Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا للرعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام (IACUC). استخدمت THY1-YFP، حزب العمال التقدمي-EGFP وPV-TdTomato الفئران لهذه التجارب، ولكن أي الفئران معربا عن البروتينات الفلورية يمكن مسح بنجاح وتصويرها.
1. نسيج التحضير
تحذير: لامتصاص العرق (PFA) ومادة الأكريلاميد هي مواد سامة والمهيجات. إجراء تجارب استخدام هذه الكواشف في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين).
- التضحية الحيوانية في غرفة القتل الرحيم مع ~ 1 مل من الأيزوفلورين حتى يتوقف التنفس (~ 2-3 دقيقة).
- استخدام مضخة تحوي مجموعة إلى ~ 5 مل / دقيقة ليروي intracardially الماوس مع نضح حل (الجدول 1) في 4 درجات مئوية حتى يتم مسح الدم من الأنسجة (5-10 دقيقة).
- تغيير الإرواء إلى حل تثبيتي (الجدول 1)في 4 درجات مئوية حتى العنق والذيل وتشديد كبير (5-10 دقيقة).
- إنهاء نضح وقطع رأس الحيوان. تشريح بعناية الدماغ من الجمجمة عن طريق إزالة أول الأنسجة الضامة المحيطة الجمجمة ومن ثم إزالة العظام من السطح البطني من الجمجمة ورفع الدماغ من (الشكل 1A)، كما هو موضح في 20.
ملاحظة: إعطاء عناية خاصة لإزالة العظام المحيطة بها فصوص الندفي العقيدي من المخيخ وبصيلات الشم.- تشريح الحبل الشوكي من العمود الفقري عن طريق إدراج بلطف غيض من، مقص حاد رفيع بين النخاع الشوكي والعمود الفقري وقطع شرائح الفردية العمود الفقري بعيدا، كما هو موضح في 21.
- Hemisect الدماغ عن طريق وضعها في بلاستيكية مصفوفة دماغ الفأر وقطع على طول خط الوسط بشفرة المصفوفة.
- إضافة كل نصف الكرة والحبل الشوكي لفصل 50 مل حوض أجهزة الطرد المركزيوفاق مع ~ 40 مل من محلول هيدروجيل (الجدول 1). من هذه النقطة الغطاء الأمامي الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores خلال جميع الخطوات اللاحقة.
- احتضان الأنبوب الذي يحتوي على العينة في هيدروجيل في 4 درجات مئوية مع طيف والهز (~ 30 دورة في الدقيقة) لمدة 7 أيام.
2. البلمرة
- تجاهل ~ 25 مل من هيدروجيل، والحفاظ على عينة و~ 25 مل من هيدروجيل في أنبوب الطرد المركزي.
- ينزع الأكسجين العينة عن طريق إزالة الغطاء ووضع أنبوب الطرد المركزي في جرة المجفف وتوصيل جرة إلى فراغ. تطبيق فراغ لمدة 10 دقيقة على الأقل للسماح الغازات الذائبة للخروج من الحل وشكل فقاعات. يهز بلطف لطرد الفقاعات.
- استبدال فراغ في جرة مجفف مع غاز النيتروجين بنسبة 100٪ خلال 2-3 دقائق. مرة واحدة equalizes الضغط (مرة واحدة الجزء العلوي من جرة مجفف يمكن فتح)، بسرعة غطاء الأنبوب لمنع إعادة الأوكسجين.
- البوليمرإيزي هيدروجيل عن طريق وضع أنبوب مع عينة في 37 ° C حمام الماء لمدة 3 ساعات حتى البلمرة كاملة. سوف هيدروجيل بلمرة تأخذ على مثل هلام الاتساق (الشكل 1B). ملاحظة: هناك كمية صغيرة من هيدروجيل unpolymerized في الجزء العلوي هو مقبول.
- استخدام ملعقة لإزالة عينة بلمرة من أنبوب الطرد المركزي، ثم قطع هيدروجيل الزائدة من العينة.
- إزالة هيدروجيل المتبقية عن طريق وضع عينة على الوبر مسح مجانا وفرك بلطف والمتداول الأنسجة عليه، تاركا وراءه سوى طبقة رقيقة من هيدروجيل بلمرة على العينة.
3. إزالة الدهون
ملاحظة: الأنسجة مسح الدهن هشة، التعامل معها بحذر. استخدام مصفاة الخلية عندما استنزاف أنبوب لتجنب فقدان العينة. أيضا، فإن عينة تضخم في جميع مراحل عملية المقاصة، ومع ذلك، يمكن عكسها خلال عملية مؤشر مطابقة الانكسار تورم.
تحذير: سودىأم كبريتات دوديسيل (SDS) وحمض البوريك هي المهيجات. إجراء تجارب الاستفادة منها في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات وحماية العين).
- نقل عينة بلمرة لأنبوب الطرد المركزي 50 مل نظيف وإضافة 45 مل من تطهير عازلة (الجدول 1). احتضان عند 45 درجة مئوية مع الهز لطيف (~ 30 دورة في الدقيقة). تغيير المخزن المؤقت يوميا لمدة 7 أيام الأولية التي تتدفق خارج المنطقة العازلة المقاصة المستخدمة في النفايات الكيميائية وإضافة ~ 45 مل من العازلة المقاصة الطازجة. الحفاظ على أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على عينات من تغطيتها في رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores.
- بعد 7 أيام الأولى، واحتضان العينة في C وتبادل المقاصة عازلة 40 درجة كل 2-3 أيام. تواصل المقاصة حتى كل الدهون هي بالفاعلات والأنسجة يصل الشفافية (الشكل 1C). وستكون هذه 4-6 أسابيع لنصف الكرة دماغ الفأر و2-4 أسابيع لالحبل الشوكي.
- مرة واحدة يتم مسح الأنسجة، ونقلالعينة إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة وتغسل 4 مرات في PBST (الجدول 1) عند 40 درجة مئوية مع طيف والهز (~ 30 دورة في الدقيقة) على مدى 24 ساعة لإزالة بقايا SDS.
4. الجزيئية تلطيخ
تحذير: 4، 6 Diamidino-2-Phenylindole هيدروكلوريد (دابي) هو مصدر إزعاج وأي تجارب الاستفادة من ذلك يجب أن يؤديها في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين).
- نقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل نظيفة وملء مع 1 ميكروغرام / مل دابي في 1X PBST، ودرجة الحموضة 7.5. يحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 24 ساعة. الحفاظ على أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على عينات من تغطيتها في رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores.
- تغسل 3 مرات في PBST على RT لمدة لا تقل عن 6 ساعة / غسل.
مطابقة 5. مؤشر الانكسار
تحذير: 2،2'-Thiodiethanol (تد) هو مصدر إزعاج وأي تجارب الاستفادة من ذلك شولد أن يؤديها في غطاء الدخان ومع المعدات المناسبة الحماية الشخصية (معطف المختبر، والقفازات، وحماية العين).
- نقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل نظيفة وملء مع 30٪ (ت / ت) تد في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.5. احتضان عند 40 درجة مئوية مع الهز لطيف (~ 30 دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة.
- صرف 30٪ تد مع 63٪ (V / V) تد في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.5. احتضان عند 40 درجة مئوية مع طيف تهتز لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: سوف العينة يتقلص إلى الحجم الأصلي تقريبا. - على سطح مستو ونظيف لفة قطعة من مادة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام في اسطوانة مع قطر موحدة فقط أكبر قليلا من سمك العينة.
- وضع اسطوانة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام في دائرة مفتوحة (~ قطرها 25 مم الداخلي مع فتحة صغيرة في الأعلى) على 40 ملم الزجاج طبق أسفل. إذا تحتاج إلى إجراء التصويبات، وإزالة اسطوانة من الزجاج وقطع بشفرة حلاقة.
- استخدام تلميح P1000 ماصة لإنشاء ختم بين لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام والزجاج من قبلالمتداول حول الحافة الخارجية من الاسطوانة.
- مكان ~ 100 ميكرولتر 63٪ تد على طبق زجاج وتنتشر في جميع أنحاء لتغطية سطح الزجاج ضمن دائرة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام.
- باستخدام ملعقة، وضع بعناية العينة في منتصف الدائرة، مع الحرص على عدم تشكيل فقاعات.
- ماصة 100 ميكرولتر أخرى من 63٪ تد مباشرة على العينة، ثم وضع على الفور 40 ملم دائري غطاء زجاجي على لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام.
- استخدام الفهرس، والمتوسطة، والبنصر من كلتا اليدين، اضغط بعناية حول محيط الدائرة إلى أن يصدر الغطاء الزجاجي اتصال مع العينة.
- جلب ببطء الطبق أسفل الزجاج لوضع رأسي يستريح على سطح، ثم إضافة 63٪ تد مع ماصة حتى يصل إلى حل فتحة صغيرة في الأعلى. استخدام الوبر مسح مجانا لتجف قبالة الطرف ماصة بحيث الحل لا بالتنقيط على الزجاج. لتجنب الفقاعات في الغرفة، أبدا إفراغ ماصة على طول الطريق.
- إلىفتحة صغيرة، إضافة المطاط الصناعي السيليكون لإحاطة الدائرة وإنشاء غرفة مغلقة. انتظر 5 دقائق حتى يجف قبل التصوير.
6. المجهري
تحذير: إن أشعة الليزر المستخدمة في متحد البؤر، والإضاءة طائرة واحدة وضوء المجهر ورقة هي قوية جدا ويمكن أن يسبب العمى. يجب أن يتم تنفيذ أي تجارب باستخدام أشعة الليزر بعد تدريب مكثف وبحذر شديد وحماية العين المناسبة.
- وضع غرفة التصوير مع عينة داخل على مرحلة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.
- فتح برامج التصوير (انظر الجدول المواد). لتشغيل الليزر الأرجون الإثارة، انقر فوق علامة التبويب التكوين في الجزء العلوي من البرنامج ثم رمز الليزر. ضع علامة في المربع بجانب الأرجون لتشغيل الليزر ونقل على نطاق والشرائح إلى 30٪. مراقبة مؤشر الحارة ببطء إلى الموضع المحدد.
- عودة إلى علامة التبويب اكتساب في الأعلى. في المربع الكبير "إعدادات مسار الشعاع و# 34؛ الذهاب إلى تحميل / حفظ مربع تحديد واختيار القائمة المنسدلة لتحديد قناة الطول الموجي المناسبة لصورة YFP (527 نانومتر).
- تحديد الأهداف المناسبة للتصوير من خلال تحديد موقع الارتباط التشعبي الأحمر المسمى "الهدف: الكائن الحالي" ضمن المربع إعدادات القناة. النقر على علامة التبويب يفتح جميع الأهداف المتاحة، وسوف مجموعة مختارة تلقائيا تدوير البرج.
- أهداف الاستخدام (على سبيل المثال، 10X) مع مسافة عمل كبير (أكبر من سمك الأنسجة ليمكن تصوير، على سبيل المثال، 11 مم)، والفتحة العددية الكبيرة (على سبيل المثال، 0.3) لتعظيم دقة وضوح الصورة في الطائرة وتقليل بصري سمك الباب.
- في العمود الأيسر من القوائم المنسدلة، وفتح "XY: قرار" نافذة لوضع مصفوفة الاستحواذ، ودعا "تنسيق"، إلى 1024 X 1024 أو القيمة المناسبة للحد قرار الجانبي للهدف. تعيين عامل التكبير عند أدنى مستوى ممكن (على سبيل المثال، 10.7).
- في نفس الإطار، تعيين 8 المتوسط خط و1 إطار متوسط المعلمات من خلال إسقاط أسفل القوائم وصفت بشكل فردي وفقا لذلك. استخدام قيم كبيرة لارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء وقيم صغيرة لاقتناء السريع.
ملاحظة: 8 المتوسطات خط و1 متوسط إطار الحصول على صور عالية الجودة من نصف الكرة مخ الفأر في ما يقرب من 4 ساعات. - تحديد العينة باستخدام عناصر التحكم المرحلة. مرة واحدة في المجال التمثيلي مرئيا، تعيين الربح وتعويض.
ملاحظة: الربح وتعويض سوف تختلف إلى حد كبير بناء على نوع الأنسجة، fluorophores، و / أو ميزة التشريحية التي يجري تصويرها. لYFP، تعيين قيم 760-780 لتحقيق مكاسب ومن -1.0 إلى -1.5 للتعويض. - اختر "مسح البلاط" وتحديد حدود المنطقة من اهتمام. تعيين الحدود العليا والدنيا للض المكدس التي سيتم اكتسابها. تعيين سماكة المقطع البصرية على أساس الحد القسم قرار بصري الهدف ل.
ملاحظة: إن الهدف منوتعرف بصري الحد القسم قرار المقام الأول عن طريق الفتحة التي العددية. معظم برامج التحكم المجهر سيحسب تلقائيا مناسبا قيمة للهدف المستخدمة. من أجل هدف 10X مع الفتحة العددية 0.3 من شأنه أن يكون حوالي 11 ميكرون. - بدء عملية الاستحواذ.
ملاحظة: هذا قد يستغرق ساعات عدة. - جمع الصور عالية الدقة باستخدام الأهداف التكبير أعلى من مناطق معينة من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصور التنظيم الهيكلي للدماغ أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية التشكل والاتصال تؤثر على وظيفة الدماغ في الصحة والمرض. تقنيات المقاصة البصرية تجعل من الممكن لسكان الخلية الصورة في 3D في الأنسجة سليمة، مما يسمح لنا لدراسة مورفولوجية والربط متماسك.
الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية يقودها المروجين محددة لسكان شبه الخلايا تسمح واحد لندف بصرف النظر عن نمط معقد من الاتصال العصبي في الدماغ. وقد استخدمت THY1-YFP الفئران المعدلة وراثيا على نطاق واسع في الأدب المقاصة البصرية لهذه الفئران تعبر عن YFP في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الإسقاط الموجودة في قشرة الدماغ والحصين، فضلا عن الهياكل الأخرى في الدماغ (الشكل 2A و ب). وعلاوة على ذلك، YFP + القشرية الخلايا العصبية الخامس طبقة المشروع من خلال الجهاز القشري في الصورةالحبل بينال (الشكل 2C ود)، مما يجعلها مفيدة جدا في تقييم تأثير إهانة محور عصبي و / أو إصابة في الحبل الشوكي على الخلايا العصبية القشرية 15. من خلال استخدام المجهر متحد البؤر وباجتزاء البصرية من الأنسجة مسح بصريا واحدة يمكن تقييم بسهولة اختلافات في كثافة الخلايا العصبية عبر الهياكل التشريحية كبيرة.
بالإضافة إلى THY1-YFP الفئران المعدلة وراثيا، يمكن تصوير أي عدد من الفئران المعدلة وراثيا. حزب العمال التقدمي-EGFP الفئران المعدلة وراثيا صريحة تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في الخلايا قليلة التغصن ناضجة التعبير عن بروتين شحم بروتيني (حزب العمال التقدمي) في جميع أنحاء الدماغ والحبل الشوكي (الشكل 3A). PV-TdTomato الفئران المعدلة وراثيا تعبر عن TdTomato في مجموعة فرعية من parvalbumin (PV) معربا عن interneurons في المخيخ، المخطط والحصين (الشكل 3B). حتى في الفئران التي لا تعبر عن الجينات المحورة الفلورسنت، الوزن الجزيئي الأصباغ الفلورية الصغيرة، مثل DAPI، ويمكن بسهولة منتشر في الأنسجة هيدروجيل جزءا لا يتجزأ من وتسمح بتقييم نوى الخلايا في الدماغ (الشكل 4).
الشكل 1: مراحل مختلفة من الدماغ المقاصة صورة من THY1-YFP + مخ الفأر التي تم إزالتها من الجمجمة (أ). صورة جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل THY1-YFP + ماوس نصف الكرة المخ (ب). صورة THY1-YFP + ماوس المخ في نصف الكرة بعد إزالة الدهون (ج). أشرطة النطاق هي 5 ملم في كل لوحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: THY1-YFP التعبير في دماغالثانية الحبل الشوكي. THY1-YFP + الخلايا العصبية في القشرة المخية والحصين تصويرها في 5X التكبير وإعادة بنائها في 3D (أ). والحد الأقصى الإسقاط كثافة كومة صورة 10X من قشرة الدماغ مما يدل على تشجر شجيري من الخلايا العصبية طبقة الخامس هرمي القشرية (ب). THY1-YFP التعبير في الحبل الشوكي سليمة عنق الرحم والصدر تصوير في 5X التكبير وإعادة بنائها في 3D (ج). والحد الأقصى الإسقاط كثافة كومة صورة 10X من الحبل الشوكي مما يدل على محاور عصبية فردية (د). الحانات هي مقياس 1 مم في الفقرة (أ)، و 100 ميكرومتر في (ب) و 2 مم في (ج)، و 100 ميكرومتر في (د). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): حزب العمال التقدمي-EGFP وPV-TdTomato التعبير في الدماغ. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تلطيخ دابي في التعبير دابي في المخيخ من نصف الكرة المخية سليمة تصويرها في 5X التكبير الدماغ. الصورة هي حوالي 1 ملم من المستوى السهمي النصفي. يظهر أقحم مستوى التفاصيل واضحة في هذا العمق التصوير في التكبير 10x. يمنع على نطاق وإعادة 250 ميكرون في لوحة رئيسية و 50 ميكرون في أقحم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عازلة | مادة كيميائية | التركيز النهائي |
| حل نضح | ||
| 10X الفوسفات مخزنة المالحة | 1X | |
| نترات الصوديوم | 0.5٪ ث / ت | |
| الهيبارين | 10 U / مل | |
| حل تثبيتي | ||
| 10X الفوسفات مخزنة المالحة | 1X | |
| Paraformaldehyدي | 4٪ ت / ت | |
| حل هيدروجيل | ||
| 10X الفوسفات مخزنة المالحة | 1X | |
| امتصاص العرق | 4٪ ت / ت | |
| مادة الأكريلاميد | 4٪ ت / ت | |
| مكرر الأكريلاميد | 0.05٪ ت / ت | |
| VA-044 المبادر | 0.25٪ ث / ت | |
| عازلة المقاصة | ||
| حمض البوريك | 200 ملي | |
| الصوديوم دوديسيل كبريتات | 4٪ ث / ت | |
| PBST | ||
| 10X الفوسفات مخزنة المالحة | 1X | |
| تريتون X-100 | 0.1٪ ت / ت | |
| أزيد الصوديوم | 0.1٪ ث / ت |
الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة والحلول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المقاصة سلبية من هيدروجيل جزءا لا يتجزأ من الأنسجة (وضوح السلبي) هي طريقة بسيطة وغير مكلفة لإزالة أجزاء كبيرة من الأنسجة. لا يتطلب هذا النهج معدات مخصصة، ويمكن بسهولة أن يؤديها في شاكر التحكم في درجة حرارته. على مدى غضون بضعة أسابيع، حتى الكبيرة، والأنسجة العصبي للغاية، مثل المخ بأكمله أو الحبل الشوكي، وسوف تصبح شفافة ومناسبة للفحص المجهري. على الرغم من أن هذا التقرير قد ركز على تطهير أنسجة الجهاز العصبي المركزي، ويمكن تطبيقها وضوح السلبي إلى أي نوع من الأنسجة.
وقد تمت مناقشة نقاط القوة والضعف النسبية لتقنيات المقاصة البصرية سابقا في الأدب 13،17،22، ولكن وضعت أكثر وضوحا في 23. وضوح السلبي هو مناسب تماما للتجارب حيث يتم مسح أعداد كبيرة من العينات في وقت واحد واستنساخ له أهمية كبيرة. استخدام هيدروجيل لتوفير دعم إضافي للأنسجة تسهل مultiple تحقق من الأنسجة. في هذا التقرير، صغيرة الوزن الجزيئي صبغة، دابي، وقد تجلى، ولكن جولات متعددة من الأجسام المضادة التحقيق ممكنة أيضا مع هذا النهج.
النهج المبين أعلاه ينحرف من وجهة نظرنا بروتوكول نشرت سابقا 15 في بضعة طرق هامة. أولا، في النهج الحالي، لم perfused العينات intracardially مع هيدروجيل. ويعزى ذلك إلى حقيقة أن هيدروجيل يمكن تتبلمر قبل الأوان في الأنابيب والإبر من جهاز نضح، مما يؤدي إلى تروية دموية غير مكتمل والمقاصة غير متناسقة. احتضان بارافورمالدهيد الثابتة الأنسجة في هيدروجيل لمدة 7 أيام ويتسق مع بروتوكول ضوح الأصلي 14، على الرغم من استخدام حضانة 1 يوم 1 - 3 مم أقسام الأنسجة السميكة في تقنية وضوح السلبي (باكت) 17. ثانيا، فإن هذا النهج يؤدي إزالة الدهون عند درجة حرارة أعلى قليلا أن ذكرت سابقا 15-17. درجة حرارة أعلىه يسرع إزالة الدهون، ولكن يجب أن تكون متوازنة ضد إمكانية لخسارة فادحة للسلامة الأنسجة (ذوبان). عن طريق زيادة درجة حرارة الحضانة من 8 درجة مئوية (45 درجة مئوية) لمدة 7 أيام، ثم بنسبة 3 ° C (40 ° C) للفترة المتبقية من عملية الإزالة الدهون، وتسارعت المقاصة الأنسجة، ولكن دون التعرض لخطر المتزامن ل فقدان سلامة الأنسجة. هذه الزيادة في درجة الحرارة متسقة مع درجات الحرارة المسجلة خلال الكهربي المقاصة الأنسجة (ETC) في البروتوكول وضوح الأصلي (50 درجة مئوية) 14. وعلاوة على ذلك، وقد لوحظ أي انخفاض في شدة fluorophores أعرب transgenically ولا انخفاض في تلطيخ دابي.
نقص الأكسجين هو خطوة هامة في خلق هيدروجيل. قد تتبلمر هيدروجيل في وجود الأكسجين المذاب في حل هيدروجيل، ولكن في أيدينا وكان معدل واكتمال البلمرة أكثر متغير الكثير دون نقص الأكسجين. إذا كان حydrogel لا بلمرة، والسبب الأكثر شيوعا هو وجود الأكسجين في هيدروجيل.
عملية المقاصة البصرية من السهل ملحوظ لتنفيذ، ومع ذلك، فإن المجهري الذي يلي قد يكون معقدا جدا. من الأهمية الحاسمة هي أهداف تستخدم لصورة الأنسجة. المسافة عمل موضوعي يحدد عمق ما في وسعها الصورة في عينة الأنسجة. هدفا مع مسافة العمل من 2 ملم لا يمكن إلا أن صورة 2 مم في عينة، لذلك يجب أن تكون المسافة العمل من هدف أكبر من سمك العينة من أجل صورة تماما. وبالمثل، فإن الفتحة العددية من هدف تضع حدا لحجم الميزات التي يمكن أن تحلل على حد سواء في الطائرة وسمك المقاطع البصرية التي يمكن الحصول مجدية. انتقائية طائرة الإضاءة المجهري (SPIM) ورقة المجهر الضوئي (LSM) يمكن التغلب على قيود على سمك الباب البصرية وفقا لطبيعة الإضاءة، ولكن هذه مايكروينCOPES غير متوفرة على نطاق واسع. الفتحة العددية العالية، والأهداف والعمل لمسافات كبيرة ونادرة وباهظة الثمن، ولكن ضرورية للتصوير عالية الجودة من قطاعات واسعة مسح بصريا.
مرة واحدة وقد تم الحصول على الصور، فإنها غالبا ما تكون كبيرة جدا، وتتراوح بين عدة مئات ميغابايت لدقة منخفضة (على حد سواء في الطائرة وض الاتجاه) صورة لمرض السل عدد قليل للحصول على صورة عالية الدقة جمعها على مغلق. أجهزة الكمبيوتر المستخدمة في تحليل الصور تتطلب ليس فقط قدرا كبيرا من التخزين، ولكن كميات كبيرة من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) لمعالجة الصور. حزم البرمجيات المناسبة لتحليل كبيرة كميات صورة مسح بصريا وتشمل أميرة، Imaris، ويماغيج 14-16.
ومن بين القيود المفروضة على هذا النهج، وضوح السلبي يتطلب المزيد من الوقت لمسح الأنسجة من النهج المقاصة البصرية الأخرى. تقليل حجم الأنسجة إلى مسح من قبل التشذيب أو باجتزاء ذلك إلى أجزاء أصغر يمكن أكسلerate الدهون التنظيف. أيضا، والحد من تركيز امتصاص العرق في هيدروجيل سيقوم بدوره انخفاض يشابك وزيادة حجم هيدروجيل المسام، مما يؤدي إلى إزالة أسرع 17، على الرغم من أن هذا قد يؤدي إلى مزيد من التوسع الأنسجة، المجربون الفردية قد تجد أن الأمر يستحق انخفاض في المقاصة مرة. وعلاوة على ذلك، جنبا إلى جنب مع تد كعامل المقاصة، وكمية من توسيع الأنسجة بشكل عام قد تكون محدودة.
على الرغم من يصف هذا التقرير استخدام صغيرة الأصباغ الوزن الجزيئي، الأجسام المضادة بالتدقيق هو الخطوة التالية الطبيعية جدا. وجود هيدروجيل لا يوفر سوى الدعم المادي لأنسجة مسح، ولكن أيضا بمثابة عائقا لاختراق الأجسام المضادة في عمق الأنسجة. انخفاض تركيز مادة الأكريلاميد أو سوف تركيز امتصاص العرق يزيد من حجم المسام في هيدروجيل، وتسهيل (وبالتالي تسريع) الأجسام المضادة تغلغل 17، ولكن هذا له تأثير ضار على TISSالتوسع رق. ومع ذلك، الأجسام المضادة تحقق من كتل من الأنسجة يمكن أن تتم في غضون أيام والدماغ كله في بضع أسابيع باستخدام تركيزات مادة الأكريلاميد وامتصاص العرق وصفها في التقرير الأصلي 14.
تقنيات المقاصة البصرية تسمح لأحد أن ننظر بعمق في الدماغ، تعزيز فهم بنيتها ووظيفتها. وهذه الأدوات الجديدة ستمكن الباحثين من تصور الدماغ في قرارات الخلوية والجزيئية، وزيادة فهمنا لهذه أعقد من الأجهزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بسخاء من قبل المعاهد الوطنية لل/ معهد الصحة الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NIH / NINDS) منحة 1R01NS086981 ومؤسسة كونراد هيلتون. نشكر الدكتور لوران Bentolila والدكتور ماثيو Schibler للمساعدة لا تقدر بثمن مع المجهر متحد البؤر. نشكر تلك التي ساهمت في المنتدى ضوح (http://forum.claritytechniques.org). نخص بالشكر الدكتور كارل Deisseroth لفتح مختبره لتعليم هذه التقنية الرائعة. الكتاب ممتنون للدعم السخي من منظمة الدماغ رسم الخرائط الأبحاث الطبية، ومؤسسة الدماغ رسم الخرائط دعم، بيرسون-افليس مؤسسة، مؤسسة Ahmanson، مجموعة شركات رأس المال للأعمال الخيرية، ويليام م وليندا صندوق الخيرية Dietel R.، وصندوق نورث ستار . تم البحث عنها في هذا المنشور أيضا بدعم جزئي من قبل المركز الوطني للبحوث الموارد ومكتب المدير الأمةآل معاهد الصحة تحت أرقام جائزة C06RR012169، C06RR015431، وS10OD011939. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
