Protocol
Avian Embryonen werden nicht an Wirbeltieren unter IUCAC Vorschriften berücksichtigt.
1. Gewinnung Embryonen für Chirurgie
- Inkubieren 80-90 befruchtete Bovan Hühnereier (stumpfes Ende nach oben) in einem befeuchteten (60%) rocker Inkubator bei 40 ° C für etwa 72 Stunden Embryonen bei Hamilton und Hamburger (HH) Stufe 17. Bestimmen Sie genaue Anzahl der Eier zu erhalten, basierend auf Leistungsanalyse und Überlebensrate von Embryonen 17. Verwenden Sie Kunststoff-Ei-Tabletts für die Inkubation, um eine angemessene Luftzirkulation zu ermöglichen.
- Sobald diese gewünschte Entwicklungsstufe erreicht wird, gieße ca. 20 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer (mit Natriumbicarbonat supplementiert (1 g / L)) in eine 100 mm x 26 mm Petrischale.
- Sterilisieren eine Eierschale mit 70% Ethanol.
- knacken Sie vorsichtig die Schale mit einem Skalpell Griff und sorgfältig lösen seinen Inhalt in die Schüssel Tyrode-Puffer enthält. Entsorgen Embryonen, wenn (i) sie visuell abnormal erscheinen (ii) sienicht im richtigen Entwicklungsstadium sind, (iii) sie auf dem Dotter unsachgemäß ausgerichtet sind und / oder (iv) auftritt jede Blutungen. Behalten alle Embryonen nicht der Operation unterzogen , unmittelbar nach dem bei 40 ° C platziert ex ovo , um keine Entwicklung zu beeinträchtigen.
Hinweis: Die Zuschaltung wird durchgeführt basierend auf Hamilton und Hamburger 18. Abnormality von Hühnerembryonen ist mit dem bloßen Auge und unter der Dissektion Umfang bestimmt. Stellen Sie sicher, dass der Embryo entsprechende Faltung hat und Biegen und Gefäßen.
2. OFT Banding
- Tweeze aus einzelnen 1 cm lange Fäden aus einem einzigen 11/0 Nylon chirurgisches Naht und bilden einen losen Knoten. UV alle vorgefertigten Knoten sterilisieren.
- Unter einem Präpariermikroskop sicher visuell, dass das Herz mit einer normalen Rate schlägt (~ 120 Schläge / min). Wenn nicht, werfen Sie den Embryo.
- Kurz vor der Operation anwenden 5 - 6 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer auf die Embryooberfläche eine Transferpipette.
- Führen Sie einen freien Ende des vorgeformten Knoten unter der OFT, positionieren Sie die Naht an der OFT / Ventrikel Übergang (OVJ) (oder gewünschte Position), und das freie Ende in den Knoten passieren, wodurch die OFT einzuengen einschließlich der Membranen, die das Herz.
- Nach der Operation benetzen die Oberfläche des Eigelbs mit 5 - 6 ml warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer, der eine Transferpipette.
- Behalten Sie die Kontrolle Embryonen ex ovo wie die gebänderte Embryonen; aber sie unterliegen nicht dem chirurgischen Eingriff.
- Inkubiere die Embryonen, für die gewünschte Zeitdauer, bei 40 ° C in einem befeuchteten (60%) Inkubator.
- Sobald der gewünschte Zeitpunkt erreicht ist, auszuschneiden, den Embryo aus dem Dotter mit geraden Schere. Präparieren Sie das Herz mit einer feinen Pinzette und verwenden für mehrere Downstream - Studien wie zum Beispiel Veränderungen der kardialen Morphologie aufgrund veränderter Hämodynamik 17.
3. Bestätigen, dass der Banding Intervention eine Veränderung der Hämodynamik Ursachen
Anmerkung: Die teilweise durch die banding Eingriff verursachte Verengung führt zu einer Erhöhung der Blutströmungsgeschwindigkeit an der OVJ. Dieser hämodynamische Parameter wird zweckmßigerweise unter Verwendung von 2D-Ultraschallbildgebungs beurteilt, die bei dem gewünschten Zeitpunkt des Experiments durchgeführt wird.
- Da nur ein einziger Embryo zu einem Zeitpunkt abgebildet werden, halten alle anderen zur Ultraschallbildgebung bezeichnet Embryonen in einem 40 ° C Inkubator.
- Legen Sie die Petrischale den Embryo enthält, auf einem Heizkissen bei 40 ° C eingestellt abgebildet werden.
- Füllen Sie die Schüssel, bis zum Rand, mit warmem (37 ° C) Tyrode-Puffer. Gießen Sie langsam die Pufferlösung in die Schale, um das Eigelb intakt zu halten. Wenn jedoch die Integrität des Eigelbs bei diesem Schritt kompromittiert, verwerfen den Embryo.
- Orient der Embryo, so dass die Mittelachse des Embryos senkrecht zu der Ultraschallsonde, die aus einem einstellbaren Ständer aufgehängt ist.
- Mit dem Ultraschallgerät Operting in B-Modus, ein 2D-Bild des schlagenden Herzens auf dem Bildschirm zu erhalten und die Stufe (Heizkissen), so dass das OFT, Ventrikel und OVJ sind deutlich sichtbar bewegen.
- Umschalten auf die gepulste Wellen (PW) -Modus, bei der gewünschten Impulswiederholungsfrequenz (zB 20 kHz) und erhalten Geschwindigkeitsdaten genau an der OVJ. Ein B-Modus-Bild des schlagenden Herzens wird auf dem Bildschirm erhalten.
- Bewegen Sie die Stufe der OFT, Ventrikel und die OVJ zu sehen. Mit Hilfe der Ultraschall-Maschine-Software, erhalten Geschwindigkeitsmessungen genau an der OVJ.
Hinweis: Wenn der Herzfrequenz eines Embryos während der Bilderzeugung verringert, die Geschwindigkeit so erhaltenen Daten nicht für die Analyse verwendet werden. Alle Embryonen für die Geschwindigkeitsmessungen verwendet werden, sollten vorzugsweise nicht für andere Experimente nach der Ultraschall-Bildgebung verwendet werden.
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Representative Results
In Abbildung 1 dargestellt sind Instrumente für OFT Banding erforderlich empfohlen. Die Petrischale (1A) , um den Embryo ex ovo enthält , sollte tief genug sein, um nicht den Embryo zu zerstören , wenn sie mit dem Deckel bedeckt. Tiefpetrischalen (1C) sollte auch für die Ultraschall - Bildgebung verwendet werden , ein ausreichendes Volumen an Tyrode-Puffer zu ermöglichen , oben auf dem Dotter gegossen werden.
Ein einzelnes 1 cm Gewinde (2A) aus einem 11/0 Nylonfaden (1A) und gebunden in einem lockeren Knoten (1B) gezupft werden. Alle vorgeformten Knoten sind UV sterilisiert. 3A eine befeuchtete Wippenraum zeigt , wo befruchtete Hühnereier , bis die gewünschte Stufe inkubiert werden. 3B zeigt einen Embryo Inkubator, wo gebändert und Kontrolle Embryonen werden beibehalten ex ovo
Gezeigt in Figur 4A ist eine HH17 Embryo auf der Oberseite des Dotters ex ovo. 4B ist eine schematische Darstellung der Position der Naht (band) am OVJ eines HH17 embryo zeigt. 4C ist ein repräsentatives Bild eines gebänderten embryo abzubildenden 48 Stunden nach der Operation.
Die Wirkung der banding Intervention auf den Blutströmungsgeschwindigkeit durch die Verengung Stelle wird durch 2D-Ultraschall-Bildgebung gemessen. Wie erwartet, ist die Geschwindigkeit an der OVJ höher in der gebänderte embryo relativ zur Kontrolle (Abbildung 5). Wir haben vor kurzem Computational Fluid Dynamics (CFD) Analyse auf gebändert und Kontrollherzen an der 24 - Stunden - Zeitpunkt durchgeführt 17 die Auswirkungen von OFT Banding auf die Blutströmungsgeschwindigkeit und Wandschubspannung zeigt.
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Abbildung 1. Chirurgische Instrumente. (A) 11/0 Nylonnaht. (B) Petri - Platte mit vorgeformten Knoten. (C) Tiefpetrischale für ex ovo Embryokultur und Ultraschall - Bildgebung. (D) Transfer Pipette. (E) Skalpellgriff die Eierschale zu knacken. (F) Gerade Schere für die Embryo - Exzision für postoperative Studien. (G) einer feinen Pinzette Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Suture für OFT Banding. (A) Ein einzelnes 1 cm Faden tweezed aus einem Faden aus.
Abbildung 3. Die Inkubation Chambers. (A) Humidified rocker Inkubator für befruchtete Eier. (B) befeuchteten Kammer für ex ovo Kultur gebändert und Kontrolle Embryonen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. OFT Banding. (A) insgesamt HH17 Hühnerembryo beibehalten ex ovo, Skala bar = 10 mm (B) Schematische Darstellung der Darstellung der VerengungWebsite (rot). (C) mit einem Band versehene Embryo abgebildet 48 Stunden nach der OFT Banding, Skala bar = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Ultraschall-Geschwindigkeitsmessungen abgeleitet. Repräsentative Geschwindigkeitsprofile von (A) Kontrolle und (B) mit einem Band versehene bei einer 1 Stunde Zeitpunkt erhalten Embryonen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Technik relativ schnell und einfach durchzuführen, jedoch bestimmte Schlüsselpunkte müssen im Auge behalten werden, um genaue nachgelagerten Ergebnisse zu erzielen. Embryonen ex ovo in einer Petrischale gehalten werden , die Tyrode-Puffer enthält ausreichende Rehydratisierung vorzusehen. Es ist auch wichtig, den Dotter nach der Operation mit Tyrode-Puffer, um Hydrat und sicher, dass die Inkubationskammer zu machen, ist ausreichend mit Flüssigkeit versorgt. Chirurgie sollte nicht auf einem Embryo durchgeführt werden, wenn eine Blutung sichtbar oder das Eigelb ist sogar leicht gebrochen. Dies wirkt sich Embryo Überleben, vor allem für Langzeitexperimente. Eine andere mögliche Ursache für Letalität Embryonen ist, ob das Band um die OFT ist zu fest, wenn zuerst angewendet, wodurch signifikant die Herzfunktion zu beeinträchtigen.
Derzeit verwenden wir Ultraschall als bestätigende Werkzeug, um die Änderung der Blutströmungsgeschwindigkeit zu bestimmen, nach OFT Banding. In Zukunft werden wir mit Mikro-Computertomographie bestätigen (CT). Wir bestimmen auch visuell die Band Enge um das OFT in B-Modus 2D-Bildern. Wichtig ist , dass keine Unterschiede in der Herzfrequenz und der Volumenstrom (berechnet unter Verwendung von CFD) zwischen Embryonen in den gebändert und Kontrollgruppen 17 beobachtet. Diese zeigen an, dass die Physiologie des Herz-Kreislauf-System nicht in den gebänderten Embryonen beeinträchtigt, wodurch weiter die banding Eingriff zu validieren.
Zum gewünschten Zeitpunkt, nach Banding können mehrere Analysen der Wirkung von veränderten Hämodynamik auf kritische Ventil Entwicklungsprozesse zu verstehen, durchgeführt werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Veränderungen in der Bestimmung Transkriptmengen von Schlüsselregulationsgene in Ventil Entwicklung, Lokalisierung von ECM-Komponenten zu bestimmen und die Bestimmung der Ultrastruktur des OFT.
Schließlich verbessert diese Technik auf dem aktuellen Verfahren der im Inneren des Fenster - Ei 19 das OFT im Embryo Banding. Das Verfahren ist strengly durch die Unfähigkeit behindert notwendigen Embryonen zu akkumulieren nachgelagerten molekularen Analysen zu tun. Dieses neue Verfahren kann auch in Rettungsexperimenten verwendet werden. Diese Anwendung ermöglicht es für die OFT gebändert gerettet werden und Embryo erlaubt von der Beleidigung zu erholen. Keine aktuellen Verfahren können dies tun, und noch in der Lage sein, statistisch signifikante Downstream-Analysen durchzuführen.
Wir haben diese Technik erfolgreich eingesetzt in einem sehr frühen Entwicklungsstadium der hämodynamischen Reize im Herzen von Hühnerembryonen zu ändern (HH 16 - 17). Die Banden Protokoll könnte eine Herausforderung darstellen, wenn die Operation in späteren Phasen der Entwicklung, da das Risiko von nicking einem der extraembryonic Blutgefäße durchführen. Auch in späten Stadien der Entwicklung ist es oft schwierig, den Dottersack intakt zu halten, wenn die Eiinhalts in die Petrischale überführt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
