Protocol
עוברי עופות אינם נחשבים בעלי חיים בעלי חוליות לפי תקנות IUCAC.
1. קבלה עוברת לכירורגיה
- דגירת 80 - 90 ביצי תרנגולת מופרות Bovan (עד הסוף בוטה) חממת נדנדת humidified (60%) ב 40 מעלות צלזיוס למשך כ 72 שעות כדי לקבל העוברים על המילטון המבורגר (HH) שלב 17. קביעת מספר מדויק של ביצים על בסיס ניתוח כוח והישרדות שיעור העוברים 17. השתמש מגשי ביצים פלסטיק לאינקובטורים לאפשר זרימת אוויר נאותה.
- לאחר השלב ההתפתחותי הרצוי זו מושגת, יוצקים כ 20 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) חיץ של Tyrode (בתוספת סודיום ביקרבונט (1 גר '/ ל)) לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ x 26 מ"מ.
- לעקר קליפת ביצה עם 70% אתנול.
- בעדינות לפצח את הקליפה עם ידית סקלפל לשחרר תוך בזהירות לתוך הצלחת ובה החיץ של Tyrode. מחק עוברי אם (i) הם מבחינה ויזואלית להופיע נורמלי (ii) הואלא בשלב ההתפתחותי הנכון (iii) הם מכוונים כראוי על החלמון ו / או (iv) כל דימום. לשמור על כל עוברי לא נתון ניתוח מייד לאחר שיוצב לשעבר אובו ב 40 ° C כדי לא להתפשר פיתוח.
הערה: Staging מתבצע על בסיס המילטון המבורגר 18. נורמליות של עוברים חומוס נקבעת על ידי בעין בלתי מזוינת ותחת היקף לנתיחה. ודא כי עובר יש קיפול מתאים כיפוף כלי דם.
2. Banding OFT
- למרוט את חוטים בודדים ארוך 1 סנטימטר תפר כירורגי 11/0 ניילון אחת ויוצר קשר רופף. UV לעקר את כל הקשרים preformed.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, חזותי להבטיח כי הלב פועם בקצב נורמלי (~ 120 פעימות / דקה). אם לא, לבטל את העובר.
- רגע לפני הניתוח, להחיל 5 - 6 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) חיץ של Tyrode אל פני השטח העובר באמצעות פיפטה ההעברה.
- לעבור מקצה אחד חינם של ההקשר מתבצע תחת OFT, מקם את התפר בצומת OFT / החדר (OVJ) (או מיקום רצוי), ולהעביר את הקצה החופשי אל תוך התסבוכת ובכך הצרת OFT כולל הקרומים המקיפים את הלב.
- לאחר הניתוח, להרטיב את פני השטח של חלמון עם 5 - 6 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) חיץ של Tyrode בעזרת פיפטה ההעברה.
- שמור עוברים בקרת אובו לשעבר כמו העוברים התאגדו; אולם לא לייחד להם מקום ההליך הכירורגי.
- דגירה עוברים, עבור משך הזמן הרצוי, ב 40 מעלות צלזיוס חממה humidified (60%).
- לאחר נקודת הזמן הרצוי הוא הגיע, שיחתוך את העובר מן החלמון באמצעות מספריים ישר. לנתח את הלב עם מלקחיים עדינים ולהשתמש במשך כמה מחקרים במורד כגון שינויים במורפולוגיה לב עקב ופרמטרים המודינמיים שינו 17.
3. אישור כי התערבות Banding גורמת לשינוי ופרמטרים המודינמיים
הערה: ההתכווצות החלקית שנגרמה על ידי התערבות banding מובילה לעלייה מהירה זרימת דם בבית OVJ. פרמטר המודינמי זה נבחן בנוחות באמצעות דימות אולטרסאונד 2D, אשר מתבצעות בנקודת הזמן הרצויה של הניסוי.
- מכיוון שרק עובר יחיד ניתן הדמיה בכל פעם, לשמור על כל העוברים אחרים המיועדים הדמיה אולטרסאונד C חממה 40 °.
- מניחים את צלחת פטרי שמכילה את העובר להיות צילמו על כרית חימום נקבע על 40 ° C.
- מלאו את צלחת, עד אפס מקום, עם חם (37 מעלות צלזיוס) חיץ של Tyrode. לאט לשפוך את פתרון החיץ לתוך התבשיל כדי לשמור על החלמון ללא פגע. אם, לעומת זאת, את היושרה של החלמון נפגע במהלך שלב זה, להשליך את העובר.
- האוריינט העובר כך הציר המרכזי של העובר הוא בניצב בדיקת אולטרסאונד אשר מושעה מתוך מעמד מתכוונן.
- עם אופרת מכונת אולטרסאונדטינג-מצב B, לקבל תמונה 2D של הלב הפועם על המסך ולעבור לשלב (כרית חימום) כך OFT, החדר ואת OVJ גלויים לעין.
- למעבר למצב פעמו-גל (PW), בתדירות החזרה הדופקת הרצוי (למשל, 20 קילוהרץ) ולקבל נתונים מהירים בדיוק על OVJ. תמונת B-mode של הלב הפועם מתקבלת על המסך.
- הזז את הבמה כדי לצפות OFT, החדר ואת OVJ. שימוש בתוכנת מחשב אולטרה-סאונד, להשיג מדידות מהירות בדיוק על OVJ.
הערה: אם קצב הלב של עובר פוחת במהלך הדמיה, נתוני מהירות ובכך השיגו לא אמורים לשמש לניתוח. כל העוברים משמשים מדידות מהירות רצויות לא להשתמש בו לכל ניסויים אחרים לאחר הדמית אולטרסאונד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שמוצג באיור 1 המומלצים הכלים הדרושים עבור banding OFT. צלחת פטרי (איור 1A) המכילה לשעבר העובר אובו צריכה להיות עמוקה מספיק כדי לא להרוס את העובר כאשר מכוסה במכסה. בצלחות פטרי עמוקות (איור 1 ג) אמורות לשמש גם עבור הדמית אולטרסאונד כדי לאפשר נפח נאות של החיץ של Tyrode יימזג גבי החלמון.
חוט אחד 1 ס"מ (איור 2 א) הוא מרטה מ (איור 1 א) תפר ניילון 11/0 וקשר לפקעת רופף (איור 1B). כל הקשרים preformed הם מעוקרים UV. איור 3A מראה תא נדנדה humidified שבו ביצי תרנגולת מופרות מודגרת עד לשלב הרצוי. איור 3 ב מציג באינקובטור העובר, שבו התאגדו ועוברים בקרת נשמרות לשעבר אובו
שמוצג באיור 4A הוא העובר HH17 על גבי אובו לשעבר חלמון. איור 4B הוא ייצוג סכמטי המראה את המיקום של התפר (להקה) בבית OVJ של עובר HH17. איור 4C היא תמונה מייצגת של עובר התאגד צלמה 48 שעות לאחר הניתוח.
השפעת התערבות הפסים על מהירות זרימת דם דרך אתר ההתכווצות נמדדת הדמית אולטרסאונד 2D. כצפוי, מהירות על OVJ גבוה בעובר התאגדו ביחס לשליטה (איור 5). בצענו דינמיקה של נוזלים חישובית לאחרונה (CFD) ניתוח על לבבות התאגדו ובקרו בנקודת 24 שעות הזמן מראה את ההשפעות של OFT banding על גזירת זרימת דם מהירות קיר מתח 17.
<p class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 1. מכשירי ניתוח. (א) 11/0 ניילון תפר. (ב) צלחת פטרי המכילה קשרים מראש יצר. (C) בצלחת פטרי עמוקה לתרבות עוברת לשעבר אובו והדמית אולטרסאונד. (ד) פיפטה העברה. (E) אזמל לטפל לפצח את קליפת הביצה. (F) מספריים ישר עבור כריתה העובר ללימודים לאחר ניתוח. (G) מלקחי פיין אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תפר עבור OFT פסים. (א) חוט יחיד 1 סנטימטר מרט מ- תפר.
איור 3. הדגירה צ'יימברס. (א) חממת נדנדת humidified ביצים מופרות. (ב) בתא humidified עבור לשעבר אובו התרבות של עוברים התאגדו ושליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. OFT פסים. (א) העובר חומוס HH17 הפריטים מתוחזק אובו לשעבר, סרגל קנה מידה = 10 מ"מ (ב) ייצוג סכמטי המתאר את התכווצותאתר (אדום). (ג) העובר Banded צלם 48 שעות לאחר OFT banding, סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. אולטראסאונד הנגזרים מדידות מהירות. פרופילים מהירי נציג של (א) מלא (B) התאגדו עוברים שהושגו בנקודת זמן 1 hr. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקה זו היא יחסית קלה ומהירה לבצע, אולם נקודות מפתח מסוימות צריכות לזכור כדי לקבל תוצאות במורד מדויקות. עוברים צריך להישמר לשעבר אובו בצלחת פטרי שמכילה חיץ של Tyrode לספק להחזרת נוזלים נאותה. כמו כן, חשוב כדי ללחלח את החלמון שלאחר הניתוח עם החיץ של Tyrode וכדי לוודא את תא הדגירה הוא hydrated כראוי. ניתוחים לא צריכים להיות מבוצעים על עובר אם בכלל דימום גלוי או החלמון אפילו נשבר מעט. זה משפיע הישרדות עוברת, במיוחד עבור ניסויים לטווח ארוכים. סיבה נוספת פוטנציאל של הקטלניות עובריות, היא האם הלהקה ברחבי OFT היא חזקה מדי כאשר מיושמים לראשונה, ובכך להתפשר תפקוד לב באופן משמעותי.
נכון לעכשיו, אנו משתמשים אולטרסאונד ככולים מאשר כדי לקבוע את השינוי מהיר זרימת דם על banding OFT. בעתיד, ואנו מאשרים באמצעות טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת (CT). אנחנו גם מבחינה ויזואלית לקבוע את אטימות הלהקה ברחבי OFT בתמונות 2D B-mode. חשוב לציין, כי אין הבדלים בקצב לב וזרימת נפחים (מחושב באמצעות CFD) הם נצפו בין עוברים בקבוצות הרצועה ובקרה 17. אלו מעידים כי הפיסיולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם לא נפגעת ב העוברים התאגדו, ובכך נוסף אימות התערבות הפסים.
בנקודת הזמן הרצויה, לאחר banding, מספר ניתוחים ניתן לבצע כדי להבין את ההשפעה של ופרמטרים המודינמיים שינו על תהליכים התפתחותיים שסתום קריטי. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, קביעת שינויים ברמות תמליל גני רגולטוריים מפתח מעורב בפיתוח שסתום, קביעת לוקליזציה של רכיבי ECM וקביעת ultrastructure של OFT.
לבסוף, טכניקה זו משפרת על השיטה הנוכחית של banding OFT בעובר בתוך הביצה חלונות 19. שיטה זו היא חמורהly הקשה על ידי חוסר היכולת לצבור עובר צורך לעשות ניתוחים מולקולריים במורד זרם. טכניקה חדשה זו יכולה לשמש בניסויים הצלה גם כן. יישום זה מאפשר התאגד OFT להינצל ואת העובר מותר להתאושש מן העלבון. אין השיטה הנוכחית יכול לעשות את זה, ועדיין להיות מסוגל לבצע ניתוחים במורד מובהק סטטיסטית.
השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לשנות את הגירויים המודינמי בלב עובר חומוס בשלב התפתחותי מוקדם מאוד (HH 16 - 17). פרוטוקול הפסים עלול להוות אתגר בעת ביצוע הניתוח בשלבים מאוחר יותר של התפתחות בשל הסיכון של שסחב כל כלי דם extraembryonic. כמו כן, בשלבים מאוחרים של פיתוח, הוא לעתים קרובות קשה לשמור על צק החלמון ללא פגע כאשר תוכן הביצה מועבר לתוך צלחת פטרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
