Protocol
Эмбрионов птиц не считаются позвоночных животных согласно правилам IUCAC.
1. Получение зародыши для хирургии
- Выдержите 80 - 90 оплодотворенные куриные яйца Bovan (тупым концом вверх) в увлажненной (60%) качающегося инкубаторе при 40 ° С в течение примерно 72 часов, чтобы получить эмбрионы в Гамильтон и Гамбургский (HH) этап 17. Определить точное количество яиц, основанных на анализ мощности и выживаемость эмбрионов 17. Используйте пластиковые лотки яиц для инкубации, чтобы обеспечить достаточную циркуляцию воздуха.
- После того, как это желательно стадии развития достигается, влить приблизительно 20 мл теплой (37 ° С) буфера Тирода (дополненной раствором бикарбоната натрия (1 г / л)) в 100 мм х 26 мм чашках Петри.
- Стерилизовать яичную скорлупу с 70% этанола.
- Аккуратно взломать оболочку с скальпелем и осторожно освободить его содержимое в чашку, содержащую буфер Тирода. Откажитесь эмбрионов, если (I) они визуально появляются аномальные (II) онине на правой стадии развития (III) они неправильно ориентированы на желток и / или (IV) любое кровотечение происходит. Удержания любых эмбрионов не подвергнутых операции сразу после размещения экс ово при 40 ° С с тем, чтобы не поставить под угрозу развитие.
Примечание: Балетмейстер выполняется на основе Гамильтон и гамбургер 18. Аномалии куриных эмбрионов определяется невооруженным глазом и под сферу рассечение. Убедитесь в том, что эмбрион имеет соответствующую складывание и изгиб и сосудистая сеть.
2. OFT кольцевание
- Выщипывать индивидуальные 1 см длиной нити из одного 11/0 нейлоновой хирургического шва и образуют свободный узел. UV стерилизовать все узлы предварительно образованные.
- Под микроскопом рассечение, визуально убедиться, что сердце бьется с нормальной скоростью (~ 120 уд / мин). Если нет, то отказаться от эмбриона.
- Непосредственно перед операцией, нанесите 5 - 6 мл теплой (37 ° С) буфере Тирода к поверхности эмбриона с помощью пипетки передачи.
- Пропустите один свободный конец узла отформованной под OFT, установите шовный на OFT / желудочек перехода (OVJ) (или желаемое место нахождения), и передать свободный конец в узел, тем самым сужая OFT в том числе мембран, окружающих сердце.
- После операции, смачивают поверхность желтка с 5 - 6 мл теплого (37 ° С), буфер Тирода с использованием передачи пипетки.
- Сохранить контроль над эмбрионами ех ово как полосчатых эмбрионов; однако не подвергать их хирургической процедуры.
- Инкубируйте эмбрионов в течение требуемого количества времени, при 40 ° C в увлажненной (60%) инкубаторе.
- После того, как желаемый момент времени достигается, акцизного эмбриона от желтка, используя прямые ножницы. Рассеките сердце с тонким пинцетом и использовать в течение нескольких последующих исследований , таких как изменения в сердечной морфологии из - за измененной гемодинамики 17.
3. подтверждая, что кольцевание вмешательство вызывает изменение в гемодинамику
Примечание: Частичное сужение, вызванное вмешательством обвязочной приводит к увеличению скорости кровотока в OVJ. Этот параметр гемодинамический удобно оценены с использованием 2D ультразвукового изображения, которая выполняется в нужной точке времени эксперимента.
- Так как только один эмбрион может быть отображены в то время, поддерживать все остальные эмбрионы, предназначенные для ультразвуковой визуализации в 40 ° С инкубатор.
- Поместите чашку Петри, содержащую зародыш быть отображены на грелку, установленной при 40 ° C.
- Заполните блюдо, до краев, с теплым (37 ° С) буфера Тирода. Медленно влить буферный раствор в сосуде с тем, чтобы сохранить желток нетронутыми. Если, тем не менее, целостность желтка под угрозу в течение этого шага, отказаться от эмбриона.
- Orient эмбрион таким образом, что центральная ось эмбриона перпендикулярна к ультразвуковым зондом, который подвешен с регулируемой подставкой.
- С машиной ультразвука оперытин в B-режиме, получить 2D-изображение бьющегося сердца на экране и переместите ступени (грелку) таким образом, что OFT, желудочек и OVJ отчетливо видны.
- Переключение в режим импульсно-волнового (PW), на частоте повторения импульсов желательно (например, 20 кГц) и получить данные по скорости точно в OVJ. B-режим изображение бьющегося сердца получается на экране.
- Переместить сцену, чтобы увидеть OFT, желудочек и OVJ. С помощью программного обеспечения ультразвукового аппарата, получить измерения скорости именно на OVJ.
Примечание: Если частота сердечных сокращений эмбриона уменьшается во время формирования изображения, данные скорости, полученные таким образом, не следует использовать для анализа. Все эмбрионы, используемые для измерения скорости предпочтительно не следует использовать для других экспериментов после ультразвуковой визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показанный на рисунке 1 рекомендуются инструменты , необходимые для OFT полосатость. Чашки Петри (Фигура 1А) , содержащий зародыш ех ово должно быть достаточно глубоким , чтобы не разрушать эмбрион , когда покрыта крышкой. Глубокие чашки Петри (рис 1C) также следует использовать для ультразвуковых изображений , чтобы позволить адекватный объем буфера Тирода переливаться на вершине желтка.
Одиночный 1 см нити (рис 2а) tweezed из 11/0 нейлон шовный (рисунок 1А) и связаны в рыхлую узел (рис 1В). Все узлы Предварительно получали УФ - стерилизации. Рисунок 3A показывает увлажненной качающийся камеру , где оплодотворенные куриные яйца инкубировались до желаемой стадии. Фигура 3В показывает эмбрион инкубатор, где полосатую и контрольные эмбрионы поддерживаются экс ово
Показано на рисунке 4A является HH17 эмбрион на верхней части желтка экс ово. Фиг.4В представляет собой схематическое изображение , показывающее положение шовного материала (группа) в OVJ из зародыша HH17. Рисунок 4C является представителем образ полосовой эмбриона в образ 48 ч после операции.
Эффект вмешательства полосатости на скорости кровотока через сайт сдавливания измеряется с помощью 2D ультразвуковых изображений. Как и следовало ожидать, скорость на OVJ выше в малоазиатского эмбриона по сравнению с контролем (рисунок 5). Недавно мы проводили вычислительной гидродинамики (CFD) анализ полосатых и контроля сердца в момент времени 24 ч , показывающий влияние OFT полосатость на скорости кровотока и напряжения сдвига стенки 17.
<р класс = "jove_content" ВОК: Keep-together.within-странице = "1">
Рисунок 1. Хирургические инструменты. (A) 11/0 нейлон швом. (B) чашку Петри , содержащую предварительно придана узлы. (C) Глубокий чашку Петри для экс ово культуры эмбриона и ультразвуковой визуализации. (D) Transfer пипеткой. (Е) скальпелем , чтобы взломать скорлупу. (F) Прямые ножницы для эмбриона иссечения для исследований после операции. (G) Fine пинцет Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Шов для OFT Banding. (A) Одиночный 1 см нить tweezed из шовного материала.
Рисунок 3. инкубаторе. (A) Увлажненный рокер инкубатор для оплодотворенных яиц. (В) увлажненной камере для экс ово культуры полосатых и контрольных эмбрионов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. OFT полосатость. (A) Всего HH17 куриного эмбриона поддерживали бывшего ово, масштаб бар = 10 мм (В) Схематическое изображение изображающие перетяжкусайт (красный). (С) Пластинчатые эмбриона 48 часов в образ после того, как OFT кольцевание, масштаб бар = 0,5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Ультразвук полученных Velocity измерений. Представитель скорости профили (А) управления и (В) ленточная эмбрионов , полученных в момент времени 1 час. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод является относительно быстро и легко выполнить, однако некоторые ключевые моменты, необходимо иметь в виду, таким образом, чтобы получить точные результаты вниз по течению. Эмбрионы следует поддерживать ех ово в чашке Петри, содержащей буфер Тирода , чтобы обеспечить адекватную регидратацию. Важно также, чтобы увлажнять желтка после операции с буфером Тирода и чтобы убедиться, что инкубационный камера достаточно увлажненной. Операций не должны быть выполнены на эмбрион, если любое кровотечение видна или желток даже слегка раздробленными. Это влияет на выживаемость эмбрионов, особенно для долгосрочных экспериментов. Другой потенциальной причиной летальности для эмбрионов, является ли слишком туго группа вокруг OFT, когда впервые применил, таким образом, значительно ставя под угрозу функцию сердца.
В настоящее время мы используем ультразвук как подтверждающий инструмент для определения изменения скорости кровотока при OFT полосатость. В будущем, мы подтвердим с помощью микро-компьютерной томографии (CT). Мы также визуально определить полосу плотности вокруг OFT в B-режиме 2D-изображений. Важно отметить, что никаких различий в частоте сердечных сокращений и объемного расхода (вычисляется с использованием CFD) не наблюдается между эмбрионами в Полосчатая и контрольных групп 17. Они указывают, что физиология сердечно-сосудистой системы не ставя под угрозу в полосатых эмбрионов, тем самым подтверждая дальнейшее признание вмешательства полосатости.
В желаемый момент времени, после того, как полосатость, несколько анализов могут быть выполнены, чтобы понять влияние измененных гемодинамики на критический клапанов процессов развития. К ним относятся, но не ограничиваются ими, определения изменений в уровнях транскриптов ключевых регуляторных генов, участвующих в разработке клапана, определения локализации компонентов ECM и определение ультраструктуры ОСТ.
Наконец, этот метод улучшает текущий метод кольцевания ОСТ у эмбриона внутри яйца оконном 19. Этот метод является серьезнымLY мешает неспособность накапливать необходимые эмбрионов сделать ниже по течению молекулярного анализа. Этот новый метод может быть использован в спасательных экспериментах. Это приложение позволяет полосчатая OFT быть спасенным и эмбрионов позволили оправиться от инсульта. Ни один текущий метод не может сделать это и по-прежнему быть в состоянии выполнять статистически значимые анализы вниз по течению.
Мы успешно использовали эту технику, чтобы изменить гемодинамические стимулы в сердце куриных эмбрионов на очень ранней стадии развития (HH 16 - 17). Протокол полосатость мог бы представлять проблему при проведении операции на более поздних стадиях развития из-за риска никующие любой из внеэмбриональные кровеносных сосудов. Кроме того, на поздних стадиях развития, часто бывает трудно держать желтка нетронутыми, когда содержимое яйца переносят в чашку Петри.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
