Introduction
Метастазы являются основной причиной смерти среди пациентов с злокачественными опухолями. Процесс метастатического распространения раковых клеток мало изучен, но, как представляется, включают в себя несколько этапов, включая вторжение в соседние ткани, intravasation в лимфатическую и сосудистой сети, выживание и транслокации в кровеносной системе, транссудации из сосудов на месте метастаза, адаптации к новому микросреды нового сайта и колонизации на новом месте путем пролиферации и образования вторичных опухолей. 1 Каждый из этих биологических событий включают преобразование, распространение и выживание метастатических опухолевых клеток. Например, превращение эпителиального фенотипа опухолевой клетки в мезенхимальной фенотипа, в сочетании с успешным взаимодействием с внеклеточным матриксом, чтобы они могли вторгнуться соседние ткани и метастазировать в другие части тела. 2,3 Кроме того, эти метастатический ячейкидолжны выжить в циркулирующей крови и избежать иммунного надзора от хозяина. 4,5 И, наконец, при имплантации в отдаленном месте в организме, опухолевые клетки должны адаптироваться к их микросреды, чтобы пролиферируют и образуют вторичные опухоли. 6,7 Поэтому , хотя метастаза является обычным явлением среди больных раком, метастатические опухолевые клетки имеют несколько областей уязвимости, которые поддаются терапевтическому вмешательству.
Учитывая иммуногенной характер меланомой, и недавний интерес к иммунотерапии, модели меланомы становятся все более полезными. 8 Только в Соединенных Штатах, меланома является причиной примерно 9000 смертей в год. 9 Общие места меланомы метастазирования являются кости, головной мозг , печень и легкие. Большинство метастазов в отдаленные участки происходят через кровоток. Циркулирующие опухолевые клетки в крови должны уклоняться от иммунного клиренса, достигают капиллярного слоя дистального органа ивторжению через эндотелиальные клетки кровеносных сосудов , с тем чтобы успешно утвердиться. 4-7,10, 11
Для имитации общих и вирулентных явления метастазирования, была создана мышиная клеточная линия В16-НД6. Умерший родительской линии C57BL / 6 линии клеток меланомы В16-F0, В16-НД6 является конечным продуктом 10 последовательных селекции для метастазов в легких от внутривенных инъекций (в результате B16-F10), а затем 6 последовательных селекции для проникновения мембраны мочевого пузыря. 12 Таким образом , она является надежной линии клеток меланомы для создания метастатических очагов у мышей, особенно при внутривенном введении. 13
После инъекции достаточного количества B16-BL6 клеток в хвостовую вену B57BL / 6 мыши, а затем два или более недель, чтобы позволить имплантацию и рост клеток В16 / BL6, метастатических очагов сформируют в легких. После эвтаназии и инспекции рассечением микроскопии, количествоотдельных очагов присутствует может быть определена количественно. Это, в свою очередь, может быть использован для создания эффекта доза-метастаз, так как количество клеток В16 инжектированных-BL6 коррелирует с числом очагов, сформированной на поверхности легких. Эта модель известна как "экспериментальный метастаз", где известные-метастатической клетки вводятся непосредственно в кровоток, что способствует быстрому и предсказуемое распространение и создание в легких, печени или другого органа расследования. Это в отличие от "спонтанной метастаз" , когда опухолевые клетки имплантируют, часто подкожно, и метастазах происходят из органически пролил раковые клетки. 14,15
Важно, чтобы ввести соответствующее количество клеток В16 / BL6 в хвостовую вену мышей. Слишком много, и легкие будут покрыты с метастазами и соседняя фокусы будут неотличимы друг от друга. Слишком мало, и влияние терапевтического агента будет неразличима из-за присущей различations между инъекциями. Для того, чтобы получить оптимальное число очагов на легкие из 6 мышей C57BL /, необходимо соотнести число инжектированных клеток с количеством установленного метастатических очагов на поверхности легких, принимая во внимание различимость индивидуального фокусы. Этот протокол продемонстрирует метастатической меланомой мышиной модели для мышей C57BL / 6.
Protocol
Заявление по этике: Использование мышей в исследовании допустимо только в тех случаях, когда это возможно, содействующими человеческое понимание фундаментальной биологии или к окончательному лечению заболевания.
1. Заказ
- Покупка женского мышей C57BL / 6 (возраст 6 - 8 недель), 5 мышей на группу. Разрешить несколько дней для мышей, чтобы приспособиться.
2. Приготовление В16-BL6 Cells
- Удалить клеточной культуры пластины от 37 градусов инкубатора и место в стерильном капюшоном. Пластины должны быть примерно 70% сплошности с В16-НД6 мышиных клеток меланомы. Большее слияние может привести к изменению ячеек метастатического потенциала.
- Добавить 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА на чашку, дайте постоять в течение 1 мин, а затем отсасывает раствор трипсин-медиа.
- Добавить 1 мл трипсина на тарелку и вернуть пластины в инкубатор на 10 мин.
- После перемещения пластины из инкубатора в стерильных капот, добавьте 4 мл бессывороточной Rosewell Park Memorial Institute Mediuм (RPMI) на каждой пластине.
- Собрать клетки с стерильный, моторизованной пипеткой. Выброс клетки от нижней части пластины, с наконечником прессуют при очень небольшим углом, чтобы разбить клетки. Повторите несколько раз, чтобы обеспечить адекватное разделение клеточных комочков, которые в противном случае могли бы засоряться иглу эжекции. Вспоминают и переносят в 50 мл коническую трубку.
- С помощью гемоцитометра, чтобы определить плотность клеток. Поддержание постоянной общее число клеток В16-BL6, определить объем свободной от сыворотки среде RPMI, необходимое для достижения конечной концентрации 0, 0,065, 0,015, 0,25 и 0,5 миллиона клеток / мл.
- В равной степени Аликвотировать носителя в 50 мл пробирку с 15 мл конические пробирки. Центрифуга конические пробирки на 2,250 мкг в течение 5 мин. Слейте СМИ. Добавьте соответствующий объем свободной от сыворотки среде RPMI и подтвердить нужную плотность клеток с помощью гемоцитометра. Настройка densities- путем добавления дополнительного RPMI или прядения и ресуспендирования в меньшем Volume- соответственно.
- Алиготе 500 мклкаждой клеточной суспензии в маркированные 1,8 мл пробирки на лед.
3. хвостовую вену для инъекций
- Возьмите мышь, состоявшийся за хвост, и направлять его сзади сначала в фиксатор мыши. С торсом в основной камере, с фиксатор хвоста вне его, тянуть мышь к концу фиксатор. Вставьте фиксатор-поршень, продолжая толкать, пока мышь не является безопасным.
- Поворот мыши на 90 градусов так, что одна из боковой вены хвоста стороной вверх. Использование спиртовым тампоном, энергично очищать сторону хвоста мыши, в частности, когда в хвостовую вену наиболее заметен.
Примечание: Хорошее освещение имеет важное значение для визуализации вены хвоста эффективная на B57BL / 6J. Тепловые лампы или с подогревом хирургии площадки, в то время как нет необходимости, также поможет за счет увеличения объема хвостовой вены. - В стерильной капот культуре, собирают 300 мкл среды для культивирования клеток из 2 миллионов клеток / мл пробирку. Обратить иглу, стряхивая Sязь и нажимая на поршень, чтобы извлечь пузырьки из шприца. Выброс культуры-RPMI привести в конечном объеме 250 мкл.
- Продлить мыши хвост с не доминантной рукой. Держа хвост с проксимального конца хвоста приподнятый указательным пальцем не доминантной рукой, а также дистальной части хвоста депрессии с большого пальца.
Примечание: Таким образом, хвостовую вену проходит в боковом положении, параллельно поверхности удерживающим, с конгруэнтным записи возможно в более дистальной части хвоста. - Вставьте иглу в хвостовую вену, по направлению к дистальному концу, через каждую минуту углом вниз, чтобы начать с, а затем отрегулировать иглу, чтобы она соответствовала углу хвостовой вены при дальнейшем введении (понижая конец плунжера шприца относительно иглы) ,
- Вставьте иглу примерно 1 см в хвостовую вену. После вставки, начинают толкать поршень, держа иглу постоянно.
Примечание: Если игла находится в хвостовую вену, а конец иглы нВЗ препятствия СМИ должны течь беспрепятственно в вену. Эффективная инъекция характеризуется клиренса крови из вены. Если есть сопротивление, или пузырь начинает формироваться на месте в инъекции, удалите иглу и попробуйте еще раз на более проксимальных месте вдоль хвостовой вены. - Удалите иглу из вены и отказаться от него. Держите марлю на месте входа, чтобы остановить кровотечение.
- Извлеките поршень из фиксатор и поместите мышь в клетку реципиента.
- Повторите эти действия для всех других концентраций.
Примечание:. Lung фокусы учреждение занимает приблизительно 2 - 3 недели, с изменчивостью в зависимости от клеточной линии и желаемого размера очагов 9 В промежутке времени, мыши должны быть проверены на наличие симптомов , которые могли бы служить основанием ранней эвтаназию, как Чрезмерная одышка.
4. Подсчет легких фокусов
- Эвтаназии мышь, помещая в CO 2 камеры и обнажая до 100% CO 2
- Splay мышью на пенополистирол. Используя хирургические ножницы, создать хирургический разрез вдоль грудины.
- Делают два дополнительных надрезов, как из верхней части разреза грудины и разветвление к плечам мыши, обнажая грудную клетку.
- Сделайте два разреза, каждый из которых вдоль боковых сторон грудины, чтобы удалить грудную клетку от туловища, подвергая легкие и сердце.
- Держа сердце с хирургическим пинцетом, разрезал пищевод и трахею, освобождая сердце и легкие от мыши. Поместите под рассекает микроскопом при 10-кратным увеличением, для лучшей визуализации.
- Рассеките сердце из легких и удаления тимуса, оставив только два легких.
- С легких под областью рассечения, начинают считать фокусы легких. Каждый фокусы должен появиться как круговое, коричневый пломб на поверхности легких.
- Длясогласованность между мышами, подсчитать количество очагов на поверхности мочки, а затем инвертировать эту лопасть. Выполнение каждой из четырех лепестков по отдельности позволяет легче подсчетом.
- Сохранить и закрепить легкие при выполнении IHC, в противном случае, удалите остатки.
Representative Results
При визуальном осмотре, изменение поверхности очагов очевидна. Подсчет количества опухолей под микроскопом рассекает должен давать линейную зависимость между числом инъецированных клеток опухоли и количества в результате чего и счетным очагов. Используя оптимальное число инъецируемых клеток, цель одна , где легкие не покрыта полностью, так как они находятся на 500000 клеток / мл на фиг.1А, и не слишком редко покрыта, так как они находятся на 62500 клеток / мл и 125000 клеток / мл. Это также количественно с помощью линейной корреляции (Фиг.1В).
Рисунок 1. Lung Очаги Результирующая из хвостовой вены Введенный B16 / НД6 клетки. (A) Lung Очаги могут быть визуализированы на поверхности легких от / 6 мышей C57BL в виде коричневых круговых масс (представительном очагах под стрелками). В качестве притоновность закачиваемой культуры клеток (над каждым изображением) увеличивается, так что делает соответствующее число в результате фокусы легких (ниже каждого изображения). Легкие от мыши с самой высокой плотностью клеток, инъецированных имеет наибольший визуальный охват очагов легких. Масштабные столбики представляют 20 мм. (В) Перечень фокусами легких по отношению к плотности клеточной культуры. Существует приближенно линейная зависимость выше 125000 клеток / мл, как определено гематоцитометре. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Циркулирующие опухолевые клетки от инъекции в хвостовую вену представляют собой метастазы , которые уклоняются участки первичного роста и мигрируют через маршруты , как кровь или лимфатическую систему, иногда утвердиться в капиллярных русел отдаленных местах. 14 Протокол , описанный выше , служит моделью для вторичной метастаз. С помощью оптимального количества клеток B16-BL6 закачиваемой, экспериментаторы могут определить относительный эффект вводимого лекарства или популяции иммунных клеток, после нейтрализации, на раковых клеток метастазов.
Этот протокол имеет свои ограничения. Циркулирующие опухолевые клетки были отобраны за их способность к метастазированию и поэтому неиммуногенными, имеющие более низкие уровни главного комплекса гистосовместимости класса 1 молекул. 12 Кроме того, внезапное и кластерный введение большого количества метастазов в отличие от типичного сценария у больных где небольшое количество метастатических опухолевых клетокрассеиваются в течение длительного периода времени от локализации первичной опухоли. Кроме того, внутривенно вводимые опухолевые клетки из культуры тканей, а не из первичного происхождения опухоли. Таким образом, эти клетки в отличие от вторичных метастазов , которые возникают в результате нарушения клеточной адгезии, миграции, иммунного распознавания и реципиента создании органа. 15,16
Альтернативный протокол является подкожное введение B16 / НД6 для генерации первичных опухолей и анализ полученных «спонтанных» легочных метастазов. было обнаружено, что эти «спонтанные» метастазы содержат больше гетерогенность, чем их «экспериментальных» коллег, более тесно совпали с пациентами человека. Протокол ограничивает ее способность определить влияние экспериментального соединения на метастазирование. С боковой инъекцией в хвостовую вену, количество клеток меланомы инъецируют в кровоток может быть аппроксимирована с помощью чemocytometer. С помощью "спонтанной" метастаз, тем не менее, существует большая гетерогенность опухолей, добавляя дополнительную переменную к числу в результате фокусы легких. 16
В заключение отметим, что B16-НД6 мышиной модели меланомы в хвостовую вену представляет собой простую модель для определения влияния лечения или иммунотерапии на метастаз. При внутривенно вводят циркулирующих опухолевых клеток, исследователи могут реплицироваться, до некоторой степени, у пациентов после метастазирования. Учитывая разрушительные последствия метастатических опухолевых клеток в раковых больных, эта модель является мощным инструментом для понимания многоэтапный процесс метастазирования.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Поддерживается в частично грантом Национального института рака 1R03CA172923.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A.
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A.
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M.
- Elkin, M., Vlodavsky, I.
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
