Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer. Thy1-YFP, PLP-EGFP och PV-tdTomato möss användes för dessa experiment, men alla möss som uttrycker fluorescerande proteiner kan framgångsrikt rensas och avbildas.
1. Vävnadsberedning
Varning: Paraformaldehyd (PFA) och akrylamid är giftiga och irriterande. Utföra experiment som utnyttjar dessa reagens i ett dragskåp och med lämplig personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon).
- Offra djur i eutanasi kammare med ~ 1 ml isofluran tills andningen upphör (~ 2-3 min).
- Använda en peristaltisk pump inställd på ~ 5 ml / min till intracardially BEGJUTA musen med perfusion lösning (tabell 1) vid 4 ° C tills blodet rensas från vävnaderna (5-10 min).
- Ändra perfusatet till fixeringslösning (tabell 1)vid 4 ° C tills halsen och svans har signifikant stelnade (5-10 min).
- Avsluta perfusion och decapitate djuret. Noggrant dissekera ut hjärnan från skallen genom att först avlägsna den bindväv som omger skallen och sedan avlägsna ben från den ventrala ytan av skallen och lyfta hjärnan ut (figur 1a), såsom beskrivs i 20.
Obs: Ge särskild omsorg för att avlägsnandet av ben kring flocculonodular lober lillhjärnan och lukt glödlampor.- Dissekera ryggmärg från ryggraden genom att försiktigt föra in spetsen av en fin, skarp sax mellan ryggmärgen och ryggraden och skär de enskilda ryggraden segment bort, som beskrivs i 21.
- Hemisect hjärnan genom att placera den i en plast mushjärna matris och skärning längs mittlinjen med en matris blad.
- Lägg varje halvklotet och ryggmärgen för att separera 50 ml centrifug badkares med ~ 40 ml hydrogel-lösning (Tabell 1). Från denna punkt framåt täcka rören med aluminiumfolie för att skydda fluoroforerna under alla efterföljande steg.
- Inkubera röret innehållande provet i hydrogelen vid 4 ° C med försiktig skakning (~ 30 rpm) under 7 dagar.
2. polymerisation
- Kassera ~ 25 ml hydrogel, bevara provet och ~ 25 ml av hydrogelen i centrifugröret.
- Deoxygenate provet genom att avlägsna locket och placering av centrifugröret i exsickator burk och anslutning av burken för vakuum. Applicera vakuum under minst 10 min för att medge upplösta gaser att komma ut ur lösning och bildar bubblor. Skaka försiktigt för att få bort bubblorna.
- Ersätta vakuumet i exsickatorn burk med 100% kvävgas över 2-3 min. När trycket utjämnar (en gång toppen av exsickatorn burk kan öppnas), snabbt locket röret för att förhindra återinförandet av syre.
- Polymerize hydrogelen genom att placera röret med provet i en 37 ° C vattenbad i 3 h tills polymerisationen är fullbordad. Polymeriserad hydrogel kommer att få en gel-liknande konsistens (Figur 1b). Obs: En liten mängd opolymeriserad hydrogel upptill är acceptabelt.
- Använd en spatel för att avlägsna den polymeriserade provet från centrifugröret och sedan skära bort överskott av hydrogel från provet.
- Avlägsna kvarvarande hydrogel genom att placera provet på en luddfri torka och försiktigt gnugga och rulla vävnad på det, lämnar efter bara ett tunt lager av polymeriserad hydrogel på provet.
3. Lipid Avlägsnande
Obs: Lipid-rensas vävnad är ömtålig, handtag med omsorg. Använd en cell sil när tömning av röret för att undvika att förlora prov. Dessutom kommer provet att svälla under clearingprocessen, dock svullnad kan vändas under brytningsindex matchningsprocessen.
Varning: Sodium dodecylsulfat (SDS) och borsyra är irriterande. Utföra experiment som använder dem i ett dragskåp och med lämplig personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon).
- Överföra polymeriserade provet till en ren 50 ml centrifugrör och tillsätt 45 ml av clearing-buffert (Tabell 1). Inkubera vid 45 ° C med försiktig skakning (~ 30 rpm). Ändra bufferten dagligen under en initial 7 dagar genom att hälla ut den använda clearing bufferten i kemiskt avfall och lägga ~ 45 ml av färsk clearing buffert. Håll centrifugrör som innehåller proven som omfattas i aluminiumfolie för att skydda fluoroforerna.
- Efter de inledande 7 dagar, inkubera provet vid 40 ° C och utbyte clearing buffert var 2 - 3 dagar. Fortsätt clearing tills alla lipider solubiliseras och vävnad når öppenhet (figur 1c). Detta kommer att vara 4 - 6 veckor för en mus hjärnhalvan och 2 - 4 veckor för en ryggmärg.
- När vävnad rensas, överföraprov till ett nytt 50 ml centrifugrör och tvätta 4 gånger i PBST (tabell 1) vid 40 ° C med försiktig skakning (~ 30 rpm) under 24 h för att avlägsna kvarvarande SDS.
4. Molecular Färgning
Varning: 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) är en irriterande och några experiment som använder den bör utföras i ett dragskåp och med lämplig personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon).
- Överföra provet till en ren 15 ml centrifugrör och fyll med 1 | ig / ml DAPI i 1x PBST, pH 7,5. Inkubera vid rumstemperatur (RT) under 24 h. Håll centrifugrör som innehåller proven som omfattas i aluminiumfolie för att skydda fluoroforerna.
- Tvätta 3 gånger i PBST vid RT under minst 6 h / tvätt.
5. Brytningsindex Matching
Varning: 2,2-tiodietanol (TDE) är en irriterande och några experiment som utnyttjar det shOuld utföras i ett dragskåp och med lämplig personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon).
- Överföra provet till en ren 15 ml centrifugrör och fyll med 30% (volym / volym) TDE i 1x PBS, pH 7,5. Inkubera vid 40 ° C med försiktig skakning (~ 30 rpm) under 24 h.
- Utbyte 30% TDE med 63% (volym / volym) TDE i 1x PBS, pH 7,5. Inkubera vid 40 ° C med försiktig skakning under 24 h.
Obs: Provet krymper tillbaka till ungefär ursprunglig storlek. - På en plan, ren yta rulla en bit av återanvändbar adhesiv till en cylinder med likformig diameter bara är något större än tjockleken av provet.
- Lägg den återanvändbara lim cylinder i ett öppet cirkel (~ 25 mm innerdiameter med en liten öppning upptill) på en 40 mm glas nedre skålen. Om korrigeringar måste göras, ta bort cylindern från glaset och skars med ett rakblad.
- Använda en P1000 pipettspets för att skapa en tätning mellan den återanvändbara bindemedlet och glas genomatt rulla den runt den yttre kanten av cylindern.
- Plats ~ 100 | il 63% TDE på glasskål och spridda runt för att täcka glasytan inom cirkeln av återanvändbara lim.
- Med hjälp av en spatel, försiktigt placera provet i mitten av cirkeln, noga med att inte bilda bubblor.
- Pipett ytterligare 100 pl 63% TDE direkt på provet, sedan omedelbart placera en 40 mm cirkulär täckglaset över den återanvändbara lim.
- Med hjälp av index, mitten och ringfingret av båda händerna, tryck försiktigt runt omkretsen av cirkeln tills täckglaset har tagit kontakt med provet.
- Långsamt upp glaset nedre skålen till ett upprätt läge vilar mot en yta, lägg sedan till 63% TDE med en pipett tills lösningen når den lilla öppningen på toppen. Använd en luddfri duk för att torka bort pipettspetsen så att lösningen inte droppar på glaset. För att undvika bubblor i kammaren, aldrig tömma pipetten hela vägen.
- Tillden lilla öppningen, tillsätt silikonelastomer för att innesluta cirkeln och skapa en sluten kammare. Vänta fem minuter för att torka innan avbildning.
6. Mikroskopi
Varning: lasrar som används i konfokala, enda plan belysning och ljus ark mikroskopi är mycket kraftfulla och kan orsaka blindhet. Alla experiment som utnyttjar lasrar bör utföras efter omfattande utbildning och med stor försiktighet och lämpligt ögonskydd.
- Placera avbildning kammare med provet inuti på scenen av en laserskanning konfokalmikroskop.
- Öppna bildprogram (se tabell of Materials). Att slå på argon excitation laser, klicka på fliken konfigurationen på toppen av programmet sedan på ikonen laser. Markera kryssrutan bredvid argon för att driva lasern och flytta skjut skala till 30%. Observera pekaren långsamt värmas upp till den valda positionen.
- Återgå till fliken förvärva på toppen. I den stora rutan "Strålgång inställningar &# 34; gå till lasten / spara inställningen rutan och välj rullgardinsmenyn för att välja en lämplig våglängd kanal bilden YFP (527 nm).
- Välj lämpliga mål för avbildning genom att placera den röda hyperlänk märkt "mål: aktuellt objekt" under rutan kanalinställningar. Genom att klicka på fliken öppnar alla tillgängliga mål och ett urval kommer automatiskt att rotera revolvern.
- Använd målsättning (t.ex.., 10X) med ett stort arbetsavstånd (större än tjockleken hos den vävnad som skall avbildas, t.ex., 11 mm) och en stor numerisk apertur (eg., 0,3) för att maximera i planet bildupplösning och minimera optisk snittjocklek.
- På den vänstra kolumnen i rullgardinsmenyer, öppna "XY: upplösning" fönstret för att ställa in förvärvs matris, som kallas "format", till 1024 x 1024 eller ett värde lämpligt för den laterala gränsen objektivets upplösning. Ställ in zoomfaktorn så låg som möjligt (t ex., En0,7).
- I samma fönster, ange 8 linjegenomsnitt och en ram genomsnittliga parametrar genom att släppa ner individuellt märkta menyer därefter. Använda stora värden för ett högt signal-till-brusförhållande och små värden för snabb förvärvet.
Obs: 8 linje medelvärden och en ram i genomsnitt kommer att förvärva bilder av en mus hjärnhalvan högkvalitativa i cirka fyra timmar. - Leta provet med hjälp av kontrollerna scen. När ett representativt fält är synligt, ställa in förstärkning och offset.
Obs: förstärkning och offset kommer att variera mycket beroende på typ vävnad, fluoroforer, och / eller anatomiskt kännetecken som avbildas. För YFP, sätta värden 760-780 för förstärkningen och från -1,0 till -1,5 för offset. - Välj "kakel scan" och välj gränserna för området av intresse. Fastställs de övre och nedre gränserna för den z-stack som skall förvärvas. Ställa in tjockleken av den optiska avsnittet grundas på målet optiska avsnitt upplösningsgräns.
Obs: Ett mål äroptisk avsnitt upplösningsgränsen definieras huvudsakligen av numeriska öppning. De flesta mikroskop styrprogram kommer automatiskt att beräkna ett värde lämpligt för det mål som används. För en 10X objektiv med en numerisk bländare på 0,3 som skulle vara ungefär 11 um. - Starta förvärvet.
Obs: Det kan ta flera timmar. - Samla högupplösta bilder med hjälp av högre mål förstoring från specifika områden av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualisera strukturella organisationen av hjärnan är avgörande för att förstå hur morfologi och anslutning påverkar hjärnans funktion vid hälsa och sjukdom. Optiska clearing tekniker gör det möjligt att avbilda cellpopulationer i 3D i intakta vävnader, vilket tillåter oss att studera morfologi och anslutning sammanhållet.
Möss som uttrycker fluorescerande proteiner som drivs av promotorer som är specifika för delpopulationer av celler tillåter en att retas isär komplext mönster av neurala anslutning i hjärnan. Thy1-YFP transgena möss har använts i stor utsträckning i den optiska clearing litteratur eftersom dessa möss uttrycka YFP i en delmängd av projektion nervceller som finns i hjärnbarken och hippocampus, liksom andra strukturer i hjärnan (Figur 2a och b). Dessutom YFP + kortikala skikt V neuroner skjuter genom kortikospinala vägarna i SPinal sladd (Figur 2c d), vilket gör dem mycket användbara vid utvärdering av effekten av axonal förolämpning och / eller skada i ryggmärgen på kortikala neuroner 15. Genom användning av konfokal mikroskopi och optisk sektionering av optiskt klareras vävnader ett lätt kan utvärdera skillnader i neuronal densitet över stora anatomiska strukturer.
Förutom Thy1-YFP transgena möss, kan vilket som helst antal transgena möss skall avbildas. PLP-EGFP transgena möss uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) i mogna oligodendrocyter som uttrycker proteolipidprotein (PLP) i hela hjärnan och ryggmärgen (figur 3a). PV-tdTomato transgena möss uttrycker tdTomato i en delmängd av parvalbumin (PV) som uttrycker interneuronen i lillhjärnan, striatum och hippocampus (figur 3b). Även i möss som inte uttrycker fluorescerande transgener, små molekylvikt fluorescerande färgämnen, såsom DAPI kan lätt diffundera in hydrogel inbäddade vävnader och möjliggöra en utvärdering av cellkärnor i hjärnan (Figur 4).
Figur 1:. Olika stadier av Brain Clearing Fotografera av Thy1-YFP + mushjärna som har avlägsnats från skallen (a). Fotografi av hydrogel-inbäddade thy1-YFP + mus hjärnhalvan (b). Fotografi av Thy1-YFP + mus hjärnhalvan efter lipid borttagning (c). Skala barer är 5 mm i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: thy1-YFP uttryck i hjärnand ryggmärgen. thy1-YFP + nervceller i hjärnbarken och hippocampus avbildas på 5X förstoring och rekonstrueras i 3D (a). En maximal intensitet projektion av en 10X bildstapel av hjärnbarken som visar den dendritiska arborization kortikala skikt V pyramidala nervceller (b). Thy1-YFP uttryck i en intakt livmoderhalscancer och bröstkorg ryggmärgen avbildas på 5X förstoring och rekonstrueras i 3D (c). En maximal intensitet projektion av en 10X bildstapel av ryggmärgen som visar enskilda axoner (d). Skala barer är 1 mm i (a), 100 nm i (b), 2 mm (c), och 100 pm i (d). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: PLP-EGFP och PV-tdTomato Expression i hjärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: DAPI färgning i hjärnan DAPI uttryck i lillhjärnan av en intakt hjärnhalva avbildas på 5X förstoring.. Bilden är ungefär 1 mm från mittsagittalplan. Den infällda bilden visar den detaljnivå som syns på bilddjupet vid 10x förstoring. Skala barer enre 250 um i huvudpanelen och 50 pm i infällda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Kemisk | slutkoncentration |
| perfusionslösning | ||
| 10x fosfatbuffrad saltlösning | 1x | |
| natriumnitrat | 0,5% vikt / volym | |
| Heparin | 10 U / ml | |
| fixeringslösning | ||
| 10x fosfatbuffrad saltlösning | 1x | |
| Paraformaldehyde | 4% volym / volym | |
| hydrogel lösning | ||
| 10x fosfatbuffrad saltlösning | 1x | |
| paraformaldehyd | 4% volym / volym | |
| akrylamid | 4% volym / volym | |
| Bis-akrylamid | 0,05% vol / vol | |
| VA-044 Initiator | 0,25% vikt / volym | |
| clearing-buffert | ||
| Borsyra | 200 mM | |
| Natriumdodecylsulfat | 4% vikt / volym | |
| PBST | ||
| 10x fosfatbuffrad saltlösning | 1x | |
| Triton X-100 | 0,1% vol / vol | |
| natriumazid | 0,1% vikt / vol |
Tabell 1: Förteckning över buffertar och lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Passiv clearing av hydrogel inbäddade vävnader (passiv klarhet) är en enkel och billig metod för att rensa stora bitar av vävnad. Detta tillvägagångssätt kräver inte specifik utrustning och kan enkelt utföras i ett temperaturreglerat skakapparat. Under loppet av några veckor, även stora, mycket myeliniserade vävnader, såsom en hel hjärnan eller ryggmärgen, blir transparent och lämplig för mikroskopi. Även om denna rapport har fokuserat på clearingen av CNS-vävnader, kan passiv CLARITY tillämpas på alla vävnader.
De relativa styrkor och svagheter av optiska clearing tekniker har diskuterats tidigare i litteraturen 13,17,22, men är tydligast anges i 23. Passiv CLARITY är väl lämpad för experiment där ett stort antal prover rensas samtidigt och reproducerbarhet är av stor betydelse. Användningen av en hydrogel för att ge ytterligare stöd till vävnaden underlättar multiple sondering av vävnaden. I denna rapport, en liten molekylvikt färgämne, DAPI, visades, men flera omgångar av antikropps sondering är också möjligt med denna metod.
Tillvägagångssättet beskrivs ovan avviker från vår tidigare publicerade protokoll 15 i ett par betydande sätt. För det första, i den nuvarande metoden, proverna inte intracardially perfusion med hydrogel. Detta berodde på det faktum att hydrogelen i förtid kan polymerisera i slangen och nålar av perfusionsapparaten, vilket leder till ofullständiga perfusioner och inkonsekvent clearing. Inkubering av paraformaldehyd fixerade vävnader i hydrogelen i 7 dagar är i överensstämmelse med den ursprungliga KLARHET protokoll 14, även om en 1 dagars inkubation används för 1 - 3 mm tjocka vävnadssektioner i det passiva KLARHET Technique (PACT) 17. För det andra utför denna metod lipid borttagning på en något högre temperatur som tidigare rapporterats 15-17. högre Temperature accelererar lipid borttagning, men måste vägas mot risken för en katastrofal förlust av vävnad integritet (smältning). Genom ökning av inkubationstemperaturen av 8 ° C (till 45 ° C) i 7 dagar och sedan med 3 ° C (till 40 ° C) för återstoden av lipiden avlägsnandet, är vävnads clearing påskyndas, men utan den samtidiga risken för förlusten av vävnadsintegritet. Denna ökning i temperatur är förenlig med temperaturer som rapporterats under Elektrofore Tissue Clearing (ETC) i den ursprungliga CLARITY-protokollet (50 ° C) 14. Dessutom har ingen minskning i intensiteten av transgent uttryckta fluoroforer eller minskning av DAPI färgning observerats.
Deoxygenering är ett viktigt steg i skapandet av hydrogel. Hydrogelen kan polymerisera i närvaro av syre löst i hydrogelen lösningen, men i våra händer hastigheten och fullständigheten polymerisation var mycket mer variabel utan deoxygenering. Om hydrogel inte polymeriseras, den vanligaste orsaken är närvaron av syre i hydrogelen.
Den optiska clearing process är förvånansvärt lätt att implementera, dock mikroskopi som följer kan vara ganska komplicerat. Av avgörande betydelse är målen som används för att avbilda vävnaden. Arbetsavståndet av en objektiv definierar djupet att det kan bild in i ett vävnadsprov. Ett objektiv med ett arbetsavstånd av 2 mm kan endast bilden 2 mm in i ett prov, därför arbetsavståndet av ett mål måste vara större än tjockleken hos provet i syfte att bilden den helt. På samma sätt, den numeriska bländaröppningen av en objektiv en gräns storleken på funktioner som det kan lösa både i planet och tjockleken av optiska sektioner som det meningsfullt kan förvärva. Selektiv Plane Illumination Mikroskopi (SPIM) och Ljus Sheet Mikroskopi (LSM) kan övervinna begränsningen av optiska snittjocklek av naturen hos belysningen, men dessa microskorkåpor är inte allmänt tillgängliga. Hög numerisk öppning, stora mål arbetsavstånd är sällsynta och dyra, men är nödvändiga för hög bildkvalitet från stora optiskt rensas sektioner.
När bilderna har förvärvats, de är ofta mycket stora, från flera hundra MB för en låg upplösning (både i planet och z-riktningen) bilden till ett fåtal TB för en högupplöst bild samlas in LSM. De datorer som används för bildanalys kräver inte bara en stor lagring, men stora mängder av random access memory (RAM) för bildbehandling. Programvarupaket lämpliga för analys av stora optiskt rensas bildvolymer inkluderar Amira, Imaris, och ImageJ 14-16.
Bland de begränsningar av denna metod kräver passiv CLARITY mer tid att rensa vävnader än andra optiska clearing metoder. Minska volymen av vävnaden som ska raderas genom att klippa det eller snitt den i mindre bitar kan Accelrera lipid-borttagning. Dessutom minskar koncentrationen av paraformaldehyd i hydrogelen i sin tur minskad tvärbindning och öka hydrogel porstorlek, vilket leder till snabbare clearing 17, även om detta kan leda till ökad vävnadsexpansion, kan enskilda praktiker tycker att det är värt att minskningen i clearing tid. Vidare, i kombination med TDE som clearingmedel, kan mängden av den totala vävnadsexpansion vara begränsad.
Även denna rapport beskriver användningen av små molekylvikt färgämnen antikropp sondering är ett mycket naturligt nästa steg. Närvaron av hydrogelen inte bara ger fysiskt stöd till de röjda vävnader, men tjänar också som ett hinder för penetration av antikroppar djupt in i vävnaden. Minskande koncentration akrylamiden eller paraformaldehyd koncentrationen kommer att öka porstorleken i hydrogelen, vilket underlättar (och därmed påskynda) antikropp penetration 17, men detta har en skadlig effekt på tissue expansion. Ändå kan antikropp sondering av block av vävnad ske på några dagar och hela hjärnan i ett par veckor med hjälp av koncentrationer akrylamid och paraformaldehyd som beskrivs i den ursprungliga rapporten 14.
Optiska clearing tekniker tillåter en att titta djupt in i hjärnan, främja förståelse av dess struktur och funktion. Dessa nya verktyg gör det möjligt för forskarna att visualisera hjärnan vid cellulära och molekylära resolutioner, ökar vår förståelse av detta mest komplexa organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete var generöst stöd av National Institutes of Health / National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NIH / NINDS) bidrag 1R01NS086981 och Conrad N. Hilton Foundation. Vi tackar Dr Laurent Bentolila och Dr. Matthew Schibler för deras ovärderliga hjälp med konfokalmikroskopi. Vi tackar de som har bidragit till den KLARHET forum (http://forum.claritytechniques.org). Vi tackar särskilt Dr Karl Deisseroth för att öppna upp hans labb för att lära denna fascinerande teknik. Författarna är tacksamma för det generösa stödet från Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace Foundation, Ahmanson Foundation, Capital Group Companies Foundation Charitable, William M. och Linda R. Dietel donationsfond, och Northstar Fund . Forskning som redovisas i denna publikation har också delvis stöds av National Center for Research Resources och Office of direktören för nationenal Institutes of Health i tilldelningsnummer C06RR012169, C06RR015431 och S10OD011939. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
