Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices. souris THY1-YFP, EGFP et PLP-PV-tdTomato ont été utilisées pour ces expériences, mais toutes les souris exprimant des protéines fluorescentes peuvent être effacées avec succès et imagée.
1. Préparation des tissus
Attention: paraformaldéhyde (PFA) et d'acrylamide sont toxiques et irritants. Effectuer des expériences en utilisant ces réactifs dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).
- Sacrifiez l'animal dans la chambre de l'euthanasie avec ~ 1 ml de isoflurane jusqu'à ce que la respiration cesse (~ 2 - 3 min).
- Utiliser une pompe péristaltique à régler ~ 5 ml / min pour perfuser intracardiaque la souris avec une solution de perfusion (tableau 1) à 4 ° C jusqu'à ce que le sang est éliminée des tissus (5-10 min).
- Changez le perfusat à la solution de fixation (tableau 1)à 4 ° C jusqu'à ce que le cou et la queue ont sensiblement rigidifiée (5 - 10 min).
- Mettre fin à la perfusion et décapite l'animal. Disséquer soigneusement le cerveau du crâne d'abord retirer le tissu conjonctif entourant le crâne et les os puis en éliminant de la surface ventrale du crâne et en soulevant le cerveau (Figure 1a), comme décrit dans 20.
Note: Donnez un soin particulier à la suppression de l'os entourant les lobes flocculonodulaire du cervelet et des bulbes olfactifs.- Disséquer la moelle épinière de la colonne vertébrale en insérant délicatement la pointe d'une amende, ciseaux nette entre la moelle épinière et la colonne vertébrale et en coupant les différents segments de la colonne vertébrale de suite, comme décrit dans 21.
- Hemisect le cerveau en le plaçant dans une matrice de cerveau de souris en plastique et la découpe le long de la ligne médiane, avec une lame de matrice.
- Ajouter chaque hémisphère et la moelle épinière pour séparer 50 ml baignoire centrifugeuse~ es avec 40 ml d' une solution d'hydrogel (tableau 1). De ce point couvercle avant les tubes avec du papier d'aluminium pour protéger les fluorophores pendant toutes les étapes ultérieures.
- Incuber le tube contenant l'échantillon dans un hydrogel à 4 ° C avec agitation douce (~ 30 tours par minute) pendant 7 jours.
2. Polymérisation
- Jeter ~ 25 ml d'hydrogel, en conservant l'échantillon et ~ 25 ml d'hydrogel dans le tube de centrifugation.
- Désoxygéner l'échantillon en retirant le bouchon et placer le tube centrifuge dans un bocal de dessiccateur et reliant le pot à un vide. Appliquer le vide pendant au moins 10 minutes pour permettre aux gaz dissous pour sortir de la solution et former des bulles. Agitez doucement pour déloger les bulles.
- Remplacer le vide dans le pot de dessiccateur avec 100% de l'azote gazeux plus de 2 - 3 min. Une fois que la pression égalise (une fois la partie supérieure du pot de dessiccateur peut être ouvert), plafonner rapidement le tube pour empêcher la réintroduction de l'oxygène.
- Polymèreiser l'hydrogel en plaçant le tube contenant l'échantillon dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 3 heures jusqu'à ce que la polymérisation soit terminée. Hydrogel polymérisé prendra une consistance (figure 1b) analogue à un gel. Remarque: Une petite quantité d'hydrogel non polymérisé dans la partie supérieure est acceptable.
- Utilisez une spatule pour retirer l'échantillon polymérisé du tube de centrifugeuse, puis couper l'excédent hydrogel de l'échantillon.
- Retirer l'hydrogel restant en plaçant l'échantillon sur une fibre essuyez libre et en frottant doucement et rouler le tissu sur elle, laissant derrière une mince couche d'hydrogel polymérisé sur l'échantillon.
3. Lipid Removal
Remarque: le tissu Lipid-autorisé est fragile, manipuler avec précaution. Utilisez un filtre cellulaire lors de la vidange du tube pour éviter de perdre l'échantillon. En outre, l'échantillon va gonfler tout au long du processus de compensation, cependant, le gonflement peut être inversée pendant le processus d'adaptation d'indice de réfraction.
Attention: Sodium dodécylsulfate (SDS) et l'acide borique sont irritants. Effectuer des expériences les utilisant dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).
- Transférer l' échantillon polymérisé à 50 ml tube de centrifugeuse propre et ajouter 45 ml de compensation tampon (tableau 1). Incuber à 45 ° C avec agitation douce par secousses (~ 30 tpm). Changer le tampon quotidien pendant 7 premiers jours en versant hors du tampon de compensation utilisé dans les déchets chimiques et en ajoutant ~ 45 ml de tampon de compensation frais. Gardez les tubes de centrifugeuse contenant les échantillons recouverts de papier d'aluminium pour protéger les fluorophores.
- Après les 7 premiers jours, incuber l'échantillon à 40 ° C et l'échange tampon de compensation tous les 2 - 3 jours. Continuer compensation jusqu'à ce que tous les lipides sont solubilisés et le tissu atteint la transparence (figure 1c). Ce sera de 4 - 6 semaines pour un hémisphère du cerveau de la souris et 2 - 4 semaines pour une moelle épinière.
- Une fois que le tissu est effacé, le transfertéchantillon à un nouveau 50 ml tube de centrifugeuse et laver 4 fois en PBST (tableau 1) à 40 ° C avec agitation douce (~ 30 min) de plus de 24 heures pour éliminer le SDS résiduel.
4. Molecular Coloration
Attention: 4 ', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) est un irritant et toutes les expériences utilisant elle doit être effectuée dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).
- Transférer l'échantillon à un tube de 15 ml de centrifugeuse propre et remplir avec 1 pg / ml de DAPI dans 1x PBST, pH 7,5. Incuber à température ambiante (TA) pendant 24 h. Gardez les tubes de centrifugeuse contenant les échantillons recouverts de papier d'aluminium pour protéger les fluorophores.
- Laver 3 fois en PBST à température ambiante pendant au moins 6 h / lavage.
5. Refractive Index Matching
Attention: 2,2'-thiodiéthanol (TDE) est un irritant et des expériences en utilisant ce should être effectuée dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).
- Transférer l'échantillon à un tube de 15 ml de centrifugeuse propre et remplir avec 30% (v / v) TDE dans 1x PBS, pH 7,5. Incuber à 40 ° C avec agitation douce (~ 30 rpm) pendant 24 heures.
- 30% TDE échange avec 63% (v / v) TDE dans 1 x PBS, pH 7,5. Incuber à 40 ° C avec agitation douce pendant 24 heures.
Remarque: L'échantillon sera reculer à la taille environ d'origine. - Sur une surface plane, propre rouler un morceau d'adhésif réutilisable dans un cylindre avec un diamètre uniforme légèrement supérieure à l'épaisseur de l'échantillon.
- Poser le cylindre adhésif réutilisable dans un cercle ouvert (~ diamètre 25 mm intérieur avec une petite ouverture en haut) sur un verre plat en bas de 40 mm. Si des corrections doivent être apportées, retirer le cylindre du verre et coupé avec une lame de rasoir.
- Utiliser un embout de pipette p1000 pour créer un joint entre l'adhésif réutilisable et le verre parrouler sur le pourtour extérieur du cylindre.
- Lieu ~ 100 ul 63% TDE sur le plat en verre et se répandre pour couvrir la surface du verre dans le cercle d'adhésif réutilisable.
- Avec une spatule, placer soigneusement l'échantillon dans le milieu du cercle, en prenant soin de ne pas former des bulles.
- Pipeter autre 100 ul de 63% TDE directement sur l'échantillon, puis placer immédiatement une circulaire couvercle en verre de 40 mm sur l'adhésif réutilisable.
- Utilisation de l'index, le majeur et l'annulaire des deux mains, appuyez avec précaution sur le pourtour du cercle jusqu'à ce que le verre de couverture a pris contact avec l'échantillon.
- Ramenez lentement le plat de fond de verre pour une position verticale en appui sur une surface, puis ajouter 63% TDE avec une pipette jusqu'à ce que la solution atteigne la petite ouverture en haut. Utilisez un charpie essuyez libre pour sécher la pointe de la pipette de sorte que la solution ne coule pas sur le verre. Pour éviter les bulles dans la chambre, jamais vider la pipette tout le chemin.
- Àla petite ouverture, ajouter élastomère de silicone pour enfermer le cercle et créer une chambre fermée. Attendre 5 minutes pour sécher avant de l'imagerie.
6. Microscopie
Attention: Les lasers utilisés dans confocal, seule illumination d'avion et la microscopie nappe de lumière sont très puissant et peut provoquer la cécité. Les expériences utilisant des lasers doivent être effectués après une formation approfondie et avec une grande prudence et une protection oculaire appropriée.
- Placer la chambre d'imagerie à l'intérieur de l'échantillon sur la platine d'un microscope à balayage laser confocal.
- Ouvrez le logiciel d'imagerie (voir le tableau des matériaux). Pour activer le laser argon d'excitation, cliquez sur l'onglet de configuration en haut du programme puis sur l'icône de laser. Cochez la case à côté de l'argon pour alimenter le laser et déplacer l'échelle de diapositives à 30%. Observez le pointeur se réchauffer lentement jusqu'à la position sélectionnée.
- Retour à l'onglet acquérir au sommet. Dans la grande boîte "faisceau Réglages Chemin &# 34; aller à la charge / enregistrer boîte réglage et sélectionnez le menu déroulant pour sélectionner un canal de longueur d'onde appropriée à l'image YFP (527 nm).
- Sélectionnez des objectifs appropriés pour l'imagerie en plaçant le lien hypertexte rouge marqué «objectif: objet courant" sous la boîte des paramètres de canal. En cliquant sur l'onglet ouvre tous les objectifs disponibles et une sélection sera automatiquement tourner la tourelle.
- Utiliser des objectifs (par ex., 10X) avec une grande distance de travail (supérieure à l'épaisseur du tissu à imager, par exemple 11 mm) et une grande ouverture numérique (par ex., 0,3) afin de maximiser dans le plan de résolution d'image et de minimiser l'épaisseur de la section optique.
- Sur la colonne de gauche de menus déroulants, ouvrez le "XY: résolution" fenêtre pour définir la matrice d'acquisition, appelé "format", à 1.024 x 1.024 ou une valeur appropriée pour la limite de résolution latérale de l'objectif. Réglez le facteur de zoom aussi bas que possible (par exemple., 1.7).
- Dans la même fenêtre, réglez 8 moyenne de ligne et 1 cadre paramètres moyens en laissant tomber les menus étiquetés individuellement en conséquence. Utilisez de grandes valeurs pour un rapport signal-bruit et de petites valeurs pour l'acquisition rapide.
Note: 8 moyennes de ligne et 1 moyenne de trame vont acquérir des images de haute qualité d'un hémisphère du cerveau de la souris dans environ 4 heures. - Repérez l'échantillon en utilisant les commandes de scène. Une fois un champ représentatif est visible, régler le gain et l'offset.
Remarque: Le gain et le décalage varie considérablement en fonction du type de tissu, des fluorophores et / ou caractéristique anatomique imagée. Pour YFP, définir des valeurs 760-780 pour le gain et de -1,0 à -1,5 pour le décalage. - Sélectionnez "scan de tuiles" et sélectionnez les limites de la région d'intérêt. Définissez les limites supérieure et inférieure de la z-stack à acquérir. Régler l'épaisseur de la coupe optique sur la base de l'article optique limite de résolution de l'objectif.
Note: Un objectif deoptique limite la section de résolution est définie principalement par son ouverture numérique. La plupart des logiciels de contrôle de microscope calcule automatiquement une valeur appropriée pour l'objectif utilisé. Pour un objectif 10X avec une ouverture numérique de 0,3 qui serait d'environ 11 um. - Lancement de l'acquisition.
Remarque: Cette opération peut prendre plusieurs heures. - Collecter des images haute résolution en utilisant des objectifs de grossissement plus élevé des régions d'intérêt spécifiques.
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Representative Results
Visualiser l'organisation structurelle du cerveau est essentielle pour comprendre comment la morphologie et la connectivité affectent le fonctionnement du cerveau dans la santé et la maladie. techniques de compensation optiques permettent aux populations de cellules d'image en 3D dans des tissus intacts, ce qui nous permet d'étudier la morphologie et de la connectivité cohésive.
Les souris qui expriment des protéines fluorescentes entraînée par des promoteurs spécifiques pour les sous-populations de cellules permettent un à démêler le schéma complexe de la connectivité neuronale dans le cerveau. Souris transgéniques THY1-YFP ont été largement utilisés dans la littérature de compensation optique , car ces souris expriment YFP dans un sous - ensemble de neurones de projection qui se trouvent dans le cortex cérébral et l' hippocampe, ainsi que d' autres structures dans le cerveau (figure 2a et b). De plus, YFP + neurones V couche corticale projettent à travers le tractus cortico - spinal dans les scordon pinal (Figure 2c et d), ce qui les rend très utiles pour évaluer l'effet de l' insulte et / ou des lésions axonales dans la moelle épinière sur les neurones corticaux 15. Grâce à l'utilisation de la microscopie confocale et sectionnement optique des tissus optiquement compensés, on peut facilement évaluer les différences de densité neuronale dans de vastes structures anatomiques.
En plus des souris transgéniques THY1-YFP, un nombre quelconque de souris transgéniques peut être imagée. Souris transgéniques expriment PLP-EGFP améliorée protéine fluorescente verte (EGFP) dans les oligodendrocytes matures exprimant la protéine protéolipidique (PLP) dans le cerveau et la moelle épinière (figure 3a). Souris transgéniques expriment tdTomato PV tdTomato dans un sous - ensemble de la parvalbumine (PV) exprimant les interneurones dans le cervelet, le striatum et l' hippocampe (figure 3b). Même chez les souris qui ne sont pas exprimer des transgènes fluorescents, de faible poids moléculaire, des colorants fluorescents, tels que la DAPI peut facilement se diffuser dans les tissus d'hydrogel incorporé et permettre l'évaluation des noyaux cellulaires dans le cerveau (figure 4).
Figure 1:. Différentes étapes de Brain Clearing Photographie du cerveau THY1-YFP + souris qui a été retiré du crâne (a). Photographie de THY1-YFP + cerveau de souris hémisphère hydrogel embarqué (b). Photographie de THY1-YFP + souris hémisphère du cerveau après l' élimination des lipides (c). Les barres d'échelle sont 5 mm dans chaque panneau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: THY1-YFP Expression dans le cerveau d' unnd moelle épinière. Thy1-YFP + neurones dans le cortex cérébral et l' hippocampe imagé à grossissement 5X et reconstruit en 3D (a). Une projection d'intensité maximale d'une image 10X pile du cortex cérébral démontrant l'arborisation dendritique des neurones couche V pyramidales du cortex (b). l'expression THY1-YFP dans une moelle épinière cervicale et thoracique intacte imagée à grossissement 5X et reconstruit en 3D (c). Une projection d'intensité maximale d'une image 10X pile de la moelle épinière, montrant les axones individuels (d). Les barres d'échelle sont 1 mm (a), 100 pm (b), 2 mm (c), et 100 um (d). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: PLP-EGFP et PV-tdTomato Expression dans le cerveau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: DAPI Coloration dans l'expression de DAPI Cerveau dans le cervelet d'un hémisphère cérébral intact imagé au grossissement 5X.. L'image est d'environ 1 mm par rapport au plan sagittal médian. L'encart montre le niveau de détail visible à cette profondeur d'imagerie à un grossissement de 10X. Échelle barres d'unre 250 um dans le panneau principal et 50 pm dans l'encart. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Tampon | Chimique | La concentration finale |
| Solution de perfusion | ||
| 10x tampon phosphate salin | 1 fois | |
| Nitrate de sodium | 0,5% p / v | |
| héparine | 10 U / ml | |
| solution de fixation | ||
| 10x tampon phosphate salin | 1 fois | |
| Paraformaldehyde | 4% v / v | |
| solution Hydrogel | ||
| 10x tampon phosphate salin | 1 fois | |
| paraformaldéhyde | 4% v / v | |
| acrylamide | 4% v / v | |
| Bis-acrylamide | 0,05% v / v | |
| VA-044 Initiator | 0,25% p / v | |
| Tampon de compensation | ||
| Acide borique | 200 mM | |
| De dodécylsulfate de sodium | 4% p / v | |
| PBST | ||
| 10x tampon phosphate salin | 1 fois | |
| Triton X-100 | 0,1% v / v | |
| De l'azide de sodium | 0,1% p / v |
Tableau 1: Liste des Tampons et solutions.
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Discussion
compensation passive de tissus d'hydrogel incorporé (CLARITY passive) est une méthode simple et peu coûteuse pour la compensation de gros morceaux de tissu. Cette approche ne nécessite pas de matériel dédié et peut facilement être réalisé dans un agitateur à température contrôlée. En l'espace de quelques semaines, même les grandes, les tissus fortement myélinisées, comme un cerveau entier ou de la moelle épinière, deviendront transparents et adaptés pour la microscopie. Même si ce rapport a mis l'accent sur la compensation des tissus du système nerveux central, CLARITY passive peut être appliquée à tous les tissus.
Les forces et les faiblesses des techniques de compensation optiques ont été discutés dans la littérature 13,17,22, mais sont le plus clairement définis dans 23. CLARITY passive est bien adapté pour des expériences où un grand nombre d'échantillons sont effacés simultanément et la reproductibilité est d'une grande importance. L'utilisation d'un hydrogel pour fournir un soutien supplémentaire au tissu facilite multiple palpage du tissu. Dans ce rapport, un petit colorant poids moléculaire, DAPI, a été démontrée, mais plusieurs tours d'anticorps de sondage sont également possibles avec cette approche.
L'approche décrite ci - dessus dévie de notre protocole précédemment publié 15 dans un couple de façon significative. Tout d'abord, dans l'approche actuelle, les échantillons ne sont pas intracardiaque perfusés avec hydrogel. Ceci était dû au fait que l'hydrogel peut prématurément polymériser dans le tube et les aiguilles de l'appareil de perfusion, ce qui conduit à des perfusions de compensation incomplète et incohérente. Incubation tissus paraformaldéhyde fixe en hydrogel pendant 7 jours est compatible avec le protocole CLARITY 14 d' origine, si une incubation de 1 jour est utilisé pour 1 - coupes de tissus épais 3 mm dans la Technique CLARITY PAssive (PACT) 17. D' autre part, cette méthode assure l' élimination des lipides à une température légèrement plus élevée que précédemment rapporté 15-17. temperatur supérieure accélère l'élimination des lipides, mais doit être équilibrée contre la possibilité d'une perte catastrophique de l'intégrité des tissus (de fusion). En augmentant la température d'incubation de 8 ° C (45 ° C) pendant 7 jours, puis de 3 ° C (40 ° C) pendant le reste du processus d'élimination des lipides, la compensation de tissu est accélérée, mais sans le risque concomitant d' la perte d'intégrité des tissus. Cette augmentation de température est compatible avec des températures signalées au cours de compensation électrophorétique tissulaire (ETC) dans le protocole CLARITY original (50 ° C) 14. De plus, aucune diminution de l'intensité de fluorophores transgénique exprimé ni diminution de la coloration DAPI a été observée.
La désoxygénation est une étape importante dans la création de l'hydrogel. L'hydrogel peut se polymériser en présence d'oxygène dissous dans la solution d'hydrogel, mais dans nos mains, la vitesse et le caractère complet de la polymérisation était bien plus variable sans désoxygénation. Si l'hydrogel ne polymérise pas, la raison la plus fréquente est la présence d'oxygène dans l'hydrogel.
Le processus de compensation optique est remarquablement facile à mettre en œuvre, cependant, la microscopie qui suit peut être assez compliqué. D'une importance critique sont les objectifs utilisés pour l'image du tissu. La distance de travail d'un objectif définit la profondeur à laquelle il peut imager dans un échantillon de tissu. Un objectif à une distance de travail de 2 mm ne peut image 2 mm dans un échantillon, par conséquent, la distance de travail de l'objectif doit être supérieure à l'épaisseur de l'échantillon pour l'image complètement. De même, l'ouverture numérique d'un objectif fixe une limite à la taille des éléments qu'elle peut résoudre à la fois dans le plan et l'épaisseur des sections optiques qu'elle peut acquérir de manière significative. Avion sélectif Illumination Microscopy (SPIM) et Feuille Lumière Microscopy (LSM) peuvent surmonter la limitation de l'épaisseur de section optique par la nature de l'illumination, mais ces microschapes ne sont pas largement disponibles. ouverture numérique élevée, grands objectifs de distance de travail sont rares et coûteux, mais sont nécessaires pour l'imagerie de haute qualité à partir de grandes sections optiquement défrichées.
Une fois que les images ont été acquises, elles sont souvent très grandes, allant de plusieurs centaines de Mo pour une faible résolution (à la fois dans le plan et la direction z) l'image à quelques TB pour une image haute résolution recueillies sur un LSM. Les ordinateurs utilisés pour l'analyse de l'image nécessitent non seulement une grande partie de stockage, mais de grandes quantités de mémoire à accès aléatoire (RAM) pour le traitement de l'image. Les progiciels appropriés de l'analyse de grands volumes d'images optiquement défrichées comprennent Amira, Imaris et ImageJ 14-16.
Parmi les limites de cette approche, CLARITY passive nécessite plus de temps pour effacer les tissus que d'autres approches de compensation optique. La diminution du volume du tissu est interceptée par la coupe ou la coupe en petits morceaux peuvent Accellipide-élimination nérer. En outre, la diminution de la concentration de paraformaldéhyde dans l'hydrogel à son tour diminuer la réticulation et augmenter la taille hydrogel des pores, ce qui conduit à la compensation plus rapide 17, bien que cela peut conduire à une expansion plus grande de tissu, les expérimentateurs individuels peuvent trouver que cela vaut la diminution de la compensation temps. En outre, combiné avec TDE comme agent de compensation, le montant de l'expansion globale des tissus peut être limitée.
Bien que ce rapport décrit l'utilisation de petits colorants de poids moléculaire, l'anticorps de sondage est une prochaine étape très naturel. La présence de l'hydrogel non seulement fournit un support physique pour les tissus défrichées, mais sert aussi comme un obstacle à la pénétration des anticorps profondément dans le tissu. La diminution de la concentration d'acrylamide ou de la concentration de paraformaldéhyde augmentera la taille des pores dans l'hydrogel, ce qui facilite (et donc de l' accélération) anticorps 17 pénétration, mais cela a un effet délétère sur tissl'expansion ue. Néanmoins, l' anticorps de sondage de blocs de tissu peut être réalisé en quelques jours et cerveau entier dans quelques semaines en utilisant les concentrations d'acrylamide et de paraformaldéhyde décrites dans le rapport initial 14.
techniques de compensation optiques permettent de regarder profondément dans le cerveau, favoriser la compréhension de sa structure et de la fonction. Ces nouveaux outils permettront aux chercheurs de visualiser le cerveau à des résolutions cellulaires et moléculaires, en augmentant notre compréhension de ce plus complexe d'organes.
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Acknowledgments
Ce travail a été généreusement soutenu par les National Institutes of Health / Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NIH / NINDS) subvention 1R01NS086981 et la Fondation Conrad N. Hilton. Nous remercions le Dr Laurent Bentolila et le Dr Matthew Schibler pour leur aide précieuse à la microscopie confocale. Nous remercions ceux qui ont contribué au forum CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). Nous remercions tout particulièrement le Dr Karl Deisseroth pour ouvrir son laboratoire pour enseigner cette technique fascinante. Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien généreux de l'Organisation Brain Mapping Medical Research, Fondation de soutien à Brain Mapping, Pierson-Lovelace Foundation, La Fondation Ahmanson, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. et Linda Fonds Philanthropique Dietel R., et le Fonds Northstar . La recherche rapportée dans la présente publication a également été partiellement soutenue par le National Center for Research Resources et par le Bureau du Directeur de la National Instituts de la santé sous les numéros d'attribution C06RR012169, C06RR015431 et S10OD011939. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
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