç analizi ve embriyoların 17 sağkalım oranı. yeterli hava dolaşımı sağlamak için inkübasyon için plastik yumurta tepsileri kullanın.
- Bu istenilen gelişimsel aşamada elde edildikten sonra, 100 mm x 26 mm Petri kabı içine yaklaşık 20 ml (sodyum bikarbonat (1 g / L) ile desteklenmiş) Sıcak (37 ° C), Tyrode tampon dökün.
- % 70 etanol ile bir yumurta kabuğu sterilize edin.
- Yavaşça neşter sapı ile kabuk çatlak ve dikkatle Tyrode tampon içeren çanak içine içeriğini bırakın. onlar görsel görünür eğer embriyolar (i) atın anormal (ii)Sağ gelişim aşamasında (iii) yanlış sarısı ve / veya (iv) herhangi bir kanama meydana üzerine odaklı değil. Hemen gelişimi uzlaşma şekilde 40 ° C 'de ex ovo yerleştirildikten sonra cerrahi tabi herhangi bir embriyolar saklayın.
Not: Takma Hamilton ve Hamburger 18 dayanarak yapılır. civciv embriyo anormallik çıplak gözle ve diseksiyon kapsamında belirlenir. Embriyo, uygun katlama ve büküm ve damarsal olduğundan emin olun.
2. OFT Bantlama
- Tek 11/0 naylon cerrahi dikiş tek tek 1 cm uzunluğunda konuları dışarı tweeze ve gevşek bir düğüm oluşturur. Tüm önceden oluşturulmuş knot sterilize UV.
- Diseksiyon mikroskobu altında, görsel kalp normal hızında (~ 120 atım / dk) yenerek emin olun. Değilse, embriyo atın.
- Bir transfer pipet kullanarak embriyo yüzeyine sıcak (37 ° C) Tyrode tampon 6 ml - Sadece ameliyattan önce, 5 uygulayın.
- , OFT altında önceden düğüm bir serbest ucunu geçirin OFT / ventrikül kavşak (OVJ) (ya da istenilen yere) at dikiş yerleştirin ve böylece kalbi çevreleyen zarların dahil OFT daraltıcı düğüme serbest ucunu geçmektedir.
- Sıcak 6 ml (37 ° C) Tyrode tampon bir transfer pipet kullanarak - Ameliyattan sonra 5 ile sarısının yüzeyini ıslak.
- Kontrol embriyolar bantlı embriyolar olarak ex ovo korumak; Ancak cerrahi onları maruz bırakmayın.
- nemlendirilmiş (% 60) kuluçka makinesi içinde 40 ° C 'de, arzu edilen bir zaman miktarı için, embriyolar inkübe edin.
- İstenilen zaman noktası ulaşıldığında, düz makas kullanarak sarısından embriyo tüketim. Ince forseps ile kalbi incelemek ve bu nedeniyle değişmiş hemodinami 17 kardiyak morfoloji değişiklikleri gibi birçok aşağı çalışmalar için kullanın.
3. Yapıştırma Müdahale Hemodinamiğin bir değişikliğe neden olduğunu onaylama
Not: bantlama müdahalesiyle kısmen daralma OVJ kan akış hızında bir artışa neden olur. Bu parametrelerden uygun deney istenen bir zaman noktasında gerçekleştirilir 2D ultrason görüntüleme kullanılarak değerlendirilir.
- yalnızca tek bir embriyo, bir zaman görüntülenebilir için, 40 ° C kuluçka makinesi içinde ultrason görüntüleme için belirlenmiş diğer embriyolar korur.
- embriyolu petri 40 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı görüntülenmek üzere yerleştirin.
- Sıcak (37 ° C) Tyrode tampon ile, ağzına kadar, çanak doldurun. sağlam yumurta sarısı tutmak için çok yavaş çanak içine tampon çözelti dökün. Bununla birlikte, yumurta sarısı bütünlüğü, bu adım sırasında tehlikeye, embriyo atın.
- embriyonun merkezi ekseni ayarlanabilir bir standdan süspansiyon haline ultrason probu dik olacak Orient embriyo gibi.
- ultrason makinesi opera ileting B-modunda, ekranda kalpte bir 2D görüntü elde ve OFT, ventrikül ve OVJ açıkça görülebilir şekilde aşama (ısıtma yastığı) hareket ettirin.
- İstenilen darbe tekrarlama frekansı (örneğin, 20 kHz) de, darbeli dalga (PW) moduna geçmek ve OVJ tam olarak hız verileri elde. kalpte bir B-mod görüntü ekranda elde edilir.
- OFT, ventrikül ve OVJ görmek için sahne taşıyın. ultrason makinesi yazılımı kullanarak, tam OVJ de hız ölçümleri elde edin.
Not: embriyonun kalp hızı görüntüleme sırasında azalırsa, bu şekilde elde edilen hız veri analizi için kullanılmamalıdır. Hız ölçümleri için kullanılan tüm embriyolar, tercihen ultrason görüntüleme ile başka deneyler için kullanılmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de gösterildiği OFT bantlama için gerekli araçları tavsiye edilir. Kapakla kapatıldı embriyo yok etmeyecek şekilde embriyo eski ihtiva eden petri (Şekil 1A) ovo yeterince derin olması gerekmektedir. Derin Petri kutuları (Şekil 1C), aynı zamanda Tyrode tamponu yeterli miktarda sarısı üstüne döküldü izin vermek için, ultrason görüntüleme için kullanılmalıdır.
Tek bir 1 cm iplik (Şekil 2A) 11/0 naylon sütür (Şekil 1A) dışarı tweezed ve gevşek bir düğüm (Şekil 1B) içine bağlıdır. Tüm önceden oluşturulmuş knot UV sterilize edilir. Şekil 3A döllenmiş tavuk yumurtası, istenen aşamasına kadar inkübe edilir nemlendirilmiş bir rocker odasını göstermektedir. Şekil 3B bantlı ve kontrol embriyolar ovo ex tutulur bir embriyo kuluçka gösterir
Şekil 4A'da gösterilen sarısı ex ovo. Şekil 4B'de üstünde HH17 embriyo HH17 embriyo OVJ de dikiş (bant) konumunu gösteren şematik bir temsilidir olmasıdır. Şekil 4C görüntülü bantlı embriyo Örnek resimdir ameliyat sonrası 48 saat.
daralma sitesi aracılığıyla kan akım hızına bant müdahalenin etkisi 2B ultrason görüntüleme ile ölçülür. Beklendiği gibi, OVJ hızın kontrol (Şekil 5) göre bantlı embriyo daha yüksektir. Biz son zamanlarda OFT kan akım hızı ve duvar kayma gerilmesi 17 bantlama etkilerini gösteren 24 saat zaman noktasında bantlı ve kontrol kalpleri üzerinde hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) analizi gerçekleştirdik.
<keep-together.within sayfa = "1">: fo p class = "jove_content"
Şekil 1. Cerrahi Aletler. (A) 11/0 naylon sütür. (B) ön şekillendirilmiş knot içeren Petri tabağı. (C) ex ovo embriyo kültürü ve ultrason görüntüleme için derin petri. (D) Transfer pipet. (E) neşter yumurta kabuğu kırmak için anlaştım. (F) ameliyat sonrası çalışmalar için embriyo eksizyon için düz makas. (G) Güzel forseps bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
OFT Bandlama 2. Sütür rakam. (A) Tek 1 cm parçacığı bir sütür dışarı tweezed.
3. Kuluçka Chambers rakam. (A) döllenmiş yumurta Nemlendirilmiş rocker inkübatör. (B) bantlı ve kontrol embriyoların kültürü ovo ex Nemlendirilmiş odası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4. OFT bantlama Şekil. (A) Tüm HH17 civciv embriyo daralma gösteren, ölçek çubuğu = 10 mm (B) şematik gösterimi ex ovo muhafazaSite (kırmızı). (C) Bantlı embriyo OFT bantlama sonra 48 saat görüntülü, ölçek çubuğu = 0.5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Hız Ölçümleri Ultrason kaynaklı. (A) kontrol ve (B) Temsilcisi hız profilleri 1 saat zaman noktasında elde edilen embriyolar bantlı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik nispeten hızlı ve kolay uygulanabilir olması, ancak bazı önemli noktaları doğru aşağı sonuçlar elde edecek şekilde akılda tutulması gerekir. Embriyolar, yeterli rehidrasyon sağlamak Tyrode tamponu ihtiva eden bir petri tabağına ovo ex muhafaza edilmelidir. Tyrode tamponu ile yumurta sarısı sonrası ameliyat hidrat ve inkübasyon odası yeterince hidrate emin olmak için de önemlidir. Herhangi bir kanama görülebilir veya sarısı hatta biraz kırık ise ameliyatları bir embriyo üzerinde yapılmamalıdır. Bu, özellikle uzun vadeli deneyler için, embriyo canlılığı etkiler. embriyolar letalitesinin başka bir potansiyel nedeni, ilk böylece önemli ölçüde kalp fonksiyonlarını ödün, uygulandığında OFT etrafında bant çok sıkı olup olmadığıdır.
Şu anda, biz OFT bantlama üzerine kan akım hızı değişimi belirlemek için bir doğrulayıcı bir araç olarak ultrason kullanmayın. Gelecekte, (mikro-bilgisayarlı tomografi kullanılarak teyit edecekBT). Biz de görsel olarak B-mod 2D görüntülerde OFT etrafında bant gerginliği belirler. Önemlisi, kalp atım hızı ve hacim akışı (CFD kullanılarak hesaplanan) arasında fark banded ve kontrol grubu 17 embriyoları arasında görülmektedir. Bunlar kalp-damar sistemi fizyolojisi, böylece daha fazla bantlama müdahalesi doğrulayarak, bantlı embriyolar bozulmamış olduğunu göstermektedir.
İstenilen zaman noktasında, bantlama sonra, birkaç analizler kritik vana gelişim süreçleri üzerinde değişmiş hemodinami etkisini anlamak için yapılabilir. Bunlar arasında, ancak ECM bileşenleri lokalizasyonunu belirlemek ve sıkça ultra yapısını belirleyen valf gelişiminde rol oynayan temel düzenleyici gen transkript seviyeleri değişiklikleri belirlemek, bunlarla sınırlı değildir.
Son olarak, bu teknik pencereli yumurta 19 içinde embriyo olarak oft bantlama mevcut yönteme geliştirir. Bu yöntem, şiddetlily aşağı moleküler analiz yapmak için gerekli embriyolar birikir yetersizlik engel. Bu yeni teknik, hem kurtarma deneylerinde kullanılabilir. OFT bantlı kurtarıldı ve embriyo hakaret kurtarmak için izin verilmesi için Bu uygulama sağlar. Hiçbir geçerli yöntem bunu hala istatistiksel olarak anlamlı aşağı analizleri yapmak mümkün olabilir.
Biz başarılı bir şekilde çok erken gelişim aşamasında (- 17 HH 16) de civciv embriyo merkezinde hemodinamik uyaranlara değiştirmek için bu tekniği kullanmışlardır. geliştirme sonraki aşamalarında ameliyat yaparken bantlama protokolü nedeniyle extraembryonic kan damarlarının herhangi nicklemek riski bir sorun mevcut olabilir. Ayrıca, gelişim geç evrelerinde, yumurta içeriği petri aktarılır zaman bozulmadan kesesi sarısı tutmak oldukça zordur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
